Установление оптимальных сроков и морфологических параметров привитой опухоли для проведения оценки эффективности противоопухолевого лечения на основе изучения динамики ее естественного роста с выделением спектра возникающих структурных изменений по дням.
Аннотация к работе
В проведенных исследованиях СТ-26 характеризуется как инкапсулированная анапластическая опухоль, состоящая из клеток, варьирующих по размеру и величине ядерно-цитоплазматического соотношения; отмечено высокое содержание митотически делящихся элементов (до 5 в поле зрения), но в то же время отсутствует информация о стромально-паренхиматозных взаимоотношениях и нет данных о процессах, отражающих спонтанный регресс опухоли [4]. Авторы [6] указывают, что кровеносные сосуды, видимые в пределах опухолевого узла в начале роста карциномы, являются собственной сосудистой сетью органа, в который привита опухоль, но нет ясности в вопросе о начале неоангиогенеза в экспериментальных новообразованиях. К их числу относится определение основных закономерностей развития структурных изменений экспериментальной опухоли СТ-26, оценка динамики становления микроциркуляции экспериментальной опухоли в ходе естественного роста и, в итоге, выбор оптимальной модели экспериментальной опухоли для оценки эффективности противоопухолевого лечения. Опухоль была привита 26 мышам, опухолевые узлы сформировались у 20 животных. Опухоль отличалась высокой пролиферативной активностью, на что указывало значительное количество митозов в клетках - от 9 до 11 в поле зрения, патологии деления не отмечалось (рис.Морфологическое и морфометрическое изучение динамики естественного роста привитой опухоли СТ-26 свидетельствует, что развитие карциномы характеризуется двумя параллельно идущими процессами: формированием опухоли как морфологического субстрата и развитием в ней спонтанных регрессивных изменений. Состояние опухолевых клеток и степень развития спонтанных регрессивных изменений зависят от размера опухоли, а также уровня развития и функционирования сосудистой сети.
Введение
На протяжении не одного десятка лет в качестве модели опухолевого роста и как объект изучения эффективности вновь разработанных терапевтических воздействий на опухоль среди многочисленных вариантов используется экспериментальная модель колоректальной аденокарциномы СТ-26. В ходе ее изучения описаны морфологические особенности новообразования, митотическая активность, неоангиогенез. Кроме того, раскрыты некоторые стороны динамики опухолевого роста [1-3].
В проведенных исследованиях СТ-26 характеризуется как инкапсулированная анапластическая опухоль, состоящая из клеток, варьирующих по размеру и величине ядерно-цитоплазматического соотношения; отмечено высокое содержание митотически делящихся элементов (до 5 в поле зрения), но в то же время отсутствует информация о стромально-паренхиматозных взаимоотношениях и нет данных о процессах, отражающих спонтанный регресс опухоли [4]. Характеристика ее сосудистой сети сводится к описанию мозаично расположенных сосудов - капилляров синусоидного типа со средним диаметром, колеблющимся в пределах от 10 до 19 мкм, при этом нет сведений о возможных гемореологических и гемодинамических расстройствах в опухолевом узле [5]. Авторы [6] указывают, что кровеносные сосуды, видимые в пределах опухолевого узла в начале роста карциномы, являются собственной сосудистой сетью органа, в который привита опухоль, но нет ясности в вопросе о начале неоангиогенеза в экспериментальных новообразованиях. Приводятся разные сроки появления сосудов: от 72 ч со дня прививки [7] до 2 нед. [4], однако эта информация основана на использовании разных по локализации моделей СТ-26. морфологический привитая опухоль рост
В ходе разработки инновационных прижизненных методов ранней инструментальной диагностики новообразований перед нами встал круг задач, для решения которых имеющейся литературной информации оказалось недостаточно либо она вообще отсутствует. К их числу относится определение основных закономерностей развития структурных изменений экспериментальной опухоли СТ-26, оценка динамики становления микроциркуляции экспериментальной опухоли в ходе естественного роста и, в итоге, выбор оптимальной модели экспериментальной опухоли для оценки эффективности противоопухолевого лечения.
