Вплив вірусної інфекції на фотосинтетичний апарат рослини-господаря за допомогою спектральних характеристик. Методи ідентифікації вірусних захворювань рослин. Спектри відбиття від листків для дистанційної експрес-діагностики хвороб вірусної етіології.
Аннотация к работе
В сучасних умовах сильного антропогенного впливу на зовнішнє середовище виникає загроза швидкого розповсюдження вірусних інфекцій та виникнення епідемій як серед людей, так і серед тварин і рослин. Вірусні інфекції завдають дедалі більшої шкоди сільськогосподарським угіддям, що, в свою чергу, призводить до значних втрат врожаю цінних господарських культур (Бойко, 1990). При цьому інформація має бути отримана на ранньому етапі розвитку вірусних інфекцій, за невеликий проміжок часу, економічно доцільною і завдавати якнайменшої руйнівної дії досліджуваним культурам. Робота виконувалась згідно з науковою темою кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка (реєстраційний номер №01БФ036-01) "Моніторинг збудників вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих технологій вирощування сільськогосподарських культур”, та відповідно проекту "Розробка комплексної еколого-економічної оцінки території України та системи оптимізації сільськогосподарського виробництва з урахуванням природно-ресурсного потенціалу та еколого-токсикологічної ситуації” (№ держ. реєстрації 0196U012978), керівник - доктор біологічних наук, професор, академік УААН, завідувач кафедри Бойко А.Л. Методи дослідження включали колориметричний метод кількісного визначення хлорофілу, аналіз пігмент-білкового складу, визначення фотохімічної активності фотосистеми І та фотосистеми ІІ, вимірювання параметрів вуглекислотного газообміну, вимірювання спектрів люмінесценції, імуноферментний аналіз, електронну мікроскопію, лабораторні та дистанційні вимірювання спектрів відбиття, а також виміри концентрації вірусу в інфікованих рослинах.Через сім днів після інокуляції вміст хлорофілу (мг/дм2) в дослідних рослинах був дещо більшим ніж в контролі. При подальшому аналізі вмісту хлорофілу цей показник зростав з віком рослини, але цей ріст був більш інтенсивним вже в контрольних рослинах, що зумовлено деструктивною дією ВТМ на хлоропласти. Проте в рослин, що вирощувалися в умовах дефіциту азоту, значення вмісту хлорофілу було меншим, ніж навіть в уражених ВТМ рослинах. Оскільки відомо, що саме хлорофіл в основному визначає спектральні властивості рослин, можна, враховуючи зміни в динаміці вмісту хлорофілу, застосувати різноманітні спектральні методи для діагностики стану рослин та для того щоб відрізнити вплив фітовірусної інфекції від впливу інших стресових факторів. Аналіз співвідношення хлорофілів а/b в хлоропластах листків тютюну показав, що як вірусна інфекція так і дефіцит азотного живлення, обумовлюють зниження його величини (табл.2). вірусна етіологія рослина фотосинтетичнийВстановлено, що в інфікованих ВТМ рослинах відбувається зміна концентрації хлорофілу як на одиницю площі, так і на одиницю маси, що дозволяє застосовувати спектрометричні методи досліджень для діагностики фітовірусних інфекцій та для диференціювання їх від інших біотичних та абіотичних стресів. Показано, що відмінності у спектрах відбиття контрольних та інфікованих вірусом рослинах, за яких характерний системний розвиток інфекції, зявляються ще до появи перших візуальних симптомів інфекції.
Вывод
Спектри люмінесценції в діапазоні довжин хвиль 400-700нм. Досліджено спектри люмінесценції рослин тютюну в діапазоні хвиль видимого світла (400-700нм). Порівнюючи уражені ВТМ та контрольні рослини встановлено, що з віком рослини синьо-зелений максимум (420-500нм) спектру інтенсивності люмінесценції збільшувався. Поряд з цим зменшувався червоний максимум цього спектру (690-730нм). Для рослин, уражених ВТМ, ці зміни були більш виразними (Рис.1 та 2).
Зміни першого максимуму (420-500нм) зумовлені, головним чином, накопиченням рослиною фенольних сполук. Як стверджує (Lichtenthaler, 1992), фенольні сполуки виділяються рослиною у відповідь на стресову ситуацію, таку, наприклад, як дія фітовірусної інфекції.
