Особенности строения опухолевого узла, сопряженные с лимфогенным и гематогенным метастазированием при инфильтрирующем протоковом раке молочной железы. Варианты лимфогенного метастазирования, ассоциированные с генерализацией опухолевого процесса.
Аннотация к работе
Несмотря на то, что около 80% всех гистологических форм рака молочной железы составляет инфильтрирующий протоковый рак, практика свидетельствует о том, что, эта форма опухоли характеризуется значительным клиническим разнообразием и выраженной морфологической гетерогенностью. Определить фенотипические особенности строения первичного опухолевого узла, сопряженные с лимфогенным и гематогенным метастазированием при инфильтрирующем протоковом раке молочной железы. Исследовать экспрессию показателей пролиферативной активности, апоптоза, белков межклеточной адгезии в клетках, формирующих разные структуры инфильтративного компонента первичного опухолевого узла при инфильтрирующем протоковом раке молочной железы. Провести анализ состава и выраженности воспалительной инфильтрации стромы в микроокружении разных структур инфильтративного компонента первичного опухолевого узла при инфильтрирующем протоковом раке молочной железы. Изучить особенности строения первичного опухолевого узла, лимфогенного и гематогенного метастазирования у больных инфильтрирующим протоковым раком молочной железы в зависимости от состояния менструальной функции.
Список литературы
По теме диссертации опубликовано 48 печатных работ, отражающих основные положения диссертации, из них 9 журнальных статей, 8 из которых в рекомендованных ВАК изданиях, 39 тезисных работ в материалах региональных, всероссийских и международных съездов и конференций. Имеется 2 патента РФ на изобретение.
Внедрение результатов исследования
Выявленные морфологические критерии прогноза лимфогенного и гематогенного метастазирования при инфильтрирующем протоковом раке молочной железы внедрены для практического применения в отделении патологической анатомии и цитологии НИИ онкологии СО РАМН и для преподавания раздела «Эпителиальные злокачественные опухоли» на кафедре патологической анатомии ГОУ ВПО СИБГМУ Росздрава.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 312 страницах машинописного текста, включает введение, обзор литературы, главу о материалах и методах исследования, 3 главы результатов собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации. Работа иллюстрирована 115 таблицами и 31 рисунком. Список литературы содержит 526 источников, из них 167 отечественных и 359 зарубежных авторов.
2. Материалы и методы исследования
В исследование были включены 389 больных инфильтрирующим протоковым раком молочной железы T1-4N0-3M0 с уницентрической формой роста в возрасте от 35 до 80 лет, находящихся на лечении в отделении общей онкологии НИИ онкологии СО РАМН с 1999 по 2007 г. У 157 (40,4%) пациенток менструальная функция была сохранена, у 232 (59,6%) регистрировалось состояние менопаузы.
297 пациенткам в плане предоперационного лечения проводилось 2-4 курса химиотерапии по схеме CMF (5-фторурацил 600 мг/м2 в/в 1,8 дни, метотрексат по 40 мг/м2 в/в 1,8 дни, циклофосфан по 100 мг/м2 в/м с 1 по 14 дни) или CAF (адриамицин 30 мг/м2 в/в, 1,8 дни, 5-фторурацил 500 мг/м2 в/в 1,8 дни, циклофосфан по 100 мг/м2 в/м с 1 по 14 дни).
92 больные неоадъювантной химиотерапии не получали. Хирургическое вмешательство выполнялось через 7 - 14 дней после окончания неоадъювантной химиотерапии. 276 (71%) больным была проведена радикальная мастоэктомия, 113 (29%) - радикальная резекция молочной железы с аксиллярной лимфаденэктомией. В послеоперационном периоде 162 больным проводилась адъювантная химиотерапия по стандартной схеме CMF с интервалом 2,5 месяца до 4-6 курсов в течение 1,5-2 лет. 124 больным в постменопаузе назначалась антиэстрогенная терапия тамоксифеном.
105 больным в послеоперационном периоде назначалась дистанционная гамма-терапия на зоны регионарного лимфооттока в стандартном режиме. 122 больные послеоперационного лечения не получали.
Сроки наблюдения за больными составили 5 лет. Анализировались первичные документы - истории болезни и амбулаторные карты больных.
Морфологическому исследованию подвергался операционный материал. Забор материала проводился в течение первого часа после выполнения радикальной мастэктомии или радикальной резекции молочной железы. Взятые образцы тканей помещались в нейтральный формалин. Материал проводился по стандартной методике и заливался в парафин. Срезы толщиной 5-6 мкм окрашивались гематоксилином и эозином. Морфологическое исследование проводилось с помощью светового микроскопа фирмы «Карл Цейс Йена» «Jenamed». Оценивалась ткань первичных опухолевых узлов и все аксиллярные лимфатические узлы. Для исключения возможности мультицентрического роста при гистологическом исследовании изучалась ткань молочной железы из четырех квадрантов (при радикальной мастэктомии) и ткань молочной железы на отдалении от опухоли (при радикальной резекции молочной железы).
