Вплив нейроендокринного диференціювання клітин карциноми простати на характеристики об’ємрегульованого хлорного струму - Автореферат

Дослідження мембранних провідностей у клітинах простати є надзвичайно важливим, оскільки така робота сприятиме глибшому розумінню причин та шляхів злоякісного переродження клітин і може стати в пригоді при розробці ефективних стратегій протиракової терапії. Нещодавно в цих клітинах було також виявлено аніонну провідність, активність якої регулюється зміною обєму клітини і відбувається через ОРАК обємрегульовані аніонні канали (Shuba et al. Ці канали, переносять обємактивований хлорний струм - ICL,swell і беруть участь у регуляторному відновленні обєму клітини (РВО). Особливий інтерес становить дослідження того, яким чином модифікується робота ОРАК та ефективність РВО при нейроендокринному диференціюванні клітин карциноми простати, оскільки збільшення популяції нейроендокринно диференційованих (НЕД) клітин в тканині залози корелює з агресивністю канцерогенезу і переходом до андроген-незалежної стадії раку, для якої досі немає ефективної терапії. Також ми ставили собі за мету визначити вплив внутрішньоклітинного АТФ на функції ОРАК в контрольних та нейроендокринно-диференційованих клітинах і зробити висновки про структурну організацію обємрегульованого хлорного каналу та фактори, що беруть участь в переході клітин раку простати від андроген-залежної до андроген-незалежної стадії росту.Клітини лінії LNCAP (American Type Culture Collection) культивували в середовищі RPMI 1640 (Biowhittaker, Франція) з додаванням 5 ммоль/л L-глутаміну (Sigma, США), 10%-ї ембріональної бичачої сироватки (Poly-Labo, Франція), 50000 од/л пеніциліну та 50 мг/л стрептоміцину. Клітини вирощували у флаконах, обємом 50 мл при 37 ОС в інкубаторі зі зволоженою атмосферою 95% повітря та 5% СО2. Для електрофізіологічних досліджень клітини висаджувались в чашки Петрі, покриті поліорнітином (Sigma, США), і використовувались протягом 4-6 діб. Також використовувалась методика диференціювання клітин в нейроендокринний фенотип шляхом тривалої інкубації в безстероідному середовищі. Мембранні струми в LNCAP клітинах реєструвалися з використанням методики “петч-клемп” в конфігурації “ціла клітина”.В попередніх роботах було показано, що в LNCAP клітинах у відповідь на зниження осмотичності зовнішнього розчину розвивається Cl-струм, ICL,swell, величина якого корелює з рівнем набрякання клітин (Shuba et al. Досліджувані струми справді виявляли здатність до інактивації при потенціалах вищих за 40 мв, однак, експоненційна апроксимація інактиваційної фази струму при 120 МВ в середньому не виявляла достовірної різниці часових констант інактивації між контрольними (тін = 197±31 мс) і нейроендокринно диференційованими (тін = 234±38 мс) клітинами.Підвищення амплітуди і прискорення реакції на набрякання клітини в нейроендокринно диференційованих клітинах, теоретично, мало б вести до більш ефективної відповіді на індуковане гіпотонічністю збільшення обєму клітини. Такий характер експресії CLC-3 дозволяє нам зробити висновки, що CLC-3 може грати певну роль в ICL,swell в клітинах LNCAP та посилення ICL,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах може, принаймні частково, бути наслідком підвищення рівня експресії CLC-3. Справді, попередні дослідження показали, що: ОРАК, котрі переносять ICL,swell в LNCAP клітинах, ефективно інгібуються кальцієм, котрий входить в клітину через депо-керовані кальцієві канали (SOCS). В цій роботі ми вперше повідомляємо про те, що: нейроендокринна диференціація андроген-залежних клітин раку простати лінії LNCAP веде до збільшення обємактивованого Cl-струму, посилення процесу РВО і збільшення експресії CLC-3 білка; CLC-3 бере участь в генерації ICL,swell в LNCAP клітинах; нейроендокринне диференціювання послаблює кальційзалежне інгібування обємрегульованих хлорних каналів з боку депо-керованих Ca2 -каналів; функціонування ОРАК модулюється внутрішньокілтинним АТФ (вплив АТФ посилює ICL,swell, а йони Mg2 інгібують струм); при нейроендокринному диференціюванні LNCAP клітин знижується АТФ-чутливість ICL,swell.На клітинах лінії LNCAP карциноми простати людини за допомогою методу петч-клемп в конфігурації “ціла клітина” досліджені зміни в характеристиках трансмембранного хлорного струму (ICL,swell), що активується при осмотично-зумовленому набряканні клітин та бере участь у регуляторному відновленні обєму (РВО), у відповідь на нейроендикринне диференціювання цих клітин, яке переводить їх в андроген-незалежний, апоптоз-резистивний фенотип. Встановлено, що нейроендокринне диференціювання клітин LNCAP веде до збільшення амплітуди ICL,swell та прискорення реакції обєм-регульованих аніонних каналів (ОРАК), що його переносять, на гіпотонічність. Показано, що зростання амплітуди ICL,swell при нейроендокринному диференціюванні клітин LNCAP повзане з підвищенням експресії CLC-3 білка, котрий, очевидно, бере участь у формуванні або регуляції простато-специфічного ОРАК, та зменшенням інгібіторного впливу на ОРАК кальцію, що входить в клітину через депо-керовані кальцієві канали. Показано, що внутрішньоклітинний АТФ справляє позитивний модулят

