Взаємодія кальцій-регулюючих структур в первинних сенсорних нейронах в нормі та при різних патологічних станах - Диссертация

Виходячи з вищесказаного, аналіз взаємної участі внутрішньоклітинних кальцієвих депо в кальцієвому гомеостазі і зміни в їхньому функціонуванні при діабетичних нейропатіях і запаленні представляє безсумнівний науковий інтерес, а також і велике практичне значення. Виявити взаємну участь мітохондрій та ендоплазматичного ретикулуму великих та малих нейронів заднєкорінцевих гангліїв (первинних сенсорних нейронів) ссавців у внутрішньоклітинній кальцієвій сигналізації, а також у визначенні змін кальційрегулюючої активності даних органел за умов запалення та діабетичної нейропатії. Визначити зміни у функціонуванні мітохондріального кальцієвого уніпортера і Na /Ca2 обмінника в даних нейронах при розвитку стрептозотоцин-індукованого діабету. Визначити зміни у функціонуванні мітохондріального кальцієвого уніпортера і Na /Ca2 обмінника в нейронах заднєкорінцевих гангліїв тварин із запаленням. кальцій внутрішньоклітинний нейрон Експерименти, що визначають участь внутрішньоклітинних кальцієвих депо - мітохондрій і ендоплазматичного ретикулуму в регуляції внутрішньоклітинного кальцію в первинних сенсорних нейронах ссавців, їхня взаємодія, а також зміни кальційрегулюючої активності даних органел при стрептозотоцин-індукованому діабеті і запаленні проводилися автором особисто.Деполяризація тривалістю більш 3 секунд як у нейронах великого, так і малого діаметра викликала значне транзиєнтне підвищення [Ca2 ]і, яке мало характерну форму, що не змінювалася від експерименту до експерименту. Викликаний деполяризацією кальцієвий транзиєнт мав складну кінетику: протягом перших 3 секунд концентрація кальцію швидко наростала від базового рівня до величини 702 ± 62 НМ (n=19) у великих нейронах і 526 ± 81 НМ (n=15) у малих (рис. У великих нейронах на фоні СССР величина часу половинного спаду t0,5 склала 18 ± 3 сек (n=14) у порівнянні з 5 ± 1 сек (n=15) у контролі, а в малих її значення дорівнювало 19 ± 4 сек (n=14) на фоні СССР у порівнянні з 6 ± 1 сек (n=19) у контролі (P<0,001). Парні експерименти на ЗКГ нейронах показали зменшення амплітуди деполяризаційних Са2 транзиєнтів від 1075,6±63,3 НМ до 696,1±64,5 НМ у великих нейронах (n=14, Р <0,05) і від 400,3±79,4 НМ до 288,6±54,3 НМ у малих нейронах (n=7, Р <0,05). На фоні ТРР відносна амплітуда СССР-індукованого кальцієвого викиду вірогідно зменшувалася від 235 ± 42 % (n=12) до 62 ± 19 % (n=10, Р <0,005) у великих ЗКГ нейронах і від 134 ± 22 % (n=8) до 53 ± 12 % (n=15, Р <0,005) у малих ЗКГ нейронах.У нейронах як великого, так і малого діаметра контрольних і діабетичних тварин не виявлено достовірних змін у базальному рівні [Ca2 ]i, в амплітуді деполяризаційних транзиєнтів, а також у швидкості наростання Ca2 сигналу. У нейронах малого діаметра виявлене зменшення здатності мітохондрій акумулювати кальцій, а також показане, що уповільнення виводу кальцію з цитозолю зберігається при заблокованих мітохондріях. При порівнянні кальцієвих транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в даних нейронах у контролі і при карадженин-індукованому запаленні, не виявлено достовірних відмінностей у базальному рівні [Ca2 ]i, в амплітуді деполяризаційних транзиєнтів, у швидкості наростання Ca2 сигналу, а також у кінетиці спаду [Ca2 ]i. Отримані результати показують провідну роль взаємодії між кальційрегулюючими структурами (мітохондріями й ендоплазматичним ретикулумом) у внутрішньоклітинній сигналізації в первинних сенсорних нейронах, порушення якого є однією з причин змін передачі сенсорних сигналів при запальному болючому синдромі і діабетичній нейропатії. 4. E.Kostyuk, N.Svichar, V.Shishkin and P.Kostyuk (1999) Role of mitochondrial dysfunction in calcium signalling alterations in dorsal root ganglion neurons of mice with experimentally-induced diabetes // Neuroscience, 90 (2), 535-541.