Диагноз рака молочной железы устанавливался согласно «Гистологической классификации опухолей молочной железы» (ВОЗ, Женева, 2003).
При исследовании инфильтративного компонента рака молочной железы выделяли тубулярные, трабекулярные, микроальвеолярные, солидные структуры, группы клеток, указывалось количество структур в инфильтративном компоненте в каждом случае. Представительство микроальвеолярных структур в инфильтративном компоненте определялось по трехбалльной системе, где 1 баллом обозначались случаи с наличием микроальвеолярных структур до 10%, 2 баллами - >10% - 75%.
Степень злокачественности оценивали по модифицированной схеме P. Scarff, H. Bloom и W. Richardson. При этом учитывали количество тубулярных и протоковых структур, число митозов и клеточный полиморфизм.
Воспалительную инфильтрацию в строме первичного опухолевого узла оценивали полуколичественным методом по трехбалльной системе (1балл - слабо выраженная, 2 балла - умеренно выраженная, 3 балла - резко выраженная).
Выраженность стромы характеризовали по процентному соотношению паренхиматозного и волокнистого компонента, где: 1 баллом обозначали слабую выраженность стромы (паренхимы ? 70%), 2 баллами - умеренную выраженность стромы (паренхимы 10%), 3 баллами обозначали случаи с резко выраженной стромой (паренхимы < 10%).
Гиалиноз в строме оценивали по трехбалльной системе (1балл - слабо выраженный, 2 балла - умеренно выраженный, 3 балла - резко выраженный).
Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартной методике. Срезы депарафинировали в 3 порциях спирта (96°), затем промывали 5 мин. в дистиллированной воде, помещали стекла со срезами в пластиковый держатель и погружали в 0,01М цитратный буфер РН=6,0, после чего осуществляли демаскировку антигенов в микроволновой печи. Демаскировку проводили в два этапа: первые 7 мин. при мощности Р=60, затем 1 мин. остывания при открытой дверце, далее 7 мин. при мощности Р=40 (выходная мощность микроволновой печи 700 Вт). После демаскировки оставляли емкость со стеклами остывать при комнатной температуре на 20 мин и промывали в двух порциях фосфатного буфера по 5 мин., наносили блокирующий реагент (Peroxidase Blocking Reagent, фирма «Dako») на 10 мин., после промывали в дистиллированной воде 5 мин., затем в фосфатном буфере - 5 мин. Далее наносили первые антитела и инкубировали срезы при температуре 25ЄС 60 мин. После инкубации срезы промывали в фосфатном буфере и наносили биотинилированые антитела на 10 мин., затем промывали в фосфатном буфере и наносили на срезы стрептавидин-биотиновый комплекс на 10 мин., промывали в буфере и наносили раствор ДАБ (раствор диаминобензидина). С ДАБ инкубировали 10 мин. Использовали систему визуализации фирмы «Dako» LSAB2 System - HRP. Срезы докрашивали гематоксилином и заключали в бальзам.
При исследовании применяли антитела фирмы «Dako» к рецепторам эстрогена (клон 1D5, RTU, мышиные), к рецепторам прогестерона (клон PGR636, RTU, мышиные), к онкопротеину c - ERBB - 2 (рабочее разведение 1:500, кроличьи), к Ki67 (клон MIB-1, RTU, мышиные), к CD 3 (клон UCHT1, рабочее разведение 1:100), CD8 (клон C8/144B, рабочее разведение 1:100), CD20 (клон L26, рабочее разведение 1:300), фирмы «Novocastra» к р53 (клон CM1, рабочее разведение 1:150), к bcl2 (клон bcl2/100/D5, рабочее разведение 1:80), к Е - кадхерину (клон 36B5, рабочее разведение 1:30), к TGF? (клон TGF?17, рабочее разведение 1:40), к TDG?R1 (клон 8А11, рабочее разведение 1:50), к CD4 (клон 1F6, рабочее разведение 1:60), к CD 25 (клон 4C9, рабочее разведение 1:150), CD68 (клон 514H12, рабочее разведение 1:80), CD117 (клон T595, рабочее разведение 1:80), к CD 138 (клон 5F7, рабочее разведение 1:100), фирмы «Biogenex» к CD45 LCA (клон PD7/26/16&2B1, RTU, мышиные), фирмы «Diagnostic Biosistem» к ?-катенину (поликлональные, рабочее разведение 1:50).
Экспрессию рецепторов к онкопротеину c - ERBB - 2, к р53, к Ki67, к bcl2, к TGF?, к TGF?R, Е - кадхерину, ?-катенину, к CD 25 оценивали в процентом содержании положительно окрашенных клеток в каждом варианте структур паренхиматозного компонента первичной опухоли. Экспрессию рецепторов к bcl2, к TG?F, к TGF?R, к CD 45 LCA, к CD 3, к CD 4 к CD 8, к CD 68, к CD 117, к CD 138, к CD 20, к CD 25 в клетках воспалительного инфильтрата оценивали полуколичественно (0 баллов- отсутствие; 1 балл - 1-5 клеток; 2 балла - 6-20 клеток; 3 балла - более 20 клеток) вблизи каждого варианта структур паренхиматозного компонента опухоли (не далее чем на 1-2 диаметра малого лимфоцита) и в строме новообразования в отдалении от паренхиматозных структур.