Цель исследования - установление оптимальных сроков и морфологических параметров привитой опухоли СТ-26 для проведения оценки эффективности противоопухолевого лечения на основе морфологического и морфометрического изучения динамики естественного роста опухоли с выделением спектра возникающих структурных изменений по дням.
Материалы и методы. Закономерности морфологических изменений экспериментальных опухолей в ходе естественного роста оценивались у мышей линии Balb/с c моделью аденокарциномы кишечника мышей СТ-26, привитой на внешней стороне ушной раковины мыши. При работе с животными руководствовались правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных [8] и Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных [9], неукоснительно соблюдали этические принципы, установленные Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Эксперименты на животных в рамках исследования были разрешены Этическим комитетом НИЖГМА.
Прививку опухоли осуществляли внутрикожно в ушную раковину согласно работе [10]. Прививочная доза во всех случаях составляла 200 тыс. клеток. Опухоль была привита 26 мышам, опухолевые узлы сформировались у 20 животных. Через 4 сут после прививки и далее на 8, 11, 17-19, 20-22-е сутки животных выводили из эксперимента путем дислокации шейных позвонков. В каждой группе с различными сроками наблюдения было по 4 животных. Удаленную опухоль измеряли, а затем помещали в 10 % раствор нейтрального формалина для фиксации, где она находилась в течение 24 ч. Из фиксированного материала вырезали кусочки для последующего гистологического исследования. С этой целью проводили заливку их в парафин (использовалась среда Histomix-extra, "БИОВИТРУМ", Россия) с последующей монтировкой парафиновых блоков. На ротационном микротоме Leica 450RM (Leica Microsystems, Германия) с полученных блоков изготавливали срезы толщиной 5-7 мкм. Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону. Гистологические препараты изучали в световом микроскопе Leica DM1000 (Leica Microsystems, Германия), микрофотографии получали спомощью цифровой видеокамеры Leica DFC290 (Leica Microsystems, Германия). Помимо микроскопического описания новообразования выполнены морфометрические исследования количественного состава клеток, площади стромы и паренхимы опухоли, объемной площади сосудистого русла, площади некрозов, гемодинамических расстройств, митотической активности опухолевых клеток, основу которых составили методики точечного счета и полей, предложенные Г.Г. Автандиловым [11].
Результаты и обсуждение
Исследование начиналось с изучения опухоли на 4-й день после прививки. Уже в этот, достаточно ранний, срок мы видели формирование опухоли как субстрата с образованием узла со средним объемом 0,8-1,0 мм 3. Опухоли на раннем сроке развития не располагались вплотную к эпидермису, между опухолевыми клетками и его базальным слоем обнаруживался тонкий слой дермы с полнокровными сосудами. Карцинома имела гистиоидный тип строения и по микроскопической картине относилась к недифференцированному раку с IV степенью злокачественности (G) (рис. 1, а). Стромальный компонент, как и следовало ожидать в гистиоидных опухолях, был скудным и составлял 0,35±0,20 % площади новообразования; 99,6±0,3 % приходилось на долю паренхимы. В глубоких отделах опухоли удавалось обнаружить единичные синусоидного типа полнокровные капилляры диаметром от 7 до 20 мкм, составлявшие 0,15±0,05 % от площади опухолевого узла, и мелкие артериолы, являвшиеся собственными сосудами дермы, которые оказались в пределах карциномы вследствие ее инфильтративного роста (в объеме площади сосудистого компонента опухоли они не учитывались).
Рис. 1. Естественный рост опухоли CT-26, 4-й день развития; окраска гематоксилином и эозином; а - об. ?10; б - об. ?40
Опухоль отличалась высокой пролиферативной активностью, на что указывало значительное количество митозов в клетках - от 9 до 11 в поле зрения, патологии деления не отмечалось (рис. 1, б).