Кальцієві сигнали, викликані деполяризацією нейрона. Деполяризація нейронів викликалася позаклітинним додатком гіперкалієвого розчину, що містив 50 ММ KCL. Деполяризація тривалістю більш 3 секунд як у нейронах великого, так і малого діаметра викликала значне транзиєнтне підвищення [Ca2 ]і, яке мало характерну форму, що не змінювалася від експерименту до експерименту. Викликаний деполяризацією кальцієвий транзиєнт мав складну кінетику: протягом перших 3 секунд концентрація кальцію швидко наростала від базового рівня до величини 702 ± 62 НМ (n=19) у великих нейронах і 526 ± 81 НМ (n=15) у малих (рис. 1А,Б). Після досягнення даної величини, концентрація цитозольного Са2 далі не збільшувалася і починався спад кальцієвого транзиєнта. Цей спад мав складну багатофазну кінетику. У першій фазі концентрація цитозольного Ca2 протягом перших 1-3 секунд швидко зменшувалася. Потім швидкість спаду сильно знижувалася і рівень [Ca2 ]і залишався досить високим протягом хвилини і більше. Найчастіше ця повільна фаза мала вигляд "плато" (рис. 1А,Б). Через 1-2 хвилини рівень [Ca2 ]i повертався до базового. Збільшення часу деполяризації не впливало на амплітуду сигналу та форму його спаду. Більш того, не змінювався рівень виникнення плато, змінювалася лише його тривалість.

Кальцієві сигнали, викликані активацією ендоплазматичного ретикулуму. Ріанодинове депо ендоплазматичного ретикулуму великих ЗКГ нейронів активувалося додатком кофеїну. Позаклітинний додаток 20 ММ кофеїну викликав транзиєнтне підвищення [Ca2 ]i. Амплітуда кальцієвої відповіді складала в середньому 420 ± 51 НМ (n=16) (рис. 1В). Після деполяризації, середня амплітуда кальцієвої відповіді на кофеїн складала 1008 ± 96 НМ (n=19). Це явище звязане з тим, що при викликаній деполяризацією відповіді значна кількість Са2 закачується в ендоплазматичний ретикулум. Форма кофеїн-індукованого кальцієвого транзиєнту істотно відрізнялася від такої у випадку деполяризації, що видно на рис. 1В. Спад у випадку кофеїнової відповіді був монофазним і було відсутнє характерне плато.

Зміна кінетики кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією, при блокуванні мітохондріального уніпортера. Для дослідження впливу мітохондрій на кальцієву сигналізацію використовувалася позаклітинна аплікація розєднувача протонного градієнта на мембрані мітохондрій - СССР. Додаток СССР на клітину викликав лише невелике підвищення [Ca2 ]і, яке сягало 47 ± 9 НМ (n=13) у великих і 48 ± 10 НМ (n=13) у малих нейронах. Якщо на фоні додатка 10 МКМ СССР деполяризувати клітину, то це приводило до значного підвищення [Ca2 ]і. Як видно на рис. 2 амплітуда даного підвищення значно перевищувала амплітуду кальцієвого транзиєнта у відповідь на контрольну деполяризацію (без СССР) і досягала величини, рівної 1065 ± 105 НМ (n=14) у малих і 1460 ± 181 НМ (n=14) у великих ЗКГ нейронах. Збільшення було достовірним із P<0,005 у малих і з P<0,00001 у великих ЗКГ нейронах. На спаді зникало плато, і спад приймав монофазну форму (рис. 2). Виявлялося також помітне уповільнення початкової "швидкої" фази. У великих нейронах на фоні СССР величина часу половинного спаду t0,5 склала 18 ± 3 сек (n=14) у порівнянні з 5 ± 1 сек (n=15) у контролі, а в малих її значення дорівнювало 19 ± 4 сек (n=14) на фоні СССР у порівнянні з 6 ± 1 сек (n=19) у контролі (P<0,001).