Экспрессию рецепторов к половым гормонам оценивали по 3-х балльной шкале (слабая, средняя и выраженная степени). Для оценки выраженности экспрессии рецепторов к эстрогену и прогестерону определяли процент клеток, имеющих рецепторы, и «показатель экспрессии» (ПЭ) Последний представляет собой сумму произведений степени экспрессии, умноженную на процент соответствующих клеток, и подсчитывается по следующей формуле: ПЭ = 3 Ч A 2 Ч B 1 Ч C, где
А - процент интенсивно окрашенных ядер;
В - процент умеренно окрашенных ядер;
С - процент слабо позитивных ядер. (Петров С.В., 2000).
Проводилось исследование морфофункционального состояния всех аксиллярных лимфатических узлов (исследовалось от 5 до 28 лимфоузлов).
С целью общей полуколичественной оценки морфофункционального состояния лимфатических узлов на срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, определялась выраженность тимус-независимых зон (коркового плато и мозговой зоны) и тимус-зависимой паракортикальной зоны.
В корковом плато оценивалось наличие фолликулов со светлыми центрами. В паракортикальной зоне - выраженность посткапиллярных венул (по трехбалльной системе: 1 балл - мало; 2 балла - умеренно; 3 балла - много), в мозговой зоне выраженность гистиоцитоза, лимфоцитоза, фиброза синусов, липоматоза (по трехбалльной системе: 1 балл - слабо выражен; 2 балла - умеренно выражен; 3 балла - резко выражен).
Также по трехбалльной системе оценивалась воспалительная инфильтрация в капсуле лимфоузлов. Измерялся размер каждого лимфатического узла.
Морфология лимфоузлов с метастазами изучалась у 131 больной уницентрическим инфильтрирующим протоковым раком молочной железы.
При гистологическом исследовании пораженных метастазами лимфоузлов определялся такой параметр, как степень замещения ткани лимфоузла метастазом. Было выделено четыре степени замещения: до 10%, от 10 до 50%, от 50 до 75% и тотальное замещение (более чем на 75%).
В метастатических лимфоузлах характеризовалось морфологическое строение метастазов и наличие экстракапсуллярной инвазии. При морфологическом исследовании опухолевой ткани в метастазах определялось наличие микроальвеолярных, трабекулярных, тубулярных, солидных структур, дискретных групп клеток, подсчитывалось общее количество структур в каждом случае. Определялась выраженность стромы, гиалиноза и воспалительной инфильтрации в метастазе по алгоритму, использованному для оценки данных параметров в первичном опухолевом узле.
У больных с наличием пораженных метастазами лимфоузлов с замещением до 10% и от 10 до 50% в зависимости от наличия или отсутствия светлых центров в пораженных и не пораженных лимфоузлах в каждом случае, было выделено четыре группы. Первую группу составили больные, у которых в пораженных и неизмененных лимфоузлах присутствовали светлые центры (СЦМ СЦ ). Во вторую группу вошли пациентки, у которых ни в пораженных, ни в не пораженных лимфоузлах светлых центров не определялось (СЦМ-СЦ-). Третью группу составили больные, у которых в пораженных метастазами лимфоузлах светлых центров не было, а в не пораженных они присутствовали. Четвертая группа состояла из пациенток, у которых в пораженных лимфоузлах светлые центры присутствовали, а в не пораженных лимфоузлах их не наблюдалось (СЦМ СЦ-).
При наличии лимфоузлов с метастазами, замещенных на 50-75% или на 100%, в зависимости от наличия или отсутствия светлых центров в не пораженных лимфоузлах были выделены три группы. Первую составили пациентки, у которых все не пораженные метастазами лимфоузлы имели светлые центры (СЦ ). Во вторую группу вошли больные, у которых во всех лимфоузлах светлых центров не было (СЦ-). В третью - вошли пациентки, у которых в части лимфоузлов светлых центров не было, в части они присутствовали (СЦ СЦ-).
У пациенток без лимфогенных метастазов, в зависимости от присутствия светлых центров в лимфоузлах, было сформировано три группы. В первую вошли больные, у которых все лимфоузлы имели светлые центры (СЦ ). Во вторую - пациентки, у которых во всех лимфоузлах светлых центров не было (СЦ-). В третью - больные, у которых в части лимфоузлов светлых центров не было, в части они присутствовали (СЦ СЦ-).
Обработка полученных данных выполнялась с использованием пакета программ «Statistica 6.0 for Windows». Применялся дисперсионный, корреляционный анализ по Спирмену, критерий х2, метод логистической регрессии, показатель выживаемости по Каплан-Мейеру. Обсуждаются результаты с достоверностью различий при р < 0,05 и с тенденцией различий при р < 0,1.