Це такі сполуки, як корична, хлорогенова, ферулінова кислоти та кумарини.
Також у інфікованих рослин збільшується відношення синьо-зеленого та червоного максимумів спектру. Ми пояснюємо це підвищенням концентрації фенольних сполук та зниженням вмісту хлорофілу в листках на одиницю площі під дією вірусу.
Динаміка змін вмісту хлорофілу. В ході експериментів проводився аналіз вмісту хлорофілу через один, сім, чотирнадцять та двадцять один день після зараження. Через сім днів після інокуляції вміст хлорофілу (мг/дм2) в дослідних рослинах був дещо більшим ніж в контролі. Такий розподіл пігментів зумовлений вірусстимулюючою дією на фотосинтетичний апарат рослини-господаря на перших етапах інфекції. При подальшому аналізі вмісту хлорофілу цей показник зростав з віком рослини, але цей ріст був більш інтенсивним вже в контрольних рослинах, що зумовлено деструктивною дією ВТМ на хлоропласти.
В подальших дослідах було підтверджено таку тенденцію. Проте в рослин, що вирощувалися в умовах дефіциту азоту, значення вмісту хлорофілу було меншим, ніж навіть в уражених ВТМ рослинах. Дефіцитні по азоту рослини відрізнялися від решти рослин відставанням у осьовому рості та рості листового індексу. Також для таких рослин з віком не спостерігалось росту вмісту хлорофілу. Оскільки відомо, що саме хлорофіл в основному визначає спектральні властивості рослин, можна, враховуючи зміни в динаміці вмісту хлорофілу, застосувати різноманітні спектральні методи для діагностики стану рослин та для того щоб відрізнити вплив фітовірусної інфекції від впливу інших стресових факторів.
При польовому дослідженні на рослинах перцю можна бачити, що за термін дослідів (3 тижні) в контрольних рослинах концентрація хлорофілу, визначена за методом Арнона, в листках одного ярусу монотонно зростала (Рис. 3). У вірусінфікованих рослин вона спочатку зростала, так що на сьомий день після інокуляції дещо перевищувала контрольний рівень, а надалі знижувалась.
На кінець третього тижня вміст хлорофілу в листках інфікованих вірусом рослин, виражений як на одиницю сирої маси, так і на одиницю площі листової поверхні, був достовірно нижчий у порівнянні із відповідними даними для листків контрольних рослин.
Хлорофільний індекс, що відповідає загальній кількості хлорофілу накопиченого в листках, у контрольних рослин монотонно зростав.
В таблиці 1 представлено результати визначення фітометричних та біохімічних параметрів контрольних та уражених вірусом тютюнової мозаїки рослин солодкого перцю в залежності від тривалості часу після зараження.
Визначення співвідношення хлорофілів а/b в хлоропластах тютюну. Аналіз співвідношення хлорофілів а/b в хлоропластах листків тютюну показав, що як вірусна інфекція так і дефіцит азотного живлення, обумовлюють зниження його величини (табл.2). вірусна етіологія рослина фотосинтетичний
В літературі дані щодо змін даного показника є досить розрізненими і суперечливими. Результати наших досліджень підтверджують висновки більшості авторів про те, що вірусна інфекція викликає зниження співвідношення хлорофілів а/b в фотосинтетичних мембранах.
Порівняльний аналіз пігмент-білкового складу досліджуваних рослин. Результати порівняльного аналізу пігмент-білкового складу досліджуваних варіантів представлені в таблиці.
Найбільш помітні зміни, що виявились під час електрофоретичного розділення пігмент-білкових комплексів хлоропластів досліджуваних рослин, стосуються комплексів LHCP2 та СРА. Відносна частка LHCP2 майже не змінилася у вірусінфікованих рослин і різко зменшилася у рослин, вирощених при азотній нестачі.
У випадку найближчої антени ФС ІІ (СРА) мало місце значне зменшення його відносної кількості під впливом кожного із несприятливих чинників.
Таблиця.