Якщо СССР прикладався через 3 секунди після припинення аплікації KCL, то це приводило до генерації додаткового підвищення [Ca2 ]i (рис. 3) з амплітудами 235 ± 42 % (n=12) від амплітуди вихідного кальцієвого сигналу у великих і 134 ± 22 % (n=8) у малих ЗКГ нейронах. Чим пізніше додавався СССР після піка кальцієвого транзиєнта, тим менше була амплітуда СССР-індукованого кальцієвого викиду. Коли [Ca2 ]i поверталася до базального рівня, додаток СССР викликав лише незначне підвищення концентрації цитозольного кальцію.

Зміна кінетики кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією, при блокуванні Na /Ca2 обмінника мітохондрій. Для дослідження механізмів звільнення Са2 із мітохондрій і їхнього впливу на кальцієву сигналізацію ми застосували блокатор Na /Ca2 обмінника тетрафенілфосфоніум ТРР .

Додаток ТРР саме по собі не змінював базального рівня [Ca2 ]і, отже в спокої робота Na /Ca2 обмінника мітохондрій не робить помітного впливу на Са2 гомеостаз. Деполяризація нейронів на фоні додатка ТРР у концентрації 25 МКМ приводила до транзиєнтного підвищення [Ca2 ]і значно меншої амплітуди, ніж у відсутності ТРР . Парні експерименти на ЗКГ нейронах показали зменшення амплітуди деполяризаційних Са2 транзиєнтів від 1075,6±63,3 НМ до 696,1±64,5 НМ у великих нейронах (n=14, Р < 0,05) і від 400,3±79,4 НМ до 288,6±54,3 НМ у малих нейронах (n=7, Р < 0,05).

Більш істотні зміни спостерігалися в кінетиці спаду [Ca2 ]і транзиєнта, викликаного деполяризацією на фоні ТРР . Застосування ТРР не приводило до достовірних змін початкової фази спаду [Ca2 ]і транзиєнта. Однак на фоні ТРР величина залишкового рівня [Ca2 ]і, нормована до одиниці, вірогідно зменшувалася як у великих (від 1,0 ± 0,2 до 0,18 ± 0,08, n=14, P < 0,001), так і в малих ЗКГ нейронах (від 1,0 ± 0.36 у контролі до 0,08 ± 0,04 у присутності ТРР , n=7, P<0,05). Для прямого дослідження ефекту блокування виведення Са2 із мітохондрій за допомогою Na /Ca2 обмінника була проведена серія експериментів за участю СССР. Описаний вище викид кальцію при додатку СССР на спаді деполяризаційного кальцієвого транзиєнта був значно знижений при преаплікації 25 МКМ ТРР . На фоні ТРР відносна амплітуда СССР-індукованого кальцієвого викиду вірогідно зменшувалася від 235 ± 42 % (n=12) до 62 ± 19 % (n=10, Р < 0,005) у великих ЗКГ нейронах і від 134 ± 22 % (n=8) до 53 ± 12 % (n=15, Р < 0,005) у малих ЗКГ нейронах.

Зміна кінетики кофеїн-індукованих кальцієвих сигналів при блокуванні мітохондріального уніпортера. Викид Са2 з ендоплазматичного ретикулуму в цитозоль викликався шляхом активації ріанодинових рецепторів великих ЗКГ нейронів. Як видно на рис. 5, амплітуда відповіді на 20 ММ кофеїну в контролі не відрізнялася від такої на фоні 10 МКМ СССР (1112 ± 170 НМ, n=10 у контролі і 948 ± 129 НМ, n=10 на фоні СССР). При цьому спостерігалося істотне уповільнення спаду [Ca2 ]i. Час половинного спаду t0,5 збільшилося від 1,8 ± 0,2 сек (n=10) у контролі до 4,6 ± 0,7 сек (n=10) на фоні СССР (P < 0,05).