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ ДИСЕРТАЦІЇ

Зміни РВО і ОРАК при нейроендокринному диференціюванні клітин раку простати. За критерії нейроендокринного диференціювання клітин LNCAP ми вважали морфологічні зміни - нейритоподібне видовження відростків та збільшення експресії клітинами нейроспецифічних енолаз. В попередніх роботах було показано, що в LNCAP клітинах у відповідь на зниження осмотичності зовнішнього розчину розвивається Cl- струм, ICL,swell, величина якого корелює з рівнем набрякання клітин (Shuba et al. 2000). Також було доведено, що цей струм бере участь в процесі РВО (Lemonnier et al. 2002).

Експозиція до гіпотонічного розчину спричинювала активацію такого самого струму і в нейроендокринно-диференційованих клітинах LNCAP. Однак спостерігалися дві помітні відмінності: ICL,swell в НЕД клітинах характеризувався прискоренням розвитку та збільшенням амплітуди, порівняно з контролем.

Струм, що розвивався в гіпотонічних умовах мав ознаки зовнішнього випрямлення та потенціал реверсії -19 МВ (контроль) і - 22 МВ (нейроендокринні клітини), що досить близько до розрахункового рівноважного потенціалу для іонів хлору (-17,5 МВ); а амплітуда струму при нейроендокринному диференціюванні майже в 2 рази перевищувала контрольний рівень. При 100 МВ густина ICL,swell в НЕД клітинах складала 88±7 ПКА/ПКФ, (n = 10), проти 42±2 ПКА/ПКФ, (n = 11) в контролі.

Усереднені вольтамперні характеристики активованих набряканням струмів в контрольних і нейроендокринно диференційованих клітинах не зважаючи на різницю в амплітуді демонстрували однакове помірне вихідне випрямлення, що є додатковим доказом на користь того, що зареєстрований струм - ICL,swell.

На додаток до збільшення густини ICL,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах характеризувався більш швидкою активацією у відповідь на гіпоосмотичність.

Швидкість реакції струму на гіпоосмотичність також визначалась шляхом обчислення латентного періоду та, власне, періоду розвитку струму. Затримка та розвиток струму в контролі складали 24±2,4 с та 110±7,5 с; в той час як в НЕД клітинах - 15±1,7с та 90±5,6 с відповідно.

Ми також досліджували потенціал-залежну інактивацію ICL,swell в контрольних та нейроендокринно-диференційованих клітинах LNCAP, що також є однією з характерних рис цього струму.

Досліджувані струми справді виявляли здатність до інактивації при потенціалах вищих за 40 мв, однак, експоненційна апроксимація інактиваційної фази струму при 120 МВ в середньому не виявляла достовірної різниці часових констант інактивації між контрольними (тін = 197±31 мс) і нейроендокринно диференційованими (тін = 234±38 мс) клітинами.Підвищення амплітуди і прискорення реакції на набрякання клітини в нейроендокринно диференційованих клітинах, теоретично, мало б вести до більш ефективної відповіді на індуковане гіпотонічністю збільшення обєму клітини. Наші очікування справджуються і максимальний обєм нейроендокринно диференційованих клітин збільшується лише на 30%, в той час як в контрольних клітинах - на 50%, таким чином, можна припустити, що при нейроендокринному диференціюванні клітин раку простати відбувається більш ефективна регуляція обєму внаслідок потенціації ICL,swell.