На 8-й день после прививки опухоли достигали объема 7,1-8,4 мм 3. Они вплотную подрастали к эпидермису, но без инвазии в него (рис. 2, а). Структура опухоли оставалась типовой с высокой митотической активностью и синусоидными сосудами до 21 мкм в диаметре, суммарная площадь которых составляла 0,10±0,03 %. В части сосудов отмечалось полнокровие (рис. 2, б).
Рис. 2. Естественный рост опухоли CT-26, 8-й день развития; окраска гематоксилином и эозином; а - об. ?10; б - об. ?40
Наблюдения этой группы показали, что, несмотря на увеличение объема опухоли, содержание сосудистого компонента оставалось неизменным. Это позволяет говорить об отставании ангиогенеза от темпов нарастания опухолевой массы.
На 11-й день после прививки опухоль достигала объема 11,2-12,4 мм 3. В эпидермисе отмечаются фокусы некроза, пропитанные фибрином, лейкоцитами, изъязвления изза инфильтративного роста опухоли. Клетки опухоли значительно варьируют по форме и размеру, в 8,5 % клеток видны необратимые изменения ядер (кариопикноз, кариорексис и кариолизис). Митозов насчитывалось до 10 в поле зрения, б?льшая их часть были патологические. Сосудистый компонент составил 1,5±0,1 % площади новообразования. Все опухолевые сосуды представляли собой капилляры синусоидного типа с диаметром просветов от 7 до 21 мкм, все отличались полнокровием. Помимо этого, в опухоли были видны редкие, мелкие диапедезные кровоизлияния, располагающиеся диффузно, без четкой топографии. Наблюдаемые изменения клеток и гемодинамические расстройства следует отнести к началу спонтанных регрессивных изменений (рис. 3).
Рис. 3. Естественный рост опухоли CT-26, 11-й день развития; окраска гематоксилином и эозином; об. ?10
На 17-19-й день после прививки морфологическая картина уже заметно отличалась от предыдущей. Объем опухолей достигал 16,8-20,3 мм 3. Опухоль прорастала в эпидермис, в ее структуре наблюдались явления спонтанного некроза, располагающегося как поверхностно, так и в глубине узла (рис. 4, а). В пределах новообразования определялись кровеносные сосуды синусного типа до 20 мкм в диаметре с полнокровием, мелкими диапедезными кровоизлияниями, стазом и сладж-феноменом. Обращало на себя внимание низкое содержание сосудистого компонента - 0,6±0,2 %. Очагового разрушения общей анатомической структуры опухоли не возникло (рис. 4, б), при этом в 85 % клеток зафиксированы цитоплазматические повреждения, а в 25 % из них - необратимые повреждения ядер. Пролиферативная активность упала, митозов обнаружено до 5 в поле зрения, причем все они патологические (рис. 4, в). На наш взгляд, низкое содержание сосудистого компонента в опухоли может служить отражением торможения ангиогенеза, возникающего в промежуток времени с 11-го по 17-й день. Этот факт позволяет сделать заключение о реализации клеточно-сосудистых взаимоотношений по принципу обратной связи. В свою очередь большое количество погибающих клеточных элементов в данном случае (85 %) подтверждает отставание ангиогенеза от пролиферативных потенций и вызывает ослабление системы жизнеобеспечения опухолевых клеток.