Додаток 10 МКМ СССР на спаді кофеїн-індукованої кальцієвої відповіді викликав додаткове підвищення [Ca2 ]і, аналогічне тому, що спостерігалося на спаді деполяризаційного транзиєнта. СССР-індукована відповідь зберігалася і при використанні позаклітинного розчину, що не містив Са2 . Амплітуда СССР-індукованого підвищення [Ca2 ]і в даному випадку була істотно нижче, ніж у випадку деполяризаційного транзиєнта (93 ± 7 %, n=7 у порівнянні з 235 ± 42 %, n=12, Р < 0,05).

Зміни кальцієвої сигналізації в ЗКГ нейронах за умов стрептозотоцин-індукованого діабету. Порівняння кальцієвих сигналів, викликаних короткочасною (3 сек) деполяризацією ЗКГ нейронів великого і малого діаметрів за умов діабету, показало відсутність достовірних відмінностей їхніх основних характеристик, а саме: базального рівня [Ca2 ]i, амплітуди й швидкості наростання кальцієвого транзиєнта, часу напівспаду (t0,5), а також рівня залишкового кальцію в цитозолі через 60 сек після закінчення деполяризації (R60).

При збільшенні тривалості деполяризації до 5 секунд, виявилося достовірне підвищення рівня залишкового кальцію на спаді [Ca2 ]i транзиєнту в ЗКГ нейронах малого діаметра. Величина R60 у нейронах діабетичних тварин склала 15 ± 3 % (n=9), тоді як у нейронах контрольних тварин його значення було 10 ± 1 % (n=37, Р < 0,05). У великих ЗКГ нейронах не було виявлено ніяких змін навіть при збільшенні тривалості деполяризації.

Зміни, звязані за участю мітохондрій у кальцієвій сигналізації при діабеті. Для виявлення можливих змін у Са2 регуляції, яка здійснюється мітохондріями в ЗКГ нейронах діабетичних тварин, ми застосували розглянутий вище метод із використанням блокатора мітохондріального кальцієвого захоплення - СССР.

На фоні 10 МКМ СССР у малих ЗКГ нейронах зберігався підвищений рівень залишкового кальцію на 60 сек спаду [Ca2 ]i. При діабеті величина R60 склала 33 ± 14 % (n=5) у порівнянні з 10 ± 3 % (n=15) (Р < 0,05) у контролі. У великих ЗКГ нейронах рівень R60 залишався без змін.

При порівнянні кальцієвих відповідей на деполяризацію в контрольних умовах і на фоні 10 МКМ СССР, ми знайшли, що в малих ЗКГ нейронах при діабеті зникає достовірна відмінність в амплітудах даних [Ca2 ]i транзиєнтів (рис. 7). У нормі амплітуда кальцієвої відповіді на фоні СССР збільшувалася від 702 ± 62 НМ (n=19) до 1065 ± 105 НМ (n=14) (P<0,05); при діабеті відповідні амплітуди дорівнювали 799 ± 100 НМ (n=7) у контролі і 938 ± 142 НМ на фоні СССР. У великих ЗКГ нейронах дані амплітуди вірогідно відрізнялися як у контролі так і при діабеті (Р < 0,05).

У випадку, якщо СССР додавався на спаді кальцієвого транзиєнта, то за умов діабету, так само як і в нормі, відбувався додатковий викид Са2 , який був запасений мітохондріями під час підвищеної концентрації [Ca2 ]і. І у великих і в малих ЗКГ нейронах ми знайшли значне пригноблення цього викиду при діабеті (рис. 8). Так, у великих ЗКГ нейронах амплітуда СССР-індукованого викиду зменшилася від 235 ± 42 % (n=12) до 62 ± 20% (n=10) (P<0,005), а в малих ЗКГ нейронах її значення в нормі становило 134 ± 22% (n=8), а при діабеті знизилося до 68 ± 12% (n=6) (Р < 0,05).

