Взаємодія антиген-антитіло в умовах поверхневого плазмонного резонансу та застосування цього явища для визначення вірусспецифічних макромолекул - Автореферат

Оскільки загальновживані способи модифікації плівки золота, зокрема, створення карбоксиметилдекстранового шару на її поверхні, не дозволяють повною мірою реалізувати можливості методу в цьому напрямку (зокрема, внаслідок гідродинамічних обмежень для взаємодії партнерів), створення проміжного шару між досліджуваним білком і металом, який мав би одночасно захисні властивості і здатність орієнтувати молекули в просторі, представляє як теоретичний, так і практичний інтерес. Метою дослідження було вивчення в умовах поверхневого плазмонного резонансу взаємодії антиген-антитіло (на таких прикладах, як: імуноглобуліни G (IGG) людини - антивидові IGG кози; структурний білок Х-вірусу картоплі (ХВК), гексон аденовірусу типу 2 (Ад2), вірус тютюнової мозаїки (ВТМ) - відповідні специфічні IGG) та розробка підходу до визначення ВТМ і вказаних білків з використанням ППР. · вивчення взаємодії білкової молекули з модифікованою поверхнею сенсора в залежності від РН середовища на прикладі соєвого інгібітора трипсину (soybean trypsin inhibitor, STI) та компютерне моделювання впливу зміни умов середовища на зарядовий стан білка з точки зору його орієнтації на поверхні, що несе ефективний негативний заряд; Взаємодія в умовах поверхневого плазмонного резонансу між ВТМ, структурним білком ХВК, гексоном Ад2 і відповідними специфічними антитілами, IGG людини і антивидовими IGG кози, трипсином і його соєвим інгібітором на поверхні сенсора, що несе ефективний негативний заряд. Запропоновано нову методику модифікації поверхні сенсора для визначення вірусів чи їх білків шляхом формування на поверхні сенсора шару малих молекул з ефективним негативним зарядом, яка дозволяє запобігти денатурації білків, зокрема, імуноглобулінів G, і забезпечити їх орієнтовану іммобілізацію, а також уникнути стадії блокування незайнятих місць за допомогою бичачого сироваткового альбуміну (БСА).Фізичними параметрами, вимірюваними при протіканні реакції, є зміна коефіцієнту заломлення Dn і товщина реакційного шару d, знаючи які, можна визначити концентрацію речовини на поверхні за формулою Г=d(na-n0)ґ(dn/dc)-1, де Г - концентрація речовини на поверхні, що виражається в одиницях маси на одиницю площі, na і n0 - ефективні коефіцієнти заломлення адсорбованого шару і розчину відповідно, ?n= na - n0, d - товщина адсорбованого шару і інкремент dn/dc складає »0,19 см3/м для більшості шарів, утворених біологічними молекулами. На першому етапі досліду на поверхні сенсора іммобілізуються молекули - носії рецепторних центрів, що спостерігається як збільшення QSPR. Надлишок молекул, що не звязалися з поверхнею, видаляється промиванням поверхні буфером. Але оскільки амінокислотні залишки з бічними ланцюгами, зарядженими при таких РН позитивно, переважно зосереджені в середній частині молекули, то орієнтація молекули на поверхні буде несприятливою для взаємодії з Т, оскільки молекули не будуть спрямовані рецепторним центром до розчину, що і було експериментально показано.Для орієнтованої іммобілізації антивірусних IGG на поверхні плівки золота уявляється доцільним використання білка А St. aureus, який взаємодіє з Fc-фрагментом IGG, що робить можливою спрямованість Fab-фрагментів у бік розчину. Як модельна система для відпрацювання процедури орієнтованої іммобілізації антивірусних IGG використовувались IGG людини і антивидові IGG кози, специфічні до IGG людини. Було проаналізовано взаємодію між імуноглобулінами G на трьох типах поверхні: немодифіковане золото, золото, оброблене тіоціанатом, золото, послідовно оброблене тіоціанатом і білком А. З рис.3а видно, що модифікація поверхні золота білком А St. aureus не поліпшує її адсорбційної здатності по відношенню до IGG кози, що свідчить про відсутність впорядкованого орієнтованого шару молекул на поверхні. Інша картина спостерігається при адсорбції на послідовно оброблену KNCS і білком А St. aureus поверхню золота IGG людини.Модельним обєктом був вибраний ВТМ як один з найбільш досліджених вірусів, який має добре вивчену просторову організацію і невеликі розміри (300ґ18 нм), що дозволяє виявляти і кількісно визначати його методом ППР, один білок і велику кількість сайтів звязування. При цьому порівнювалася ефективність звязування вірусу з антитілами, адсорбованими на чотири типи поверхні сенсора: (i) немодифіковане золото; (ii) золото, оброблене пентаазамакроциклічним комплексом нікелю, здатним утворювати на поверхні плівки золота ефективний заряджений шар, подібний тому, який утворюється при її модифікації KNCS; (iii) золото, оброблене NCS; (iv) золото, послідовно оброблене KNCS і білком А. На поверхні, модифікованій пентаазамакроциклічним комплексом нікелю, IGG звязують незначну кількість вірусу, при цьому співвідношення між IGG і вірусом складає 1,92:1, однак цей звязок не є специфічним, оскільки не розривається гліциновим буфером (РН 2,2). Лише послідовна обробка поверхні тіоціанатом і білком А St. aureus дозволяє іммобілізувати антитіла на поверхні золота таким чином, що вони в повній мірі зберігають здатність звязувати ві

Основний зміст