Дослідження впливу температури в області 4-44 градусів на структуру та функції тромбоцитів і фібриногену людини методами НВЧ-діелектрометрії, УФ-спектроскопії та світлорозсіювання. Аналіз ступеню радіовразливості білків плазми і мембранних компонентів.
Аннотация к работе
Вивчення впливу температури на конформацію білків, структурних компонентів біомембран і характер протікання процесів у живих клітинах дає інформацію, як про механізми функціонування біосистем, так і про діапазон фізіологічно значимих умов їх існування. Визначення механізмів агрегації тромбоцитів і їх взаємодії з білком крові фібриногеном мало б велике значення як для встановлення фундаментальних закономірностей біосистем, так і для медико-біологічної практики, зокрема клінічної діагностики, консервації крові, фармакології тощо. Дисертація виконувалась у відповідності з планом науково-дослідних робіт кафедри молекулярної та прикладної біофізики ХДУ за проектом Державного фонду фундаментальних досліджень № 2.4/764 (договір № Ф 4/280-27) "Дослідження молекулярних механізмів дії гамма-опромінення на ДНК, фібриноген та міжклітинні взаємодії", та за програмою Міносвіти "Здоровя людини" за координаційним планом "Взаємодія електромагнітного випромінювання та потоків заряджених частинок з речовиною" (теми "Дослідження гідратації макромолекул і механізмів їх взаємодії з іонізуючим випромінюванням" № держреєстрації 0197U016740 та "Дослідження впливу іонізуючого випромінювання і біологічно-активних речовин на клітини та організми" № держреєстрації 0197U016741). Розробити математичні моделі динаміки утворення агрегатів тромбоцитів і визначити величини кінетичних констант агрегації при різних температурах. Показано, що характер температурної залежності агрегації тромбоцитів зумовлений механізмом утворення звязків між клітинами у агрегаті і визначається змінами мікровязкості ліпідного бішару мембрани тромбоцитів, конформації молекули фібриногену і мембранних рецепторів.Індуковані температурою структурні перебудови мембран клітин і білків плазми викликають зміни структури розчинника (води). Співставляючи дані про зміну стану води у суспензії клітин і розчинах білків з інформацією про стан власне клітин і макромолекул при різних температурах, можна зробити висновки про характер температурних переходів. Це свідчить про зміну стану звязаної та вільної води у розчині фібриногену при даних температурах, яка обумовлена, очевидно, зміною "щільності" пакування ділянок молекули при зміні структури білка. Аналіз спектрів поглинання в УФ-діапазоні показує, що при нагріванні розчину фібриногену спостерігається зменшення інтенсивності максимуму 292-294 нм першої похідної спектру поглинання в області температур 16-22°С (рис.2.б) і мутності в інтервалі 16-18°С (рис.2.а). Пік 1ПСП 281 нм, очевидно, відбиває стан центрів полімеризації фібриногена, а зміна його інтенсивності при температурах близько 10 та 35°С говорить про зміну у структурі Д-домена білка.Вперше встановлено наявність конформаційного переходу у молекулі фібриногену людини при 18-22°С і структурних змін мембранних білків тромбоцитів при 18-20°С, 30-32°С методами УФ-спектроскопії та НВЧ-діелектрометрії. Експериментально встановлено температурні залежності ступеня і швидкості агрегації тромбоцитів в інтервалі температур 4-44°С, індукованої АДФ, адреналіном, тромбіном і Н 2О 2. Визначено константи швидкості утворення і розпаду агрегатів тромбоцитів шляхом оптимізації параметрів моделі за експериментальними даними для різних температур. Показано, що характер температурної залежності агрегації тромбоцитів зумовлений структурним станом мембранних білків і ліпідів і конформаційним переходом молекули фібриногену, що призводить до різного співвідношення між швидкістю звязування фібриногену з мембранними рецепторами і ступенем їх експозиції на поверхні мембрани.
План
Основний зміст роботи
Вывод
тромбоцит фібриноген плазма радіовразливість
Вперше встановлено наявність конформаційного переходу у молекулі фібриногену людини при 18-22°С і структурних змін мембранних білків тромбоцитів при 18-20°С, 30-32°С методами УФ-спектроскопії та НВЧ-діелектрометрії.
Експериментально встановлено температурні залежності ступеня і швидкості агрегації тромбоцитів в інтервалі температур 4-44°С, індукованої АДФ, адреналіном, тромбіном і Н 2О 2. Показано, що їх екстремальний характер не залежить від концентрації індуктора, кількості клітин і індивідуальних особливостей тромбоцитів.
Розроблено математичну модель динаміки агрегації тромбоцитів in vitro. Визначено константи швидкості утворення і розпаду агрегатів тромбоцитів шляхом оптимізації параметрів моделі за експериментальними даними для різних температур. Розраховано величину енергії активації процесів приєднання і відокремлення тромбоцитів від агрегату. Показано, що температурні залежності кінетичних параметрів математичної моделі якісно добре узгоджуються з експериментальними залежностями параметрів агрегації, отриманими оптичними методами.