Результаты исследований и их обсуждение
Характеристика первичного опухолевого узла
Проводилось изучение особенностей морфологического строения первичного опухолевого узла. Было обнаружено, что у больных в менопаузе при увеличении размеров опухоли нарастало число типов структур в инфильтративном компоненте, то есть имел место так называемый «фенотипический дрейф». При наличии одного типа структур в инфильтративном компоненте размер первичного опухолевого узла составлял 2,7±1,3 см, двух - 3,2±1,9 см, трех - 2,8±1,2 см, четырех - 3,9±2,3 см (F=4,1; р=0,007). У пациенток с сохраненной менструальной функцией подобного рода закономерности не выявлялось. При наличии одного типа структур в инфильтративном компоненте размер первичного опухолевого узла составлял 3,2±1,3 см, двух 2,7±1,6 см, трех 3,1±1,8 см, четырех 3,3±1,7 см (F=1,0; р=0,38) (рис. 1).
Отмечены различия рецепторного статуса опухоли у больных с разным состоянием менструальной функции. Положительный рецепторный статус чаще выявлялся у пациенток с сохраненной менструальной функцией, в сравнении с больными в менопаузе (соответственно: 63,2% и 37,2%; р = 0,03). При этом у больных с сохраненной менструальной функцией в случаях с положительным рецепторным статусом опухоли определялись новообразования меньшего размера, в сравнении со случаями с отрицательным рецепторным статусом (соответственно: 1,7±0,7 и 4,2±3,2; F = 4,0; р = 0,03).
Рис. 1. Зависимость размера первичной опухоли от количества структур в инфильтративном компоненте
Не зависимо от состояния менструальной функции, увеличение размера первичной опухоли оказалось связанным со снижением экспрессии ?-катенина в трабекулярных структурах (r = -0,51; р = 0,03) и группах клеток (r = -0,55; р = 0,002).
Обнаружена прямая корреляция между процентом клеток, экспрессирующих рецепторы к эстрогенам и показателем экспрессии bcl2 в микроальвеолярных (r = 0,52; р = 0,01), трабекулярных (r = 0,67; р = 0,003), солидных структурах (r = 0,48; р = 0,02) и в группах клеток (r = 0,59; р = 0,001). Аналогичная зависимость отмечена между процентом клеток, экспрессирующих рецепторы к эстрогенам и общим показателем экспрессии ?-катенина (r = 0,45; р = 0,01), показателями экспрессии ?-катенина в микроальвеолярных структурах (r = 0,54; р = 0,01) и в группах клеток (r = 0,56; р = 0,002).
Определение экспрессионных характеристик опухолевых клеток, строящих разные варианты структур инфильтративного компонента, и состава воспалительного инфильтрата вблизи них, позволило обнаружить значительную гетерогенность свойств клеток этих структур. Она проявилась не только уровнем экспрессии в клетках изучаемых маркеров, но и различной степенью взаимосвязи между опухолевыми клетками и клетками воспалительного инфильтрата. Так, наиболее дифференцированные тубулярные структуры характеризовались высокой экспрессией ?-катенина (90,9±12,6%), bcl2 (75,2±34,7%), низкой пролиферативной активностью (2,1±2,0%) (табл. 1) и минимальным числом корреляционных связей с клетками воспалительного инфильтрата стромы опухоли (рис. 2).
В тоже время, наименее дифференцированные структуры - группы клеток, характеризовались низкой экспрессией ?-катенина (53,2%±32,0%), максимальной пролиферативной активностью (11,4%±11,1%) (табл. 1) и наибольшим числом корреляционных связей с клетками воспалительного инфильтрата стромы опухоли (рис. 3).
Таблица 1. Экспрессия показателей пролиферативной активности, апоптоза, межклеточной адгезии, TGF? и рецептора к TGF? в инфильтративном компоненте первичного опухолевого узла
Показатель (%, M.±S.D.)Локализация в структурах инфильтративного компонента
123456
микроальвеолярные (n=24)трабекулярные (n=19)тубулярные (n=11)солидные (n=22)группы клеток (n=27)общий показатель (n=38)
Рис. 2. Характеристика экспрессионных маркеров клеток тубулярных структур инфильтративного компонента и корреляционные связи с элементами воспалительного инфильтрата стромы новообразования.