Молекулярна основа посилення ICL,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах. На жаль, молекулярна природа ОРАК, що переносять ICL,swell не відома. З багатьох кандидатів на цю роль лише CLC-3 все ще розглядається як варіант, тому, намагаючись знайти пояснення посиленню ICL,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах, ми вирішили перевірити гіпотезу про участь CLC-3.

Зміни РВО при нейроендокринному диференціюванні клітин LNCAP. НЕД-клітини демонструють відносно менше збільшення обєму у відповідь на гіпотонічність, порівняно з контрольними LNCAP клітинами.

Висота стовпчиків відповідає середньому проценту зміни клітинного обєму, виміряному за допомогою проточного цитометра на принаймні 5000 клітин.

Паралельне визначення рівня експресії антиапоптичного білка BCL-2 показало, що він не змінюється при диференціації (Б), що узгоджується з наявністю Bcl-2 незалежних механізмів протиапоптичної стійкості нейроендокринно диференційованих клітин. Такий характер експресії CLC-3 дозволяє нам зробити висновки, що CLC-3 може грати певну роль в ICL,swell в клітинах LNCAP та посилення ICL,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах може, принаймні частково, бути наслідком підвищення рівня експресії CLC-3.

Ca2 -залежна регуляція ICL,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах карциноми простати лінії LNCAP. Наступним фактором, що може впливати на величину ICL,swell є зміна Са2 -залежної регуляції ОРАК. Справді, попередні дослідження показали, що: ОРАК, котрі переносять ICL,swell в LNCAP клітинах, ефективно інгібуються кальцієм, котрий входить в клітину через депо-керовані кальцієві канали (SOCS). Цей факт дозволяє говорити про просторову колокалізацію двох типів каналів в плазматичній мембрані (Lemonnier et al. 2002)

Нейроендокринне диференціювання LNCAP клітин супроводжується зменшенням ISOC, найвірогідніше внаслідок зниження кількості активних SOC-каналів (Vanoverberghe et al. 2004).

Ці дані вказують на те, що нейроендокринна диференціація може також змінювати характер кальційзалежної регуляції ICL,swell. Щоб підтвердити таке припущення, ми експонували клітини до інгібітора SERCA-помпи ендоплазматичного ретикулума - тапсигаргіну (TG), котрий сприяє спустошенню внутрішньоклітинних кальцієвих депо. Вплив 0,1 мкмоль/л TG в присутності 5 ммоль/л зовнішнього кальцію веде до майже 50% зниження ICL,swell в контрольних LNCAP клітинах і це узгоджується з раніше постульованими механізмами Са2 -залежної регуляції. На противагу, аналогічні експерименти з НЕД клітинами не виявили значного ефекту TG (спостерігалось зниження струму на 2,7±2,1 %).

RT-PCR аналіз експресії CLC-3 транскрипту в контрольних LNCAP клітинах та при нейроендокринному диференціюванні. Б: Western Blot з CLC-3 та Bcl-2 специфічними антитілами. В: усереднені часові залежності розвитку ICL,swell у відповідь на гіпоосмотичність. ICL,swell в контрольних клітинах зменшується в присутності специфічних антитіл до CLC-3 (n=6), порівняно з контролем (в присутності інактивованих CLC-3 специфічних антитіл , n= 8).

Відсутність ефекту TG на ICL,swell в нейроендокринно диференційованих клітинах узгоджується з попередніми даними про те, що нейроендокринна диференціація веде до зниження депо-керованого входу кальцію в клітину. Такі зміни кальцієвої регуляції ОРАК на додаток до збільшення експресії CLC-3, очевидно, роблять свій внесок в посилення ICL,swell при нейроендокринному диференціюванні LNCAP клітин.