Показано, що характер температурної залежності агрегації тромбоцитів зумовлений структурним станом мембранних білків і ліпідів і конформаційним переходом молекули фібриногену, що призводить до різного співвідношення між швидкістю звязування фібриногену з мембранними рецепторами і ступенем їх експозиції на поверхні мембрани.
Одержано залежність діелектричної проникності розчину фібриногену від дози гамма-опромінення і виявлено зміну його конформації при 30-50 Гр, яка супроводжується зміною ступеня гідратації білка. Отримані залежності параметрів агрегації тромбоцитів від дози гамма-опромінення in vitro в діапазоні доз 10-250 Гр при різних температурах. Показано, що максимальні величини ступеня і швидкості агрегації тромбоцитів, індукованої різними агоністами, спостерігаються при опроміненні дозами 30-50 Гр.
Показано, що хронічне внутрішнє та зовнішнє опромінення організму щурів радіонуклідами "чорнобильського спектру" в дозах 0,16-50 СГР призводить до збільшення величин параметрів агрегації тромбоцитів і до підвищення ризику тромбоутворення. Визначена залежність агрегації від поглиненої дози опромінення і тривалості її накопичення.
Берест В.П., Гаташ С.В. Залежність агрегації тромбоцитів від температури // Фізіологічний журнал.-1998.-Т.44,№5-6.-С.89-94.
Берест В.П., Морозова Т.Ф., Гаташ С.В. Спектрофотометрическое исследование влияния температуры на тромбоциты плазмы человека // Вісн. Харк. ун-ту.- 1998.- № 422. Біофізичний вісн. Вип.2.- С.45-48.
Гаташ С.В., Берест В.П., Воробейчик М.В. Математическая модель динамики агрегации тромбоцитов. Определение зависимости кинетических параметров от температуры // Вісн. Харк. ун-ту.- 1999.- № 434. Біофізичний вісн. Вип.3.- С.71-77.
Берест В.П., Гаташ С.В., Николов О.Т. Влияние температуры на диэлектрическую проницаемость суспензии тромбоцитов в 3-см диапазонне длин волн // Вісн. Харк. ун-ту.- 1999.- № 434. Біофізичний вісн. Вип.3.- С.92-95.
Gatash S.V., Berest V.P. Temperature induced conformational transitions in fibrinogen // European Biophysics Journal.- 1997.- v.26, N1.- P.21.
Berest V.P., Gatash S.V. The temperature dependence of fibrinogen molecule conformational state // P. Carmona, R. Navarro and A. Hernanz (eds.) Spectroscopy of Biological molecules: Modern Trends.-Dordrecht, London: Kluwer Acad.Publ.-1997.-P.37-38.
Гаташ С.В., Николов О.Т., Берест В.П., Хакл О.В. Вивчення впливу температури на агрегацію тромбоцитів in vitro // Матеріали І Зїзду Українського біофізичного товариства.- Київ.- 1994- С. 61-62.
Берест В.П., Гаташ С.В. Влияние температуры на индуцированную агрегацию тромбоцитов // Тезисы докладов Международной научной конференции "Идеи И.И. Мечникова и развитие современного естествознания".-Харьков.-1995.-С.26-27.
Берест В.П., Гаташ С.В., Дубовицкая О.В., Морозова Т.Ф. Исследование влияния температуры на состояние молекулы фибриногена // Там же.-С.27-28.
Берест В.П., Гаташ С.В. Вплив фазового стану мембрани тромбоцита на температурну залежність агрегації // Тези доп. VII Українського біохімічного зїзду.- ч.1.- Київ.- 1997.- C.35-36.
Берест В.П., Гаташ С.В., Алесина М.Ю., Карпенко Н.А. Изменения агрегации тромбоцитов крыс из зоны отчуждения ЧАЭС // 3 съезд по радиационным исследованиям.- т.1.- Пущино.- 1997.- C.388-389.
Berest V.P., Alesina M. Yu., Gatash S.V., Karpenko N.A. Influence of chronic prolonged impact of radiation in the Chernobyl exclusion zone on the platelet function of rats // Proceedings 2nd International Conference Long-Term Health Consequences of the Chernobyl Disaster.-Kiev.-1998.-P.185.
Берест В.П., Гаташ С.В. Вплив температури на незворотну агрегацію тромбоцитів // Тези доповідей ІІ Зїзду Українського біофізичного товариства (УБФТ-98).- Харків.- 1998- С. 167.
Berest V.P., Gatash S.V. Conformational dynamic of fibrinogen by dielectric spectroscopy // 5th Int. Conf. "Dielectric and Related Phenomena"(DRP’98).-Szczyrk.-1998.-P.103-104.