Зміни кальцієвої сигналізації в ЗКГ нейронах за умов карадженинового запалення. Порівняння кальцієвих сигналів, викликаних деполяризацією ЗКГ нейронів великого і малого діаметрів у нормі й при запаленні, показало відсутність достовірних відмінностей їхніх основних характеристик: базального рівня [Ca2 ]i, амплітуди й швидкості наростання кальцієвого транзиєнта, часу напівспаду (t0,5), а також рівня залишкового кальцію в цитозолі на 60 сек спаду деполяризаційного транзиєнта (R60).

Для більш глибокого дослідження можливих змін у впливі внутрішньоклітинних кальцієвих депо ЗКГ нейронів на кальцієву сигналізацію при запаленні ми застосували ті ж експериментальні процедури, що використовували при діабеті.

Зміни, звязані за участю мітохондрій у кальцієвій сигналізації при запаленні. Для визначення того, як змінюється ефективність функціонування мітохондрій при запаленні, ми порівняли амплітуди деполяризаційних [Ca2 ]і транзиєнтів у контрольних умовах і на фоні 10 МКМ СССР. При цьому для всіх типів клітин не спостерігалося змін у співвідношенні амплітуд даних Са2 відповідей при запаленні в порівнянні з нормою. Однак аплікація 10 МКМ СССР на спаді кальцієвого транзиєнта при запаленні викликала Са2 викид набагато меншої амплітуди, ніж у контрольних експериментах (рис. 9). Для великих ЗКГ нейронів амплітуда СССР-індукованого кальцієвого викиду при запаленні склала 38 ± 9 % (n=21) у порівнянні з контрольними 71 ± 10 % (n=25), P < 0,05; для малих ЗКГ нейронів відповідно 49 ± 6 % (n=35) при запаленні в порівнянні з 84 ± 15 % (n=22) у контролі, P < 0,05.

Усі перераховані вище експерименти на ЗКГ нейронах мишей за умов карадженинової моделі запалення були повторені на нейронах, узятих із мишей, яким робилася контрольна інєкція 0,9 % розчину NACL того ж обєму, але без карадженину. Усі без винятку результати в обох типах клітин співпали з тими, котрі були отримані на нейронах здорових тварин.

Обговорення результатів досліджень

Дослідження останніх років довели активну участь мітохондрій у регуляції внутрішньоклітинного кальцію в різних типах клітин у фізіологічних умовах (Toescu et al. 1992; Duchen 1990; Budd & Nicholls 1996). У роботі (Friel & Tsien 1994) була показана роль мітохондрій в уповільненні деполяризаційних [Ca2 ]i транзиєнтів у симпатичних нейронах жаби. Аналогічні дослідження були проведені на ЗКГ нейронах мишей. Однак у цих роботах не досліджувалася участь мітохондрій у регуляції цитозольного рівня Са2 при його викиді з ендоплазматичного ретикулуму, тобто не був досліджений взаємний вплив цих двох органел.

У даній роботі ми проводили дослідження внутрішньоклітинної кальцієвої сигналізації в первинних сенсорних нейронах (ЗКГ нейронах) місячних щурів. Докладний аналіз показав, що досить тривала деполяризація клітини (більш 3 сек) приводила до генерації [Ca2 ]i транзиєнта, що мав характерні кінетичні особливості: швидкий ріст до певної величини і наступний спад складної форми. Спад складався зі швидкої й повільної фази, яка мала вигляд плато. Ми показали, що подібні [Ca2 ]i транзиєнти виникають і у випадку викиду кальцію з ендоплазматичного ретикулуму при активації ріанодинових рецепторів 20 ММ кофеїну. Однак форма даних сигналів відрізняється від деполяризаційних транзиєнтів. При тій ж самій амплітуді кальцієвої відповіді, на спаді [Ca2 ]i було відсутнє плато. Описана форма кальцієвого сигналу, викликаного деполяризацією знайдена в багатьох типах клітин (Friel & Tsien 1994; Wang & Thayer 1996). Форма кофеїн-індукованої відповіді в ЗКГ нейронах збігається загалом із такою у нейронах заднього рогу спинного мозку (Kostyuk et al. 2001). Однак у симпатичних нейронах жаби на спаді кофеїн-індукованої кальцієвої відповіді також спостерігалося плато (Friel & Tsien 1992).