Додатковим доказом правильності такого припущення є те, що в НЕД клітинах спостерігається менший інгібіторний вплив йонів кальцію при зміні підтримуваного потенціалу від -50 до -80 МВ (рис. 6Б,В) та присутності 2ммоль/л Са2 в зовнішньоклітинному розчині (коли зростає базальний вхід Са2 через депо-керовані канали) порівняно з контрольними LNCAP.

Нейроендокринна диференціація зменшує інгібування ICL,swell тапсигаргін-індукованим входом Са2 через депо-керовані канали. А: усереднені нормовані часові залежності індукованого набряканням ICL,swell при експозиції до 0,1 мкмоль/л тапсигаргіну в присутності 5 ммоль/л зовнішньоклітинного Са2 ; амплітуда вимірювалась при 100 МВ і нормувалася до максимального значення фази активації та безпосередньо перед аплікацією тапсигаргіну. Б: оригінальні записи струмів за умов, коли змінюється депо-керований базальний вхід кальцію: при зміні підтримуваного потенціалу від -50 до -80 МВ та концентрації зовнішньоклітинного Са2 від 2 до 0 ммоль/л; В: усереднені значення амплітуди ICL,swell, порівняно з амплітудою при 2Са2 , -50 МВ, взятою за 100% для контрольних (n=6), та НЕД-LNCAP (n=6), P<0.05, різниця статистично достовірна.

Майже дворазове зростання ICL,swell і, разом з тим, зменшення функціональна експресія депо-керованих кальцієвих каналів спостерігається також в андроген-незалежних LNCAP/Bcl-2 клітинах, котрі набувають здатності до гормон-незалежності внаслідок надекспресії в них протиапоптичного білка Bcl-2 (Vanoverberghe et al. 2004).

Можна припустити, що власне для переходу клітин карциноми простати від андроген-залежного до андроген-незалежного росту мають певне значення перебудови кальцієвої сигналізації в клітинах (зменшення кальцієвого входу через депо-керовані канали) та посилення внаслідок зазначених змін обємрегульованого хлорного струму.

Наші дані вказують на те, що блокатори ICL,swell не перешкоджають, а навпаки, сприяють підвищенню рівня апоптозу (рис. 7). Відтак, можна припустити, що цей струм є важливим елементом, котрий сприяє кращому виживанню клітин, і що протиапоптична стійкість LNCAP клітин пропорційна до величини ICL,swell. Той факт, що блокатори ICL,swell впливають на апоптоз в нормотонічних умовах вказує на те, що існує якась фонова активність струму, котра, ймовірно, за певних умов може призводити до зморщення клітин і їхньої апоптичної загибелі. Оскільки такого не відбувається, очевидно, процеси РВО та АЗО (апоптичного зменшення обєму) реалізуються через різні механізми.

Вплив блокаторів ICL,swell на апоптоз. Гістограми демонструють процент апоптичних клітин при культивуванні протягом 48 годин в стандартних умовах; в присутності окремо індуктора апоптозу TNFБ (10 нг/мл), або разом з блокаторами ICL,swell - NPPB (100 мкмоль/л) чи DIDS (50 мкмоль/л); усереднені дані±стандартна похибка, n=4 для кожної з умов.

Потенціалзалежність обємчутливого хлорного струму(ICL,swell) в клітинах лінії LNCAP під впливом АТФ та Mg2 показові оригінальні записи струмів в клітинах, діалізованих штучним внутрішньоклітинним розчином без вмісту АТФ чи Mg2 з блокаторами синтезу АТФ (в контролі); в присутності 5 ммоль/л Na-ATP чи Mg-ATP (при дослідженні впливу АТФ); та в присутності 1 ммоль/л Mg2 (для визначення ефекту Mg2 ).

У випадку АТФ-ефекту струми більшої амплітуди розвивалися за присутності 5 ммоль/л Na-АТФ в піпетці; усереднені вольтамперні характеристики ICL,swell, побудовані за лінійно-змінною ділянкою протоколу стимуляції: квадратики - в контролі (n= 10), кружечки - під впливом внутрішньоклітинного магнію (n= 7) та трикутнички - під дією АТФ (n= 26); усереднені значення максимальної густини обємчутливого хлорного струму : в контролі (54,6 ± 4,6 ПА/ПФ при 100 МВ та -14,4 ± 2,6 при -100 МВ); під впливом Mg2 ( 38,8 ± 5,8 ПА/ПФ, та -10,9 ± 2); під впливом АТФ ( 70,3 ± 4,1 та -15 ± 1,4 ПА/ПФ).