Рис. 4. Естественный рост опухоли CT-26, 19-й день развития; окраска гематоксилином и эозином; а, б - об. ?4; в - об. ?40
Заключительным этапом исследования послужило изучение опухоли на 20-22-й день после прививки. В первую очередь, новообразования отличались крупными размерами - от 21,8 до 24,5 мм 3 при типичной для СТ-26 структуре. Хорошо были видны мозаично расположенные очаги спонтанного некроза, которые отмечались как у поверхности, так и в глубине и занимали в отдельных случаях до 97 % площади. Вне полей некроза наблюдались опухолевые клетки с ядерными изменениями и коагуляцией цитоплазмы (15 %). Кроме этого были обнаружены беспорядочно расположенные сосуды синусоидного типа и мелкие артериолы диаметром от 10 до 200 мкм, находящиеся в глубинных отделах карциномы. Сосудистый компонент составил 1,5±0,3 % площади опухоли. В кровеносных сосудах отмечалось полнокровие, а в единичных - эритроцитарные тромбы, стаз и диапедез эритроцитов (рис. 5). В то же время можно было видеть небольшие участки опухоли без регрессивных изменений. В них количество митозов достигало 4 в поле зрения.
Рис. 5. Естественный рост опухоли CT-26, 22-й день развития; окраска гематоксилином и эозином; об. ?10
Обнаруженные изменения позволяют сделать заключение о развертывании в опухоли процессов гибели, являющихся проявлением спонтанного патоморфоза. При этом полного регресса опухоли не возникает, а наличие неповрежденных участков с пролиферирующими клетками, высокое содержание сосудистого компонента по сравнению с предыдущими наблюдениями говорят о продолжающемся росте опухоли.
Таким образом, изучение закономерностей морфологических изменений экспериментальных опухолей СТ-26 в ходе естественного роста показало, что увеличение опухоли определяется не только митотической активностью клеток, но и степенью развития сосудистого русла, его способностью в полном объеме выполнять необходимую функциональную нагрузку.
Как следует из представленных результатов, ангиогенез в опухоли происходит не равномерно по нарастающей, а представляет собой волнообразный процесс, в определенной степени обусловленный состоянием опухолевых клеток. Формирование сосудистого русла в виде синусоидных капилляров начинается с 4-го дня прививки и далее в целом развивается в сторону увеличения до 11-го дня. На 17-19-й день после прививки наблюдается снижение доли сосудов в ткани опухоли, что, по всей видимости, свидетельствует о замедлении формирования сосудистой сети, которое гистологически вновь становится заметным к 20-22-му дню с появлением не только синусных капилляров, но и сосудов более крупного калибра (до 200 мкм).
Проявления спонтанного патоморфоза характеризуются появлением клеток с необратимыми повреждениями ядра и цитоплазмы, параллельным снижением их митотической активности и возникновением мозаично расположенных участков спонтанного некроза. Наблюдаемые гемодинамические и гемореологические нарушения - полнокровие (гиперемия), стаз, сладж-феномен, диапедезные кровоизлияния - служат компонентом структурных изменений, также отражающих спонтанный регресс. При этом прослеживается связь между выраженностью спонтанных регрессивных изменений и объемом опухоли в сочетании со степенью развития сосудистого русла.
Отчетливые проявления спонтанного регресса опухоли можно было наблюдать на 11-е сутки после прививки в виде мелких диффузно расположенных диапедезных кровоизлияний и небольшой части клеток опухоли с необратимыми изменениями ядра. Максимальной степени выраженности спонтанный патоморфоз достигал на 20-22-й день, где очаги некроза опухоли составляли до 97 % площади новообразования.
В ходе сопоставления этих данных с показателями ангиогенеза и размерами опухолей установлено, что при небольшом размере опухоли и хорошо развитой сосудистой сети, как это отмечается на 11-й день, спонтанный регресс проявлялся лишь в возникновении необратимых клеточных изменений в небольшом проценте опухолевых клеток, в то же время большого размера опухоли с низким содержанием сосудов, что регистрируется на 17-19-й день, характеризовались ощутимо высоким процентом погибающих клеток (85 %). Опухоли крупных размеров, наблюдаемые в сроки 20-22 дня после прививки, несмотря на более развитую сеть кровеносных сосудов, отличались высоким уровнем спонтанного регресса, что позволяет сделать вывод о неадекватности уровня ангиогенеза потребностям пролиферирующих паренхиматозных элементов.