Для дослідження ролі мітохондрій у регуляції кальцієвого сигналу, викликаного деполяризацією, ми використовували блокатор мітохондріального кальцієвого захоплення СССР. На фоні 10 МКМ СССР ми деполяризували клітину і порівнювали з контролем амплітуди [Ca2 ]i транзиєнтів і характер зниження рівня кальцію в цитозолі. Для доказу активної участі мітохондрій у формуванні кінетики спаду [Ca2 ]i після деполяризації, ми прикладали СССР після піка [Ca2 ]i транзиєнта. Дані експерименти потім повторили на фоні блокатора Na /Ca2 -обмінника ТРР .

Підсумовування всіх отриманих результатів дозволило сформулювати участь мітохондрій у генерації кальцієвого сигналу, викликаного деполяризацією в ЗКГ нейронах щурів у вигляді наступної схеми: 1) під час росту [Ca2 ]i мітохондрії активно поглинають кальцій з цитозолю; 2) після припинення [Ca2 ]i росту мітохондрії продовжують акумулювати кальцій, що приводить до швидкого падіння його концентрації в цитозолі до “безпечних” для клітини значень порядку 200-500 НМ; 3) при подальшому зниженні [Ca2 ]i співвідношення сил змінюється - процес виводу кальцію через Na /Ca2 -обмінник починає переважати над процесом кальцієвого захоплення і мітохондрії поступово звільняються від накопиченого кальцію, підтримуючи при цьому якийсь час його концентрацію в цитозолі на підвищеному рівні (плато); 4) до моменту повернення [Ca2 ]i до базового рівня мітохондрії практично спустошені і уся система знову готова до генерації Са2 сигнали.

Блокування мітохондріального кальцієвого захоплення за допомогою СССР у випадку кофеїн-індукованих кальцієвих транзиєнтів виявило трохи інший характер участі мітохондрій у даному процесі. Ми показали, що мітохондрії захоплюють значно менше Са2 у випадку кофеїн-індукованих відповідей, у порівнянні з деполяризаційними [Ca2 ]і сигналами, при цьому їхня дія запізнюється за часом. Це може бути звязане з тим, що в цитозолі великих ЗКГ нейронів мітохондрії і кальцієве депо ендоплазматичного ретикулуму просторово віддалені одне від одного. Тому при викиді Са2 за допомогою активації ріанодинових рецепторів йому доводитися дифундувати на досить велику відстань для досягнення мітохондрій і велика його частина відразу знову захоплюється ендоплазматичним ретикулумом за допомогою SERCA, а також виводитися назовні насосами плазматичної мембрани (рис.10). У випадку деполяризаційних кальцієвих транзиєнтів, кальцій практично відразу й у великих кількостях захоплюється мітохондріями, що може говорити про їхню просторову близькість до кальцієвих каналів плазматичної мембрани (рис. 10). Необхідність такої близькості для значної акумуляції кальцію було показано для окремої мітохондрії в симпатичних нейронах (Pivovarova et al. 1999). Подібне розташування мітохондрій і відповідний вплив на регуляцію кальцію описані в хромафінних клітинах наднирників (Giovannucci et al. 1999) і гонадотропних клітинах (Hehl et al. 1996), однак у клубочкових клітинах наднирників кальцій, що входить через Т-канали плазматичної мембрани виявляється зовсім недосяжним для мітохондрій (Rossier et al. 1996). Описані відмінності у формі різних по своїй природі кальцієвих сигналів і розходження у взаємній участі внутрішньоклітинних органел у цих процесах може дати відповідь на питання, чому кальцієві сигнали різної природи приводять до різних, часом навіть протилежним ефектам у внутрішньоклітинній діяльності.