Вплив внутрішньоклітинного АТФ на характеристики ICL,swell в клітинах LNCAP. Амплітуда ICL,swell в контрольних клітинах LNCAP істотно зростала в присутності АТФ в цитозолі, і зменшувалась під дією йонів Mg2 . Так, коли за відсутності АТФ в піпетці клітини демонстрували струм густиною 54,6±4,6 ПА/ПФ (n=10) при потенціалі 100 МВ, то в присутності АТФ (Na-ATP) ця величина зростала до 70,3±4,1 ПА/ПФ (n=26, р= 0,037) (зростання на 29,7%). Додавання йонів магнію, зменшувало амплітуду струму до 38,8±5,8 ПА/ПФ (n=7, р=0.048)(на 30,6%). Як в контролі, так і в під дією АТФ чи Mg2 ICL,swell, реєстрований у відповідь на ступінчасту стимуляцію від підтримуваного потенціалу -60 МВ до потенціалів вищих за 40 МВ виявляв залежну від часу інактивацію, рівень якої зростав з підвищенням деполяризації. При 120 МВ зменшення струму внаслідок інактивації можна було описати як суму спадаючої експоненти та її постійного компонента. Стала часу інактивації струму (tin) в контролі при 120 МВ складала 150,4±17,1 мс (n=10), при дії АТФ - 157,6±10,9 мс (n=26), та 155,5±22,6 мс при впливові йонів магнію (n=7). Усереднені нормовані значення струмів при 120 МВ під дією АТФ та Mg2. Оскільки вольтамперна характеристика стаціонарного струму залежить не лише від рушійної сили для іонів хлору, а й від стаціонарного рівня інактивації, то для зясування внеску стаціонарного струму в максимальний ми поділили стаціонарні значення струму при кожному потенціалі на максимальні та отримали криві потенціалзалежності стаціонарної інактивації (див., наприклад, рис. 11). Проапроксимувавши криві рівнянням Больцмана, ми визначили потенціал половинної інактивації (V1/2), фактор нахилу (k), та мінімальний рівень інактивації (Amin).

Для контрольних клітин ці показники складали V1/2 = 75,14±8,05 МВ; k = -45,09±3,03 МВ та Amin = 0,21±0,06 відповідно. Як АТФ так і Mg2 справляли відчутний вплив виключно на мінімальний рівень інактивації. Так, присутність АТФ сприяла збільшенню цього рівня до Amin = 0,34±0,03 (на 62%); а Mg2 спричиняв потужне зменшення - до Amin = 0,06±0,08 (на 71%). Потенціал-чутливість інактиваційних процесів та рівень половинної інактивації під впливом АТФ чи Mg2 достовірно не відрізнялися від контролю і становили: k = -41,2±1,7 МВ та V1/2 = 73,7±4,1 МВ в присутності АТФ; і : k = -41,9±3,3 МВ та V1/2 = 74,3±8,4 МВ в присутності Mg2 .

Для дослідження змін АТФ-чутливості обємрегульованого хлорного струму при нейроендокринному диференціюванні ми порівняли характеристики ICL,swell в контрольних LNCAP та НЕД клітинах за відсутності АТФ в цитозолі при заблокованому синтезі ендогенного АТФ з характеристиками струму в присутності 5 ммоль/л внутрішньоклітинного MGATP. За літературними даними саме така концентрація ATP в цитозолі властива для фізіологічних умов (Lehninger 1985).