Рис. 3. Характеристика экспрессионных маркеров дискретно расположенных групп опухолевых клеток инфильтративного компонента и корреляционные связи с элементами воспалительного инфильтрата стромы новообразования
Таким образом, у больных в менопаузе обнаружены явления «фенотипического дрейфа» инфильтративного компонента первичного опухолевого узла, проявляющегося в нарастании гистологического разнообразия структур инфильтративного компонента по мере увеличения размера новообразования. В группе пациенток с сохраненной менструальной функцией чаще выявлялся положительный рецепторный статус, при котором определялись опухоли меньшего размера. Не зависимо от состояния менструальной функции, увеличение размера первичной опухоли было связано со снижением экспрессии ?-катенина в трабекулярных структурах и группах клеток. Процент опухолевых клеток, экспрессирующих рецепторы к эстрогену, оказался напрямую связан с экспрессией ?-катенина в микроальвеолярных структурах и группах клеток и экспрессией bcl2 в опухолевых клетках всех вариантов структур инфильтративного компонента, кроме тубулярных. Опухолевые элементы различных типов структур инфильтративного компонента отличались экспрессионными параметрами и характером связи с элементами перитуморального воспалительного инфильтрата.
Зависимость лимфогенного метастазирования от параметров первичного опухолевого узла
Изучались наличие и выраженность лимфогенного метастазирования в зависимости от параметров первичного опухолевого узла. Лимфогенные метастазы выявлялись чаще при наличии в инфильтративном компоненте первичной опухоли большего разнообразия структур. Эта закономерность была ярко выражена у больных в менопаузе и проявлялась только на уровне тенденции у больных с сохраненной менструальной функцией. У больных в менопаузе при одном типе структур в инфильтративном компоненте частота лимфогенного метастазирования составляла - 24%; двух - 42%; трех - 65%; четырех - 75% (?2=27,3; р=0,000005). У пациенток с сохраненной менструальной функцией - при одном типе структур в инфильтративном компоненте частота лимфогенного метастазирования составляла - 39%; двух - 28%; трех - 55%; четырех - 44% (?2=6,9; р=0,07) (рис. 4).
У пациенток с раком молочной железы, находящихся в состоянии менопаузы, метастатическое поражение регионарных лимфоузлов обнаруживалось при наличии в инфильтративном компоненте микроальвеолярных структур в 71% случаев, а при отсутствии таковых в 25% наблюдений (?2=43,8; р=0,000000). В группе пациенток с сохраненной менструальной функцией в случаях наличия микроальвеолярных структур лимфогенные метастазы присутствовали в 47% случаев, а при их отсутствии в 32% (?2=3,5; р=0,06). У больных раком молочной железы, находящихся в состоянии менопаузы, обнаруженная закономерность имела и количественную выраженность: частота лимфогенного метастазирования возрастала при увеличении количества микроальвеолярных структур в инфильтративном компоненте. В случаях, когда представительство микроальвеолярных структур превышало 75% от всех остальных, метастазы в регионарных лимфатических узлах выявлялись в 89% наблюдений (?2=51,7; р=0,000000) (рис. 5).
Рис. 4. Зависимость лимфогенного метастазирования от количества структур в инфильтративном компоненте первичной опухоли
Рис. 5. Зависимость лимфогенного метастазирования от количества микроальвеолярных структур в инфильтративном компоненте первичной опухоли
Следует подчеркнуть, что при наличии в первичной опухоли микроальвеолярных структур чаще (в 94% случаев) одновременно выявлялись метастатические лимфоузлы со всеми степенями замещения опухолевой тканью (р=0,02). Такой вариант сочетания пораженных лимфоузлов с разными степенями замещения является наиболее неблагоприятным и свидетельствует о длительно существующем и непрерывно рецидивирующем лимфогенном метастазировании.
В случаях развития лимфогенных метастазов в опухолевых клетках отмечен ряд особенностей экспрессии изучаемых маркеров. В клетках тубулярных структур определялось снижение экспрессии ? - катенина (при наличии лимфогенных метастазов 83,3±14,4%, при отсутствии 100,0±0,0%; F=5,7; р=0,06), в то время как в клетках всех остальных структур регистрировалась противоположная картина и при наличии метастатического поражения лимфоузлов отмечалась более высокая экспрессия указанного маркера (соответственно: в микроальвеолярных 83,3±20,4%; в трабекулярных 87,5±13,6%; в солидных 75,0±20,4%; в группах клеток 68,7±29,1%) в сравнении со случаями, когда лимфогенных метастазов не было (соответственно: в микроальвеолярных 50,4±32,0%; F=5,1; р=0,03; в трабекулярных 42,1±46,7%; F=5,2; р=0,04; в солидных 30,8±30,5%; F=7,1; р=0,01; в группах клеток 35,0±31,6%; F=5,4; р=0,03) (рис. 6).
Рис. 6. Зависимость лимфогенного метастазирования от выраженности экспрессии ? - катенина в первичной опухоли
У больных раком молочной железы с метастатическим поражением лимфоузлов в клетках, образующих трабекулярные структуры, определялась более выраженная экспрессия рецептора к TGF? по сравнению с наблюдениями, когда лимфогенных метастазов не было (соответственно: 25,8±19,6% и 4,0±5,4%; F = 5,7; р = 0,04).