Відносний розподіл пігмент-білкових комплексів при електрофоретичному розділенні мембран тилакоїдів К - контрольні рослини, V - вірусінфіковані, - N - азотна нестача
Це може обумовлювати зміни у переносі світлової енергії від світлозбиральних пігментів до реакційних центрів ФС ІІ і, таким чином, бути одним з факторів її інактивації.
Зміни електрон-транспортного ланцюгу хлоропластів. Поряд із змінами співвідношення хлорофілів а/b в тилакоїдах хлоропластів та співвідношення окремих пігмент-білкових комплексів, що спостерігаються при дефіциті азотного живлення або зараження рослин ВТМ, нами виявлені також зміни у роботі електрон-транспортоного ланцюга хлоропластів. При визначенні швидкості електронного транспорту в тилакоїдах хлоропластів в реакції Н2О - ДХБХ (в присутності К3 (Fe (CN) 6) виявилось, що ФС ІІ - залежне виділення О2 складало 53% від контролю при нестачі азоту та дещо менше - 49% - при вірусній інфекції (табл.4). Таким чином в умовах нашого експерименту обидва несприятливі чинники викликали однонаправлені зміни (зниження) фотохімічної активності ФС ІІ, проте інтенсивність цих змін була дещо різною: інактивація ФС ІІ була більш глибокою при зараженні рослин ВТМ.
Таблиця.
Активність ФС ІІ в хлоропластах листків тютюну у звязку з зараженням ВТМ або нестачею азоту в поживному середовищі
Варіанти досліду МКМ виділ. О2 / мг хл год. % від контролю
Контроль (K) 100,1 ± 4,6 100%
-NH4NO3 (-N) 53,4 ± 3,8 53,4 %
ВТМ (V) 49,0 ± 1,4 49,0 %
Вивчені нами варіанти рослин значно відрізнялися і по активності ФС І в хлоропластах (табл.5). Поглинання кисню в реакції, коли донором електронів для ФС І є відновлений ДАД, а перенос електронів від ФС ІІ до ФС І заінгібований діуроном (ДХМС), знижувалося в середньому на 27 % у варіанті з дефіцитом азотного живлення та біля 40 % - при зараженні ВТМ. Можна бачити, що ступінь зниження активності ФС І є меншою, ніж ФС ІІ. Ці дані вказують на більшу стійкість фотосистеми І до дії вірусної інфекції та рівня забезпечення рослин азотним живленням.
Таблиця.
Активність ФС І в хлоропластах листків тютюну у звязку з зараженням ВТМ або нестачею азоту в поживному середовищі
Варіанти досліду МКМ погл. О2 / мг хл за год. % від контролю
Контроль (K) 519,2 ± 22,5 100 %
-NH4NO3 (-N) 376,6 ± 11,0 72,5 %
ВТМ (V) 314,0 ± 22,2 60,4 %
Виявлення впливу вірусної інфекції та нестачі азотного живлення на вуглекислотний газообмін рослин тютюну. Важливою характеристикою фізіологічного стану фотосинтетичного апарату є інтенсивність нетто-фотосинтезу, тобто швидкість поглинання СО2 листком. Цей показник є інтегральним відображенням як активності всього комплексу фото - та біохімічних реакцій, що відбуваються у клітинах мезофілу, так і структурно-функціональних особливостей фотосинтетичного апарату на рівні цілого листка - в першу чергу продихової регуляції надходження СО2 до міжклітинників. Знаючи параметри СО2 та Н2О газообміну листка, можна розрахувати листковий (rl) та мезофільний (rm) опори дифузії СО2, які характеризують внесок продихової та метаболічної складових у регуляцію нетто-фотосинтезу.
Виявилося, що інтенсивність фотосинтезу листків дослідних рослин вдвічі менша за контроль, тоді як різниця між самими варіантами досліду була незначною.
Розрахунки опорів дифузії СО2 показали, що це зменшення відбулося переважно внаслідок збільшення rm, який був практично однаковим у інфікованих вірусом рослин та тих, що росли за нестачі азоту. Підвищення rm свідчить про гальмування швидкості карбоксилювання рибулозобісфосфату та взагалі реакцій циклу Кальвіна. Це зрозуміло, оскільки внаслідок зменшення вмісту хлорофілу порушується робота електрон-транспортного ланцюгу та утворення АТФ і відновних еквівалентів, що необхідні для темнової фази фотосинтезу. Отже, вплив як вірусу, так і нестачі азоту, призвів на клітинному рівні до зовні однакового ефекту зменшення швидкості поглинання СО2 мезофілом листка, проте, очевидно, різними шляхами.