Вплив внутрішньоклітинного АТФ на амплітуду ICL,swell в контрольних та нейроендокринно диференційованих клітинах: густина ICL,swell за різних концентрацій MGАТФ в цитозолі. Отримані нами результати вказують на те, що дія 5 ммоль/л MGATP виявляється тенденцією до збільшення густини обємчутливого хлорного струму як в контрольних, так і нейроендокринно диференційованих клітинах. Однак достовірних відмінностей в густині струму, під дією MGATP за даних експериментальних умов виявлено не було. При нейроендокринному диференціюванні було виявлено зменшення АТФ-чутливості інактивації ICL,swell і зниження рівня стаціонарного неінактивованого струму порівняно з контрольними клітинами (рис.11): V1/2 = 49,5±8,9 МВ; k = -36,3±4,9 МВ та Amin = 0,14±0,1 в присутності 5 ммоль/л MGATP і відповідно, V1/2 = 47,9±7,0 МВ; k = -32,5±4,2 МВ та Amin = 0,09±0,07 при заблокованому ендогенному синтезі АТФ і без АТФ в піпетці.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

В цій роботі ми вперше повідомляємо про те, що: нейроендокринна диференціація андроген-залежних клітин раку простати лінії LNCAP веде до збільшення обємактивованого Cl- струму, посилення процесу РВО і збільшення експресії CLC-3 білка; CLC-3 бере участь в генерації ICL,swell в LNCAP клітинах; нейроендокринне диференціювання послаблює кальційзалежне інгібування обємрегульованих хлорних каналів з боку депо-керованих Ca2 -каналів; функціонування ОРАК модулюється внутрішньокілтинним АТФ (вплив АТФ посилює ICL,swell, а йони Mg2 інгібують струм); при нейроендокринному диференціюванні LNCAP клітин знижується АТФ-чутливість ICL,swell.

При нейроендокринному диференціюванні клітин простати спостерігається зміна морфології клітин, однією з головних ознак якої є нейритоподібне видовження відростків, що супроводжується перебудовою F-актинового цитоскелету (Lodish et al. 2000). Можливо, саме це спричинює підвищення чутливості клітин до осмотичного стресу і прискорення розвитку обємчутливого хлорного струму.

Ми виявили, що нейроендокринна диференціація клітин раку простати лінії LNCAP посилює ICL,swell і повязаний з ним РВО. Більш того, ми ідентифікували CLC-3 білок - обємчутливий представник CLC родини Cl- каналів - як можливий молекулярний субстрат, що посилює ICL,swell. Наші досліди показали, що CLC-3 не лише експресується в контрольних клітинах LNCAP, але і має функціональне включення в ICL,swell, оскільки введені внутрішньоклітинно специфічні антитіла до CLC-3 здатні майже повністю блокувати активацію ICL,swell у відповідь на гіпоосмотичність. Таким чином, CLC-3 може бути частиною ендогенного ОРАК в клітинах LNCAP. Більш того, той факт, що рівень ендогенного CLC-3 білка зростає у відповідь на нейроендокринну диференціацію паралельно з посиленням ICL,swell не лише дає додатковий сильний аргумент на користь їхнього взаємозвязку, але і дозволяє припустити, що нейроендокринне диференціювання модулює ICL,swell через вплив на експресію CLC-3.

Інший механізм, через який нейроендокринне диференціювання може посилювати ICL,swell - це послаблення кальційзалежного інгібування. Справді, як було показано раніше, нейроендокринне диференціювання клітин LNCAP повязане зі зниженням ISOC, найімовірніше, внаслідок зменшення кількості функціональних депо-керованих кальцієвих каналів, як адаптивної відповіді на тривале зменшення Са2 в ендоплазматичному ретикулумі (Vanoverberghe et al. 2004). А відомо, що Са2 , транспортований в клітину через депо-керовані канали справляє інгібіторний вплив на ICL,swell (Lemonnier et al. 2002). Отримані нами результати виявили, що TG-індуковане кальційзалежне пригнічення ICL,swell в НЕД-LNCAP клітинах значно слабше, ніж в контрольних LNCAP клітинах, що може бути якраз наслідком зниження функціональної експресії депо-керованих кальцієвих каналів при нейроендокринному диференціюванні.

Виходячи з того, що злоякісна нейроендокринна диференціація веде до посилення протиапоптичної стійкості (Fixemer T. et al. 2003), можна поміркувати яким чином посилення ICL,swell та РВО може транслюватися в більш високу стійкість нейроендокринно диференційованих клітин простати до апоптичної загибелі.