При наличии лимфогенных метастазов отмечалось снижение плотности инфильтрации стромы первичной опухоли CD20 В-лимфоцитами, располагающимися вблизи трабекулярных структур (F=7,9; р=0,01), групп опухолевых клеток (F=5,8; р=0,02) и на отдалении от опухолевых структур (F=4,7; р=0,04) (рис. 7), а также снижение плотности инфильтрации стромы первичной опухоли CD68 макрофагами, располагающимися вблизи трабекулярных структур (F=6,6; р=0,02), групп опухолевых клеток (F=3,1; р=0,09) и на отдалении от опухолевых структур (F=7,3; р=0,01) (рис. 8).
Важно подчеркнуть, что полученные результаты еще раз подтверждают гетерогенность биологических свойств опухолевых клеток, образующих разные структуры инфильтративного компонента, поскольку вышеописанные особенности экспрессии ?-катенина и рецептора к TGF?, а также характеристики воспалительного инфильтрата были связаны с одними структурами инфильтративного компонента и отсутствовали в отношении других.
При сопоставлении морфологических особенностей строения первичной опухоли и лимфогенных метастазов, было отмечено, что в большинстве наблюдений гистологическое строение лимфогенных метастазов соответствовало морфологическому фенотипу первичной опухоли.
При наличии в инфильтративном компоненте первичной опухоли солидных структур чаще (в 79%) выявлялись лимфатические узлы с тотальным замещением метастазами (р=0,0009).
Независимо от НАХТ в группе больных с сохраненной менструальной функцией количество пораженных метастазами лимфоузлов не было связано с HER2/neu статусом (F=1,1; р = 0,31). В то же время у пациенток в менопаузе при положительном HER2/neu статусе выявлялось тенденция к вовлечению в метастазирование большего числа пораженных метастазами лимфоузлов, в сравнении со случаями с отрицательным HER2/neu статусом (соответственно: 8,0±7,9 и 4,8±4,9; F=3,4; р = 0,07).
Таким образом, у больных инфильтрирующим протоковым раком молочной железы, находящихся в состоянии менопаузы, частота лимфогенного метастазирования возрастает по мере увеличения количества разных типов структур, выявляемых в инфильтративном компоненте первичной опухоли, при наличии и большом числе в нем микроальвеолярных структур. Не зависимо от состояния менструальной функции при наличии лимфогеных метастазов определяется снижение плотности инфильтрации стромы первичной опухоли CD20 В-лимфоцитами, располагающимися вблизи трабекулярных структур, групп опухолевых клеток и на отдалении от опухолевых структур, а также снижение плотности инфильтрации стромы первичной опухоли CD68 макрофагами, располагающимися вблизи трабекулярных структур, групп опухолевых клеток и на отдалении от опухолевых структур.
Особенности морфологического строения лимфогенных метастазов
По мере увеличения степени замещения опухолью ткани лимфоузлов, отражающей длительность во времени процесса метастазирования, как и в первичном опухолевом узле, нарастало фенотипическое разнообразие строения метастазов, то есть прослеживался своеобразный «фенотипический дрейф». При наличии замещения до 10% в метастазе среднее число структур в метастазе составляло 1,8 ± 0,9; замещения от 10 до 50% - 2,7±0,9; замещения от 50 до 75% - 3,2±1,0; замещения более чем на 75% - 2,9±1,0 (рис. 9).
Наибольшее число пораженных метастазами лимфатических узлов определялось при одновременном сочетании четырех степеней замещения метастазами ткани лимфоузлов (14,2±9,9), по сравнению с наличием одной (2,3±2,3), двух (4,6±3,1) и трех степеней (4,2±1,3) (F = 31,1 р = 0,000000) (рис. 10).
Рис. 9. Взаимосвязь выраженности разнообразия морфологических структур в лимфогенных метастазах и степени замещения лимфоузлов опухолью
Рис. 10. Зависимость общего числа лимфоузлов с метастазами от количества разных степеней замещения
Связь иммуноморфологического статуса лимфатических узлов с параметрами первичного опухолевого узла и лимфогенным метастазированием
У больных без лимфогенных метастазов при наличии светлых центров во всех лимфоузлах размер первичной опухоли был наибольшим (3,7±1,6 см), по сравнению со случаями, когда светлые центры выявлялись в части лимфоузлов (2,9±1,6 см; р=0,05) или отсутствовали вообще (2,6±1,3 см; р=0,007) (рис. 11).
Рис. 11. Взаимосвязь размера первичной опухоли и иммуноморфологического статуса лимфоузлов при отсутствии лимфогенных метастазов
У пациенток с лимфогенными метастазами наименьший размер первичной опухоли наблюдался при отсутствии светлых центров во всех лимфоузлах (1,9±1,1 см), в сравнении со случаями, когда светлые центры выявлялись во всех лимфоузлах (3,6±2,1 см; р=0,01), только в не пораженных (3,0±1,7 см; р=0,03) и только в пораженных лимфоузлах (3,4±1,1 см; р=0,001) (рис. 12).
Лимфогенные метастазы редко (4%) выявлялись при наличии светлых центров во всех лимфоузлах (рис. 13).