Навпаки, реакція продихів у дослідних рослин була неоднозначною. Нестача азоту практично не вплинула на продихову регуляцію, свідченням чого є відсутність різниці rl між цим варіантом та контролем (див. табл.6). Водночас у інфікованих вірусом рослин rl був суттєво вищим. Звідси випливає, що вірус якимось чином пошкоджує продихи, можливо через зміну їх рухомості. Це може позначитися на ступені їх розкриття та швидкості дифузії СО2 до міжклітинників мезофілу листка. Зазначимо, що концентрація СО2 у міжклітинниках (Сі) у інфікованих рослин була такою самою, як і в контролі. Однак у перших її величина визначалася закриттям продихів, а у других - активнішим поглинанням СО2 клітинами мезофілу.
Таким чином, можна дійти висновку, що вірусна інфекція як і нестача азоту негативно впливають на процес фотосинтетичної асиміляції СО2. Обидва чинники однаковою мірою знижують вміст хлорофілу в листках та підвищують опір дифузії СО2 мезофілу, що є непрямим свідченням інгібування карбоксилазної активності. Крім того, виявлено негативний вплив вірусу на функціонування продихового апарату, що супроводжується підвищенням листкового опору та утрудненням дифузії СО2 до міжклітинників листка. Внаслідок цього асиміляція СО2 листками рослин, інфікованих вірусом, була навіть дещо нижчою, ніж у варіанті з дефіцитом азоту. У звязку з цим пошкоджувальна дія вірусу на фотосинтетичний апарат уявляється порівняно більш небезпечною для продуктивності рослин, ніж нестача азотного живлення.
Динаміка змін спектральних параметрів індукції люмінесценції під впливом ВТМ. Зміни активності у фотосистемі ІІ, виявлені при визначенні фотохімічної активності фотосистем у тилакоїдах хлоропластів, були підтверджені в експериментах по вимірюванню параметрів індукції люмінесценції листків рослин. Згідно отриманих даних, зниження рівня азотного живлення призводить до значного зростання величини Fo та Fm. При цьому параметр Fm-Fo/Fm= Fv /Fm, відомий в літературі, як показник квантового виходу ФС П (Genty, 1989), зменшувався. В середньому це зменшення становило біля 5 %. У листках вірусінфікованих рослин зменшення величини Fv /Fm досягало 9%. Зміни величини Fv /Fm були обумовлені, головним чином, збільшенням інтенсивності початкової флуоресценції Fo. Інтенсивність флуоресценції Fm змінювалась в процесі розвитку інфекції у рослинному організмі по-різному. На 20-й день після інфікування рослинного організму (дані наведені в таблиці) Fm була вищою за контроль, але дещо нижчою за Fm азотдефіцитних рослин. При подальшому розвитку інфекції інтенсивність даного параметру знижувалась.
Ріст інтенсивності індукції люмінесценції Fo у вірусінфікованих та азотдефіцитних рослин свідчить, що такі чинники, як вірусна інфекція або нестача азотного живлення рослин, також призводять до змін, що стосуються ФС ІІ.
Крім параметру варіабельної люмінесценції при дії обох видів стресів мають місце також зміни відношення Fpl-Fo/Fm - Fo. Ріст величини параметра Fpl-Fo/Fm - Fo у рослин, дефіцитних по азоту і ще в більшій мірі при дії вірусної інфекції (табл. 7), як показника відносної кількості QB - невідновлювальних центрів (Корнеев, 2000), що є ще одним свідченням порушень у ФС ІІ при дії вірусної інфекції та азотного голодування.
Динаміка концентрації ВТМ в листках дослідних рослин. При дослідженні залежності загального вмісту хлорофілу від концентрації вірусу, можна відмітити, що на початкових стадіях інфекції спостерігалось падіння рівня концентрації хлорофілу до певного значення на фоні збільшення титру вірусу.
