Основные типы лимфоцитов по функциональным и морфологическим признакам как клеток иммунной системы и ее ключевого звена. Дезоксирибонуклеазы секреторных гранул лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА. Методы выделения и изучения лимфоцитов.
Аннотация к работе
Недавние сообщения [1,2] подчеркивают роль апоптоза, аутоиммунитета и Т-лимфоцитов, как потенциально важных факторов в патогенезе хронических обструктивных заболеваниях легких и, в частности, Т-опосредованного иммунного ответа при астме.Лимфоциты - клетки иммунной системы, представляющие собой разновидность лейкоцитов группы агранулоцитов, белых кровяных клеток. Лимфоциты - главные клетки иммунной системы, обеспечивают гуморальный иммунитет (выработка антител), клеточный иммунитет (контактное взаимодействие с клетками-жертвами), а также регулируют деятельность клеток других типов. По морфологическим признакам выделяют два типов лимфоцитов: большие гранулярные лимфоциты (чаще всего ими являются NK-клетки или, значительно реже, это активно делящиеся клетки лимфоидного ряда - лимфобласты и иммунобласты) и малые лимфоциты (T и B клетки) [4]. По функциональным признакам различают три типа лимфоцитов: B-клетки, T-клетки, NK-клетки. · В-лимфоциты распознают чужеродные структуры (антигены) вырабатывая при этом специфические антитела (белковые молекулы, направленные против чужеродных структур). секреторная гранула лимфоцит иммуннаяИзучение нуклеазного состава гранул лимфоцитов связано с ролью этих нуклеаз в развитии заболеваний, характеризующихся нарушениями в иммунном ответе. В этом случае ткани инфильтрируются Т-лимфоцитами, некоторых из них с цитотоксической активностью (цитотоксические Т-лимфоциты; ЦТЛ), что приводит к Т-опосредованному аутоиммунному заболеванию.Осмотическое давление его растворов ниже, чем растворов сахарозы эквивалентной концентрации, что позволяет использовать изотонические градиенты плотности и сохранять физиологические и морфологические свойства клеток и органелл в процессе центрифугирования. Фиколл-пак представляет собой готовый к употреблению стерильный раствор плотностью 1,077 г/мл, используемый для выделения лимфоцитов периферической крови человека путем простой и быстрой процедуры Фиколл-Пак представляет собой смесь Фиколла 400 (5.7 % вес/объем) и диатризоата натрия (9,0 % вес/объем). Перколл нетоксичен для клеток и может образовывать градиенты с плотностью в диапазоне до 1,3 мг/мл. Среда, используемая для центрифугирования, может быть изотоничной по всему объему благодаря включению в нее солей или сахарозы. Особенности этого типа центрифугировнаия отражены в названии: "скоростное", потому что частицы разделяются по скорости оседания, причем плотность их значительно больше, чем плотность среды, и "зональное" так как частицы разных размеров оседают более или менее ограниченными слоями - зонами.Итак, многолетние исследования показывают, что ДНКАЗЫ представляют собой лабильную систему, чутко реагирующую на различные прямые и опосредованные воздействия. Например, повышение концентрации ДНК в крови может привести к накоплению ДНК-белковых комплексов, индукции наработки анти-ДНК антител и развитию различного рода патологий.В связи с изучением литературы по данному вопросу целью работы явилось освоение метода выделения секреторных гранул Т-лимфоцитов и характеристика их белкового состава методом электрофореза. Освоить метод ультрацентрифугирования и работу на ультрацентрифуге Beckman Coulter OPTIMATM L-series.Супернатант сливали, осадок суспенизировали раствором фосфатно-солевого буфера (5 мл) и центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин (Eppendorf 5810 R). Центрифугировали при 5000 об/мин в течение 20 мин на центрифуге К-24. К полученному осадку добавляли 1 мл 0.01 М трис-буфера РН 7,3 и разрушали клетки в стеклянном гомогенизаторе Поттера 2 мин (в "ледяной бане”), добавляли 3 мл 0.01 М трис-буфера и оставляли на 30 мин в "ледяной бане”. Центрифугировали в течение 15 мин при 2300 об/мин, 4°С (Eppendorf 5810R), отбирали супернантант. Осадок промывали в 1 мл 0.01 М трис-буфере и центрифугировали в течение 15 мин при 2300 об/мин (Eppendorf 5810R).Лимфоциты являются ключевым звеном иммунной системы и участвуют почти во всех иммунных и аутоиммунных реакциях, очень важна их роль при аллергических реакциях. [3] Обычно при изучении и оценке иммунного состояния организма, а также исследовании молекулярных механизмов, по которым протекают многие заболевания, главным объектом изучения являются лимфоциты. Основные методы выделения лимфоцитов из периферической крови основаны на центрифугировании гепаринизированной крови в градиенте плотности, что позволяет разделить клетки крови в зависимости от их плотности и осмолярности. Первые методы разделения лимфоцитов включали использование фиколла в качестве агента для формирования градиента плотности, преимущество которого видели в отделении лимфоцитов от моноцитов. Секреторные гранулы из лимфоцитов выделяли методом описанным в работе [13,14] используя градиент плотности перколла.Освоен метод скоростного и равновесного центрифугирования.