При вивченні впливу патологій на ефективність роботи внутрішньоклітинних кальцієвих депо були виявлені значні зміни у функціонуванні мітохондрій. При стрептозотоцин-індукованому діабеті, як і у випадку карадженин-індукованого запалення спостерігалося зниження амплітуди СССР-індукованих відповідей на спаді деполяризаційних кальцієвих транзиєнтів в обох типах ЗКГ нейронів. Порівняння амплітуд деполяризаційних транзиєнтів у контролі і на фоні СССР не виявило помітних відмінностей при запаленні, а у великих нейронах і при діабеті, що говорить про те, що ефективність кальцієвого захоплення мітохондріями істотно не змінюється. Отже, при запаленні, а особливо при діабеті ми бачимо значне пригноблення роботи Na /Ca2 -обмінника. Причиною цього може бути зміна рівня внутрішньоклітинного Na (Hothet et al. 1997), що може бути викликано ацидозом. У випадку діабету може розвиватися кетоацидоз, що може приводити до значного закислення цитозолю і до пригнічення роботи Na /Ca2 -обмінника (Hoyt & Reynolds 1998). Закислення є також однією з характерних рис запалення, що також може впливати на рівень цитозольного Na , а отже, і на роботу обмінника (Millan 1999). Оскільки участь мітохондрій у постетанічній потенціації й у виділенні нейротрансмітерів було показано в роботах (Melamed-Book & Rahamimoff 1998; Stanton & Schanne 1986), тому зміни при порушенні роботи мітохондрій можуть відігравати істотну роль у виникненні діабетичних нейропатій. Значення пригнічення роботи Na /Ca2 -обмінника мітохондрій при запаленні практично не вивчено, однак можна припустити, що воно також буде приводити до метаболічних змін у внутрішньоклітинних процесах і можливо впливати на викиди медіатора й секрецію різних речовин, у тому числі простагландинів. Це, у свою чергу, може вплинути на потенціацію як первинних, так і вторинних сенсорних нейронів і пояснювати виникнення болючого синдрому і гіпералгезії (Minami et al. 1997; Ferreira & Lorenzetti 1996).

При розгляді малих ЗКГ нейронів було виявлено, що в діабеті відсутня достовірна різниця в амплітудах деполяризаційних кальцієвих транзиєнтів у контролі і на фоні СССР, що може говорити про пригнічення захоплення кальцію мітохондріями даних нейронів. Це явище може бути обумовлено зниженням активності процесів окислювання глюкози при цукровому діабеті, що веде до зниження рівня протонного градієнта на внутрішній мітохондріальній мембрані і супроводжується зменшенням поглинання Са2 мітохондріями за допомогою уніпортера (Duchen et al. 1998; Grinblat et al. 1998).

Таким чином, отримані нами результати свідчать про значні зміни участі мітохондрій в кальцієвій сигналізації, зокрема в роботі Na /Ca2 -обмінника і мітохондріальний уніпортера при діабеті й запаленні в первинних сенсорних нейронах ссавців (рис. 11).1. При дослідженні змін внутрішньоклітинного рівня вільних іонів Са2 методом флуоресцентної кальційметрії з використанням розєднувача протонного градієнта на мембрані мітохондрій (СССР) в ізольованих нейронах заднєкорінцевих гангліїв щурів показана функціонально різна участь мітохондрій у модуляції двох різних типів кальцієвих сигналів.

2. При порівнянні кальцієвих транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією, у цих нейронах у контролі і при стрептозотоцин-індукованому діабеті виявлене достовірне уповільнення виводу Ca2 із цитозолю в нейронах малого діаметра, на відміну від нейронів великого діаметра. У нейронах як великого, так і малого діаметра контрольних і діабетичних тварин не виявлено достовірних змін у базальному рівні [Ca2 ]i, в амплітуді деполяризаційних транзиєнтів, а також у швидкості наростання Ca2 сигналу.