Рис. 12. Взаимосвязь размера первичной опухоли и иммуноморфологического статуса лимфоузлов при наличии лимфогенных метастазов
Рис. 13. Зависимость лимфогенного метастазирования от иммуноморфологического статуса лимфоузлов
При этом только у больных, находящихся в состоянии менопаузы, при отсутствии светлых центров во всех лимфоузлах обнаруживалось большее число лимфоузлов с метастазами (6,1±6,0), по сравнению со случаями с наличием светлых центров (2,1±1,7) (р=0,01) (рис. 14).
Рис. 14. Зависимость количества лимфоузлов с метастазами от иммуноморфологического статуса лимфоузлов у больных, находящихся в состоянии менопаузы
Таким образом, величина первичной опухоли оказалась связанной с морфологическим статусом региональных лимфатических узлов. У больных без лимфогенных метастазов в корковом плато лимфатических узлов чаще обнаруживаются лимфоидные фолликулы со светлыми центрами. У пациенток в менопаузе при отсутствии в корковом плато как пораженных, так и не пораженных метастазами лимфоузлов фолликулов со светлыми центрами в метастазирование вовлекается большее число лимфоузлов.
Математическая модель прогнозирования лимфогенного метастазирования у больных, находящихся в состоянии менопаузы
Основываясь на полученных результатах, построена математическая модель прогнозирования лимфогенного метастазирования у больных, находящихся в состоянии менопаузы. В качестве независимых признаков в модель вошли: общее число разных типов структур, количество микроальвеолярных и наличие трабекулярных структур в инфильтративном компоненте ИПР. При расчете использовался количественный показатель - размер первичного опухолевого узла (в сантиметрах). Модель имела высокую степень достоверности (x2 = 75,0; р = 0,000000). Чувствительность составила 74%, специфичность 88,3%. Уравнение регрессии имело следующее выражение: Y = (-5,03 1,2X1 - 0,52X2 1,8Х3), где Y - значение уравнения регрессии;
(-5,03) - значение коэффициента регрессии свободного члена;
X1 - наличие в инфильтративном компоненте трабекулярных структур (1 балл - отсутствие трабекулярных структур, 2 балла - наличие трабекулярных структур; (1,2)- значение коэффициента регрессии этого признака; X2 - количество структур в инфильтративном компоненте (1, 2, 3 или 4 структуры), (-0,52) - значение коэффициента регрессии этого признака;
X3 - количество микроальвеолярных структур в инфильтративном компоненте (1 балл - микроальвеолярных структур 10% - 75%; (1,8) - значение коэффициента регрессии этого признака;
Значение вероятности развития лимфогенных метастазов определялось по формуле: Р = ЕУ/(1 е<Y),>
где Р (значение вероятности развития признака), Y - значение уравнения регрессии;
е - математическая константа, равная 2,72.
Зависимость гематогенного метастазирования от параметров первичного опухолевого узла
В подтверждение известных данных, как у больных с сохраненной менструальной функцией, так и у пациенток в менопаузе диссеминация процесса выявлялась у больных раком молочной железы с большими размерами первичной опухоли (соответственно: 3,5±1,6 см и 4,0±2,4 см). При отсутствии гематогенных метастазов размер новообразования составил соответственно: 2,9±1,6 см (F=3,9; р=0,04) и 2,9±1,4 см (F=16,5; р=0,00006) (рис. 15).
Рис. 15. Зависимость гематогенного метастазирования от размера первичной опухоли
Изучение экспрессионных характеристик опухолевых клеток показало, что при наличии гематогенных метастазов при раке молочной железы чаще наблюдается снижение уровня экспрессии bcl2 клетками трабекулярных (0,0±0,0%) и тубулярных (41,5±32,7%) структур. При отсутствии прогрессирования заболевания эти показатели составили 53,6±46,0% (F=6,5; р=0,02) и 97,7±3,1% (F=18,4; р=0,002) соответственно. Следует особенно подчеркнуть, что связь экспрессии описанных маркеров с гематогенным метастазированием была характерна только для клеток некоторых структур инфильтративного компонента (рис. 16, 17).
Рис. 16. Зависимость гематогенного метастазирования от выраженности экспрессии ?-катенина в опухоли
Рис. 17. Зависимость гематогенного метастазирования от выраженности экспрессии bcl2 в опухоли
С гематогенным метастазированием оказался связан и характер воспалительной инфильтрации стромы первичной опухоли. При наличии гематогенных метастазов наблюдалось снижение плотности инфильтрации стромы первичной опухоли CD8 Т-лимфоцитами вблизи групп опухолевых клеток (1,9±0,9), в сравнении со случаями, когда гематогенной диссеминации не наблюдалось (2,9±0,9; F=6,7; р=0,01) (рис. 18).