Двома визначними рисами апоптичної загибелі клітин, в яких найвірогідніше беруть участь іонні канали плазмалеми, є зморщення (Lang et al. 2000) і зниження потенціалу спокою (Dallaporta et al. 1999). Однак, не зважаючи на те, що Cl- канали взагалі і обємчутливі зокрема задіяні в модуляції потенціалу спокою в деяких типах клітин (Jentsch et al. 2001) та нормотонічному апоптичному зменшенні обєму (Lang et al. 2000; Okada et al. 2001), досі є лише кілька робіт, що показують прямий звязок між обємактивованим Cl- струмом, РВО та протиапоптичною резистивністю, хоч і повязаною з надекспресією Bcl-2 (Shen et al. 2002).

Цікаво, що особливості ICL,swell і РВО описані для Bcl-2 залежної протиапоптичної резистивності аналогічні для тих, що спостерігаються при нейроендокринному диференціюванні: тобто, збільшення ICL,swell і посилення РВО. Оскільки нейроендокринний фенотип має протиапоптичні механізми відмінні від Bcl-2 залежних, (July et al. 2002; Xing et al. 2001; Xue et al. 1997), можна підсумувати, що посилення РВО - це типова передумова для кращого виживання клітин.

Посилення ICL,swell-опосередкованого РВО при набутті клітинами протиапоптичної стійкості говорить проти гіпотези, що повязує апоптичне зменшення обєму (АЗО) і РВО принаймні в термінах їхньої спільної участі в ОРАК (Maeno et al. 2000). Справді, оскільки РВО і АЗО повязані із втратою клітинами осмолітів, посилення РВО механізмів при збільшенні протиапоптичної стійкості призвело б також до посилення АЗО і розвитку апоптозу замість протиапоптичної резистивності.

Гіпотеза про звязок РВО і АЗО ж базується власне на спостереженні того, що інгібітори ОРАК, такі як NPPB і DIDS здатні перешкоджати розвитку апоптозу (Maeno et al. 2000). Однак, було також показано, що саме ці інгібітори зменшують вихід К і повязане з ним АЗО (Trimarchi et al. 2002), що також свідчить про неспецифічність дії цих агентів.

Наші результати підтримують думку про те, що РВО і АЗО визначаються різними механізмами і що посилення РВО в апоптоз-резистивних клітинах, можливо, є лише відображенням кращої здатності клітини підтримувати відносну сталість свого обєму і протидіяти негативним впливам різного походження, таким чином сприяючи виживанню клітин. Не слід також відкидати припущення про те, що ОРАК сам по собі може бути повязаним з апоптичною машиною, незалежно від його здатності переносити ICL,swell. В такому разі посилення струму та РВО може бути наслідком збільшення експресії білків ОРАК при набутті протиапоптичної стійкості.

Яким чином набрякання активує ICL,swell, не відомо, однак було показано, що два важливі фізіологічні параметри: зміна йонної сили в цитоплазмі (Nilius et al. 1998) та рівень цитозольного АТФ (Jentsch et al. 2001) модулюють активацію. На сьогодні домінуючою є думка про АТФ-залежність обємчутливого хлорного струму (Jentsch et al. 2001; Nilius et al. 2000; Okada 1997). Для багатьох типів клітин описана модуляція ICL,swell, внутрішньоклітинним АТФ. В клітинах Intestine 407 зниження концентрації вільного АТФ у внутрішньоклітинному розчині з 0,1 до 0,01 ммоль/л веде до лише незначного зниження інтегрального струму, в той час як застосування метаболічних інгібіторів (1 мкмоль/л FCCP, 1мкмоль/л йодацетату і 40 мкмоль л олігоміцину) майже повністю усуває ICL,swell (Oiki et al. 1994). Також повідомляється, що метаболічне вилучення АТФ з цитоплазми унеможливлює активацію обємчутливого хлорного струму в клітинах гліоми щура та гепатоцитах скату (Jackson et al. 1996), або спричинює спад індукованого набряканням струму в ендотеліальних клітинах людини (Nilius et al. 2000).

На противагу до низки літературних даних, наші результати показують, що в клітинах LNCAP вилучення АТФ з цитозолю разом з блокадою АТФ-синтезу лише незначною мірою знижує амплітуду ICL,swell. Очевидно, функції обємчутливих хлорних каналів дещо варіюють в різних типах клітин, а, можливо, такі відмінності вказують на існування різних типів каналів.