План
Содержание
Введение
Глава I. Обзор литературы
1.1 Лимфоциты
1.2 Дезоксирибонуклеазы секреторных гранул лимфоцитов периферической крови пациентов с АБА
1.3 Методы выделения и изучения лимфоцитов
1.4 Заключение по обзору литературы
1.5 Цели и задачи
Глава II. Материалы и методы
Глава III. Результаты и их обсуждение
Выводы
Список литературы
Введение
Недавние сообщения [1,2] подчеркивают роль апоптоза, аутоиммунитета и Т-лимфоцитов, как потенциально важных факторов в патогенезе хронических обструктивных заболеваниях легких и, в частности, Т-опосредованного иммунного ответа при астме.
Лимфоциты являются ключевым звеном иммунной системы и участвуют почти во всех иммунных и аутоиммунных реакциях, очень важна их роль при аллергических реакциях [3]. Обычно при изучении и оценке иммунного состояния организма, а также исследовании молекулярных механизмов, по которым протекают многие заболевания, главным объектом изучения являются лимфоциты.
Поэтому очень важным этапом в проведении таких исследований является получение чистых и жизнеспособных популяций лимфоцитов.
Вывод
1. Освоен метод скоростного и равновесного центрифугирования.
2. Освоена работа на ультрацентрифуге Beckman Optima TM L-series.
3. Освоен метод выделения экстракта секреторных гранул Т-лимфоцитов.
4. Освоен метод определения молекулярной массы белков и установлена молекулярная масса белков секреторных гранул Т-лимфоцитов: 66 069, 63 095, 50 108, 68 000, 60 255 Да.
Список литературы
1. Urboniene, D. Autoimmunity in pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease/ D. Urboniene, R. Sakalauskas, B. Sitkauskiene // Medicina (Kaunas). - 2005. - V.41, N.3. - P. 190-195.
2. Kopinski, P. Apoptosis of alveolar lymphocytes in sarcoidosis and in control group is more frequentin smokers then in nonsmoking persons/ P. Kopinski, G. Przybylsk., B. Balicka-Slusarczyk et al // Przegl Lek. - 2006. - V.63. - P.841-847.
3. vignola, a. m. Airway inflammation in mild intermittent and in persistent asthma/ a. m. vignola, p. chanez, a. m. campbell, et al. // am j respire crit care med. - 1998. - v.157. - p.403-409;
4. Ссылка на источник инет
5. Фармация Файн Кемиклз. Каталог продукции 1983. - С. - 71-76.
6. Ссылка на инет
7. Остерман, Л.А. Методы изучения белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование.
8. Невзорова, Т.А. Физико-химические методы в биохимии. 2005 г
9. Ссылка на зи
10. Parrish, J. Z. Cuts can kill: the roles of apoptotic nucleases in cell death and animal development / J. Z. Parrish, X. Deng // Chromosoma. - 2006. - V.115, № 2. - P.89-97.
11. Feucht, HE . Efficient separation of human T lymphocytes from venous blood using PVP-coated colloidal silica particles (percoll) /HE. Feucht , M. R. Hadam , F. Frank , G. Riethmuller . // J Immunol Methods. . - 1980. - V.38. - P.43
12. Boyum, A. Separation of leucocytes: improved cell purity by fine adjustments of gradient medium density and osmolality/ A. Boyum, D. Lovhaug, L. Trasland et al. // Scand. J. Immunol. - 1991. - V.34. - P.697-712.
13. Podack, E. R. Cytolytic T cell granules. Isolation, structural., biochemical and functional characterization/ E. R. Podack., P. J. Konigsberg // J. Exp. Med. - 1984. - V.1. - P.695-710
14. Kornberg, A. Supplement to DNA replication / A. Kornberg/ - San Francisco: W. H. Freeman & Co, 1982. - P.1-203.
15. Pio, R. Granule associated DNASE in T4 and T8 lymphocytes from patients with autoimmune diseases / R. Pio, A. Gonzalez, M. J. Lopez-Zabalza et al. // Biochimica et Biophysica Acta. - 1998. - V.1406. - P.51-61.