Максимальна кількість вірусів у листковій тканині рослин перцю, за умов локальної реакції рослини на дію ВТМ, виявлялась на 14-й день після інокуляції, після чого їх кількість знижувалась (Рис.4), тобто характер динаміки концентрації вірусів у листках не відповідав такому для вмісту хлорофілу в них.
Динаміка змін спектрального параметру відбиття рослин тютюну. Із дослідження спектрів відбиття штучного випромінення листками при дистанційній діагностиці стану рослин виявилось більш інформативним використовувати графічний вираз першої похідної цього спектру в червоній частині. На кривій похідної червоної частини спектру присутні два максимуми, відповідно, короткохвильовий та довгохвильовий (І1 та І2). У випадку зростання концентрації хлорофілу показник І2/І1 буде зростати, і навпаки, при зниженні вмісту хлорофілу - прямує до нуля. Таким чином цей показник може в подальшому бути використаний для експрес-діагностики фітовірусних інфекцій.
Величини вмісту хлорофілу в листках контрольних та інфікованих ВТМ рослин солодкого перцю, визначені за даними дистанційного зондування з використанням регресійної залежності CHL = 2,482 ? І1/І2 - 0,599 представлені на Рис 5.
Для контрольного варіанту динаміка дистанційно визначеного біохімічного параметра відповідала зміні на цей час концентрації хлорофілу в листках одного ярусу, визначеного хімічно за методом Арнона (Рис.6).
У листках вірусінфікованих рослин вміст хлорофілу, обчислений за допомогою дистанційно визначеного спектрального параметра відбиття І1/І2, починав знижуватись пізніше, ніж це спостерігалось за даними хімічного визначення хлорофілу.
Для вірусінфікованих рослин спостерігалось розходження даних лабораторного та дистанційного визначень хлорофілу (Рис.5 та 6) в період виявлення відмінностей між контрольними та інфікованими рослинами на 14-й та 21-й дні, коли мало місце зниження вмісту хлорофілу в листках уражених вірусом рослин.
Ці розходження можна пояснити, якщо брати до уваги той факт, що дана вірусна інфекція, на відміну від дії ВТМ у рослинах тютюну (системні симптоми у вигляді рівномірної дехлорофілізації рослин) викликала нерівномірне ураження по всій площі листової поверхні у вигляді зниження вмісту хлорофілу на певних ділянках листової пластинки з подальшим їх некрозом. А тому навіть при значному розвитку патологічного процесу ділянки листової пластинки з високим вмістом хлорофілу ще вносили суттєвий вплив на формування спектральної кривої відбиття, кількісною характеристикою яких служить обчислюваний нами параметр І2/І1. А тому величини вмісту хлорофілу, одержані за допомогою даного спектрального параметра, в значній мірі відображали вміст хлорофілу на неуражених частинах листової пластинки. Саме цим, очевидно, можна пояснити більш пізнє виявлення зниження хлорофілу в інфікованих рослинах за допомогою спектрального параметра І2/І1 при використанні даних дистанційного зондування ділянок з насадженнями перцю.
Так, зміна листового індексу контрольних та дослідних рослин перцю впродовж експерименту була неоднаковою (Рис.7). Видно, що загальна площа листової поверхні інфікованих рослин на третій тиждень була значно меншою за листовий індекс контрольних рослин, що свідчить про одночасне накопичення хлорофілу в інфікованих листках та зупинку росту їхньої площі.
Відсутність росту площі листкової поверхні за умови підвищення вмісту хлорофілу в листках може бути використане для розпізнавання вірусної інфекції на більш ранній стадії розвитку інфекційного процесу.1. Встановлено, що в інфікованих ВТМ рослинах відбувається зміна концентрації хлорофілу як на одиницю площі, так і на одиницю маси, що дозволяє застосовувати спектрометричні методи досліджень для діагностики фітовірусних інфекцій та для диференціювання їх від інших біотичних та абіотичних стресів.
2. Показано, що відмінності у спектрах відбиття контрольних та інфікованих вірусом рослинах, за яких характерний системний розвиток інфекції, зявляються ще до появи перших візуальних симптомів інфекції.
3. Встановлено, що вірусна інфекція, як і нестача азоту негативно впливають на процес фотосинтетичної асиміляції СО2. Виявлено негативний вплив вірусу на функціонування продихового апарату, що супроводжується підвищенням листкового опору та утрудненням дифузії СО2 до міжклітинників листка.