Дослідження впливу АТФ на ICL,swell виявили, що аналоги АТФ котрі не гідролізуються (ATPGS, AMP-PNP, b,g-метиленаденозин 5’- трифосфат), здатні заміняти внутрішньоклітинний АТФ в багатьох типах клітин. Так само, за відсутності Mg2 , потрібного для протеінкіназної активності, найчастіше ефект АТФ зберігається. Тобто, виявляється, що вплив АТФ на ICL,swell реалізується в більшості клітин без гідролізу, лише за рахунок звязування (Okada 1997).

За нашими даними, збільшення амплітуди обємчутливого хлорного струму в клітинах лінії LNCAP під дією АТФ спостерігається також і за відсутності магнію в цитозолі а, відтак, не потребує гідролізу. Зважаючи на літературні відомості, можна припускати, що і в клітинах раку простати для модуляції ICL,swell аденозинтрифосфатом потрібне звязування АТФ білком каналу чи допоміжними білками.

Щодо впливу внутрішньоклітинного Mg2 на ICL,swell, то на клітинах Intestine 407 було показано, що під дією вільного Mg2 прискорюється інактивація обємчутливого хлорного струму (Oiki et al. 1994). З підвищенням концентрації Mg2 в цитозолі при сталому рівні АТФ, потенціал-залежна інактивація струмів прискорюється і сталий рівень струму, що залишається після повної інактивації, - знижується. Цитоплазматичний Mg2 у вільному стані зсуває криву потенціалзалежності стаціонарної інактивацї ліворуч. Ці результати свідчать про те, що Mg2 є блокатором відкритих Cl- каналів, так само, як і у разі з катіонними каналами, такими як К канали внутрішнього випрямлення, Са 2 канали, Na , та глутаматні NMDA-рецептори) (Okada 1997; Oiki et al. 1994).

На користь гіпотези про блокування відкритих каналів внутрішньоклітинними катіонами (і в тому числі магнієм) говорить той факт, що інактивація ICL,swell в клітинах Intestine 407 сповільнюється внаслідок вимивання або виштовхування цих катіонів зростаючим потоком аніонів, котрі спрямовуються в клітину при збільшенні зовнішньоклітинної концентрації хлору (Oiki et al. 1994). Підтверджує ідею про блокування магнієм аніонних каналів у відкритому стані також спостереження того, що інактивація вихідних аніонних струмів в набряклих М-1 клітинах сповільнюється при використанні більш проникних порівняно з Cl- аніонів, таких як SCN-, I- і Br- (Meyer & Kobmacher 1996).

В наших результатах також спостерігається збільшення інактивації і зниження стаціонарного рівня обємчутливого хлорного струму під дією Mg2 . Таким чином, Mg2 в клітинах LNCAP, імовірно, теж впливає на ICL,swell як блокатор відкритих каналів.

Крім очевидного впливу Mg2 на інактивацію ICL,swell в клітинах карциноми простати людини ми спостерігали також зниження амплітуди інтегрального струму в присутності магнію.

АТФ-залежність дослідженого нами обємчутливого хлорного струму дозволяє припустити, що ICL,swell в клітинах карциноми простати буде реагувати на зміни метаболічного стану клітин. За патологічних умов, таких як, наприклад, ішемія, активація обємчутливих хлорних каналів значною мірою пригнічуватиметься не лише за рахунок зниження кількості АТР, але й внаслідок індукованого цим зниженням росту концентрації вільного Mg2 в цитоплазмі.

При регуляції обєму через обємчутливі аніонні канали крім виходу іонів хлору відбувається ще й вихід структурно різноманітних органічних осмолітів. Крім того, канал високопроникний для важливих метаболічних посередників, таких як піруват, коротколанцюжкові жирні кислоти, бутират, ацетат, кетонні тіла і деякі амінокислоти (Eggermont J. et al. 2001; Kirk et al. 1992). Ці метаболіти опосередковано входять до циклу трикарбонових кислот. Відтак, модуляція струму за допомогою АТФ може грати роль важливого фактора регуляторного зворотнього звязку в енергетичному метаболізмі. І хоча точні механізми АТФ-впливу на роботу обємчутливого хлорного каналу ще належить зясувати, безумовно, ця властивість каналу має виняткове патофізіологічне значення.