3. В експериментах з використанням розєднувача протонного градієнта СССР у нейронах великого й малого діаметра виявлене значне пригнічення роботи Na /Ca2 обмінника мітохондрій при стрептозотоцин-індукованому діабеті. У нейронах малого діаметра виявлене зменшення здатності мітохондрій акумулювати кальцій, а також показане, що уповільнення виводу кальцію з цитозолю зберігається при заблокованих мітохондріях.

4. При порівнянні кальцієвих транзиєнтів, викликаних гіперкалієвою деполяризацією в даних нейронах у контролі і при карадженин-індукованому запаленні, не виявлено достовірних відмінностей у базальному рівні [Ca2 ]i, в амплітуді деполяризаційних транзиєнтів, у швидкості наростання Ca2 сигналу, а також у кінетиці спаду [Ca2 ]i.

5. В експериментах з використанням розєднувача протонного градієнта СССР у нейронах великого й малого діаметра виявлене достовірне пригнічення роботи Na /Ca2 обмінника мітохондрій при карадженин-індукованому запаленні без зміни швидкості захоплення кальцію мітохондріями.

6. Отримані результати показують провідну роль взаємодії між кальційрегулюючими структурами (мітохондріями й ендоплазматичним ретикулумом) у внутрішньоклітинній сигналізації в первинних сенсорних нейронах, порушення якого є однією з причин змін передачі сенсорних сигналів при запальному болючому синдромі і діабетичній нейропатії.

Перелік статей, опублікованих за матеріалами дисертації

1. Kostyuk P.G., Svichar N.V., Voitenko N.V., Shishkin V.O. and Kostyuk E.P. (1998) Role of mitochondria in Calcium Signalling in Mammalian Sensory Neurons // Neurophysiology, 30 (4/5), 191-193.

2. Nataliya Svichar, Vyacheslav Shishkin and Platon Kostyuk (1999) Mitochondrial participation in the modulation of calcium transients in DRG neurons. // NEUROREPORT, 10 (6), 1-5.

3. Н.В.Войтенко, О.П.Костюк, І.А.Кругліков, Н.В.Свічар, В.О.Шишкін (1999) Зміни кальцієвої сигналізації в ноцицептивних нейронах ссавців за умов цукрового діабету. // Фізілогічний журнал, 45(4), 48-54.

4. E.Kostyuk, N.Svichar, V.Shishkin and P.Kostyuk (1999) Role of mitochondrial dysfunction in calcium signalling alterations in dorsal root ganglion neurons of mice with experimentally-induced diabetes // Neuroscience, 90 (2), 535-541.

5. Kruglikov, I.A., Shutov, L.P., Shishkin, V.O., Kostyuk, E.P., Potapenko, E.S., and Voitenko, N.V. (2001) Intracellular mechanisms of changes in the functioning of rat sensory neurones with streptozotocin-induced diabetes mellitus // Phyziol Journ (Kiev), 47 (5), 18-25.

6. E. Kostyuk, N. Voitenko, I. Kruglikov, A. Shmigol, V. Shishkin, A. Efimov, P. Kostyuk (2001) Diabetes-induced changes in calcium homeostasis and the effects of calcium channel blockers in rat and mice nociceptive neurons // Diabetologia, 44 (10), 1302-1309.

Перелік тез доповідей, опублікованих за матеріалами дисертації

1. Shishkin V., Kostyuk P., Klishin A., Voitenko N. (2000) Changes in calcium homeostasis of murine primary sensory neurons under inflammation. 44 th Annual Meeting of Biophysical Society. New Orleans, LU, USA. Biophysical Journal, 78 (1), p190A.

2. Vyacheslav Shishkin, Platon Kostyuk, Nana Voitenko (2000) Intracellular calcium stores in primary sensory neurons under inflammation // European Biophysics Journal 29 (4-5), p.353.

3. О.П.Костюк, В.О.Шишкін, Н.В.Войтенко (2001) Вплив ніфедипіну на кальцієвий гомеостаз у нейронах при експериментальному цукровому діабеті // Ендокринологія 2001, Т.6, додаток, с.153.