Таким образом, частота гематогенного метастазирования увеличивалась при больших размерах первичного опухолевого узла. При наличии отдаленных метастазов отмечалось повышение экспрессии ?-катенина клетками солидных структур, снижение экспрессии bcl2 клетками солидных, трабекулярных и тубулярных структур и уменьшение инфильтрации CD8 Т-лимфоцитами вблизи дискретно расположенных групп опухолевых клеток.
Зависимость гематогенного метастазирования от параметров лимфогенного метастазирования
У больных, находящихся в состоянии менопаузы, гематогенные метастазы выявлялись чаще при наличии большого числа (7,0±7,1) пораженных метастазами лимфоузлов (F=12,9; р=0,0004). У пациенток с сохраненной менструальной функцией подобная связь отсутствовала (F=0,6; р=0,42) (рис. 19).
Рис. 19. Зависимость гематогенного метастазирования от количества лимфоузлов с метастазами и состояния менструальной функции
Только у больных, находящихся в состоянии менопаузы, гематогенные метастазы обнаруживались чаще (в 84% случаев) при наличии (р = 0,003) и большом количестве (5,6±4,6) тотально пораженных метастазами лимфоузлов (F =13,2; р = 0,0006) (рис. 20), а также при большом числе разных типов замещения метастазами лимфоузлов (р=0,0008) (рис. 21).
Рис. 20. Зависимость гематогенного метастазирования от наличия тотально замещенных метастазами лимфоузлов у больных, находящихся в состоянии менопаузы
Рис. 21. Зависимость гематогенного метастазирования от количества типов замещения метастазами лимфоузлов у больных, находящихся в состоянии менопаузы
Кроме того, выявлена связь гематогенного метастазирования с иммуноморфологическим статусом лимфоузлов. Прогрессирование заболевания наблюдалось реже (5%) при наличии светлых центров во всех лимфоузлах, по сравнению с пациентками, у которых присутствие вторичных лимфоидных фолликулов определяется только в не измененных (32%) (р=0,01) или в пораженных метастазами лимфоузлах (36%) (р=0,01) (рис. 22).
Таким образом, у больных, находящихся в состоянии менопаузы, гематогенное метастазирование развивалось чаще при наличии большого количества пораженных метастазами лимфоузлов, наличии и большом количестве тотально замещенных метастазами лимфоузлов, наличии лимфогенных метастазов с сочетанием разных степеней замещения лимфоидной ткани опухолью. Независимо от состояния менструальной функции, у больных с лимфогенными метастазами вероятность гематогенного метастазирования была ниже при наличии в корковом плато пораженных и не пораженных метастазами лимфоузлов вторичных фолликулов со светлыми центрами.
Рис. 22. Зависимость гематогенного метастазирования от иммуноморфологического статуса лимфоузлов
Математическая модель прогнозирования гематогенного метастазирования у больных, находящихся в состоянии менопаузы
На основе полученных результатов построена математическая модель прогнозирования гематогенного метастазирования у больных в менопаузе. В качестве независимого признака в модель вошло количество пораженных метастазами лимфоузлов. При расчете использовался количественный показатель - размер первичного опухолевого узла (в сантиметрах). Модель имела высокую степень достоверности (x2 = 32,3; р = 0,00000). Чувствительность составила 96%, специфичность 70%. Уравнение регрессии имело следующее выражение: Y = (-4,96 2,1X), где Y - значение уравнения регрессии;
(-4,96) - значение коэффициента регрессии свободного члена;
X - количество лимфоузлов с метастазами (1балл - до 3 лимфоузлов, 2 балла - 4-9 лимфоузлов, 3 балла - 10 и более лимфоузлов); (2,1) - значение коэффициента регрессии этого признака.
Значение вероятности развития лимфогенных метастазов определялось по формуле: Р = ЕУ/(1 ЕУ), где Р (Значение вероятности развития признака), Y - значение уравнения регрессии;
е - математическая константа, равная 2,72.
Таким образом, результаты исследования позволили обнаружить новые морфо-клинические параметры, отражающие закономерности развития трех видов прогрессии рака молочной железы: роста первичного опухолевого узла, лимфогенного и гематогенного метастазирования. Обнаружены существенные различия их проявлений в зависимости от состояния менструальной функции. Главным отличием течения рака молочной железы у больных в менопаузе является связь лимфогенного метастазирования с морфологией первичного опухолевого узла, а гематогенного метастазирования с выраженностью лимфогенного.
Выводы
1. Величина опухолевого узла связана с его гистологическим строением и состоянием менструальной функции. У больных в менопаузе по мере увеличения размера первичного опухолевого узла наблюдается «фенотипический дрейф», проявляющийся возрастанием гистологического разнообразия инфильтративного компонента. Независимо от состояния менструальной функции, увеличение размера первичной опухоли связано со снижением экспрессии ?-катенина в трабекулярных структурах (r = -0,51; р = 0,03) и группах клеток (r = -0,55; р = 0,002).
2. Различные типы структур инфильтративного компонента отличаются экспрессионными параметрами и характером связи с элементами перитуморального воспалительного инфильтрата. Опу