4. Під впливом вірусу ВТМ і нестачі азоту в середовищі ступінь зниження активності ФС І є меншою, ніж ФС ІІ, що вказує на більшу стійкість фотосистеми І до дії вірусної інфекції та рівня забезпечення рослин азотним живленням.
5. Експериментально доведено, що одним з параметрів оцінки стану рослин, за умов системної реакції рослин на розвиток фітовірусної інфекції, може бути співвідношення довгохвильового та короткохвильового максимумів (І2/І1) на кривій першої похідної від спектру відбиття в ділянці червоного краю.
6. Отримано залежність між спектральним параметром І2/І1 та вмістом хлорофілу (CHL=2,482 ? І2/І1 - 0,599 з коефіцієнтом кореляції R = 0,984 ± 0,089) для рослин Capsicum annuum L., що дозволяє оцінювати вплив вірусної інфекції за даними дистанційного зондування.
7. Показано, що для підвищення чутливості даного спектрального методу, який використовується для оцінки впливу вірусу на рослину, необхідно використовувати також параметри відбиття, чутливі до зміни величини листового індексу.
Список литературы
1. Улинець В.З., Поліщук В.П., Шадчина Т.М. Експрес-метод діагностики вірусної інфекції // Науковий вісник Ужгородського національного університету. - 2000, №8, с.4-6.
2. Улинець В.З., Поліщук В.П., Шадчина Т.М., Немченко А.М. Успіхи і проблеми в розробці методів дистанційної діагностики фітовірусних інфекцій // Науковий вісник Ужгородського національного університету. - 2001, №9, с.73-76.
3. Улинець В.З., Шадчина Т. М, Немченко А.М., Поліщук В.П. Тестування фітовірусних інфекцій перцю за допомогою характеристик відбиття листків в області червоного краю спектру // Вісник Київського національного університету ім.Т. Шевченка. - 2001, №35, с.53-56.
4. В.З. Улинець, Т.М. Шадчина, О.Г. Воловик, С.К. Ситнік. Вплив вірусної інфекції та азотного голодування на фотосинтетичний апарат листків тютюну // Физиология и биохимия культ. растений. - 2002, Т.34, №4, с.360-365.
5. В.З. Улинець, Д.А. Кірізій. Вплив вірусної інфекції та нестачі азотного живлення на вуглекислотний газообмін рослин тютюну // Доповіді Національної академії наук України. - 2002, №8, с.166-169.
6. Шадчина Т.М., Бубряк О.А., Улинец В.З., Созинов А.А. Перспективы ранней диагностики фитовирусных инфекций по отражательным характеристикам листьев // ІІ Міжнародна конференція "Біоресурси та віруси”.7-10 вересня 1998. Київ, Україна. С.110.
7. V. Ulinets, V. Polishuk, А. Nemchenko. Plant photosynthetic activity affected by viruses, and abilities of fast-diagnostics // 12th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology.21-25 August 2000, Budapest. S20-45.
8. Улинець В.З., Шадчина Т.М., Немченко А.М. Тестування фітовірусних інфекцій перцю, за допомогою характеристик відбиття листків в області червоного краю // ІІІ Міжнародна конференція "Біоресурси та віруси”.11-15 вересня 2001. Київ, Україна. С.103.
9. Улинець В.З., Поліщук В.П., Шадчина Т.М., Немченко А.М. Успіхи і проблеми в розробці методів дистанційної діагностики фітовірусних інфекцій // Міжнародна науково-практична школа для молодих вчених та спеціалістів "Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу”, 4-7 жовтня 2001р., Ужгород. С.73-76.
10. Polischuk V. Р., Budzanivska І. G., Ulinets V. Z., Shadchina T. M., Boyko А. L. Detection of plant virus infections using leaf spectral characteristics // 12th International Congress of Virology "The World of Microbes”, 27th July - 1st August 2002, Paris. Р.231.
11. Ulinets V., Polischuk V. Changes in photosynthetic apparatus of tobacco leaves in coditions of virus infection and shortage of nitrogen // 6th Conference of European Foundation for Plant Pathology "Disease Resistance in Plant Pathology”, 9-14 September 2002, Prague. Р.78.