Не вызывает сомнения, что развивающийся спонтанный патоморфоз может мешать оценке опухолевого ответа на терапию, так как, безусловно, вносит свой вклад в количественные параметры, отражающие гибель структурных элементов новообразования (паренхимы, экстрацеллюлярного матрикса).
Вывод
Морфологическое и морфометрическое изучение динамики естественного роста привитой опухоли СТ-26 свидетельствует, что развитие карциномы характеризуется двумя параллельно идущими процессами: формированием опухоли как морфологического субстрата и развитием в ней спонтанных регрессивных изменений. Состояние опухолевых клеток и степень развития спонтанных регрессивных изменений зависят от размера опухоли, а также уровня развития и функционирования сосудистой сети. Со своей стороны, ангиогенез является процессом, зависимым от состояния опухолевых клеток, увеличение массы которых требует роста кровоснабжения опухоли. Результаты исследования позволяют утверждать, что для оценки эффективности противоопухолевого лечения могут быть использованы опухоли СТ-26, привитые на ухо мышей, со сроком развития не более 11 дней, так как начиная с этого периода времени в опухоли отмечаются отчетливые проявления спонтанного патоморфоза.
Финансирование исследования. Исследования финансировались по программе Правительства РФ по договору №14В 25.31.0015.
Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.
Список литературы
1. Rosenberg D.W., Giardina C., Tanaka T. Mouse models for the study of colon carcinogenesis. Carcinogenesis 2009; 30(2): 183-196, http://dx.doi.org/ 10.1093/carcin/bgn267.
2. Taketo M.M., Edelmann W. Mouse models of colon cancer. Gastroenterology 2009; 136(3): 780-798, http://dx.doi.org/10.1053/j.gastro.2008.12.049.
3. Tanaka Y., Eda H., Tanaka T., Udagawa T., Ishikawa T., Horii I., Ishitsuka H., Kataoka T., Taguchi T. Experimental cancer cachexia induced by transplantable colon 26 adenocarcinoma in mice. Cancer Res 1990; 50(8): 2290-2295.
4. Aulino P., Berardi E., Cardillo V.M., Rizzuto E., Perniconi B., Ramina C., Padula F., Spugnini E.P., Baldi A., Faiola F., Adamo S., Coletti D. Molecular, cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC Cancer 2010; 10: 363, http://dx.doi.org/ 10.1186/1471-2407-10-363.
5. Chang Y.S., di Tomaso E., MCDONALD D.M., Jones R., Jain R.K., Munn L.L. Mosaic blood vessels in tumors: frequency of cancer cells in contact with flowing blood. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97(26): 14608-14613, http://dx.doi.org/ 10.1073/pnas.97.26.14608.
6. Kruskal J.B. Can optical imaging assist in characterization of the onset of angiogenesis in developing hepatic metastases in mice livers? Radiology 2007; 243(2): 307-308, http://dx.doi.org/10.1148/radiol.2432061988.
7. Knighton D., Ausprunk D., Tapper D., Folkman J. Avascular and vascular phases of tumour growth in the chick embryo. Br J Cancer 1977; 35(3): 347-356, http://dx.doi.org/10.1038/bjc.1977.49.
8. Приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 №708н "Об утверждении Правил лабораторной практики в Российской Федерации".
9. Международные рекомендации (этический кодекс) по проведению медико-биологических исследований с использованием животных. 1985.
10. Song H. -W., Lee S. -W., Jung M. -H., Kim K.R., Yang S., Park J.W., Jeong M. -S., Jung M.Y., Kim S. Optical monitoring of tumors in BALB/c nude mice using optical coherence tomography. Journal of the Optical Society of Korea 2013; 17(1): 91-66, http://dx.doi.org/10.3807/josk.2013.17.1.091.
11. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. М: Медицина; 1990.