Оцінка впливу концентрацій кріопротекторів і режимів заморожування на пошкодження біологічних об"єктів в області субевтектичних температур. Їх кріоконсервування під захистом диметилсульфоксиду, гліцерину, поліетиленоксиду з середньою молекулярною масою.
Аннотация к работе
Оскільки фазові і фазово-структурні перетворення у біообєктах при їх низькотемпературному консервуванні є нерівноважними, вони не припиняються після досягнення температури евтектики: в області субевтектичних температур і упродовж наступного нагріву продовжуються зміни кількості льоду, розміру і форми кристалів, характеру перерозподілу рідинної фази у льоді, концентрації кріопротектора у міжкристалічних каналах, тощо [Matters G. et al., 1990; Осецкий А.И. и др., 1997; Boutron P. et al., 2000; Bischof J.C. et al., 2004]. Розробити методику визначення механічних характеристик заморожених водних розчинів ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500, розчинів ДМСО на середовищі 199 та розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ембріональної сироватки великої рогатої худоби (ЕС) вище області температур їх склування. Визначити порогові концентрації водних розчинів ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500, розчинів ДМСО на середовищі 199 і розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС, за яких відокремлені одна від одної рідинні включення перетворюються у наскрізні рідинні прошарки. Дослідити кінетику перебігу процесів, що відбуваються у заморожених кріозахисних розчинах кріопротекторів (ДМСО, гліцерин, ПЕО-1500) і у біологічних зразках нижче температури евтектики та в області температури склування цих розчинів. На основі отриманих даних оптимізувати режими кріоконсервування клітин Saccharomyces cerevisiae, клітин диплоїдної культури людини (КДКЛ) і клітин фібробластів людини (КФЛ) шляхом визначення оптимальних значень концентрацій кріопротекторних речовин у кріозахисному середовищі та швидкостей охолодження у субевтектичному інтервалі температур та інтервалі склування цих розчинів.Матеріалами для досліджень служили водні розчини ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500 з масовими концентраціями речовин 3, 5, 6, 7, 10, 15, 20% та від 20 до 100% з інтервалом у 5%, розчини ДМСО на середовищі 199 і розчини ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС з масовими концентраціями ДМСО 3, 5, 7 та 10%, дріжджові клітини S. cerevisiae, КДКЛ і КФЛ. Для цього водні розчини ДМСО та ПЕО-1500 різних концентрацій охолоджували зі швидкістю 4°С/хв до температури-160°С, при цій кінцевій температурі стабілізували їх протягом 10 хвилин і здійснювали навантаження на зразок, оптимальне значення якого підбиралося у ході конкретного експерименту. Після цього зразок нагрівали зі сталою швидкістю 1°С/хв і реєстрували термопластичну криву, тобто залежність деформації зразка від температури. За цією методикою досліджено пружнопластичну деформацію заморожених водних розчинів ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 з концентраціями 3, 5, 6, 7, 10, 15, 20 та 30%, а також розчинів ДМСО на середовищі 199 та розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС з концентраціями ДМСО 3, 5, 7 та 10%. Зразки охолоджували зі швидкістю 4°С/хв до температури, що перевищує температури склування цих зразків на 30°С, стабілізували їх при цій кінцевій температурі протягом 10 хвилин і потім здійснювали деформацію зразків.Наразі всебічно досліджено фізико-хімічні ефекти, що виникають на етапі від початку кристалізації біообєкту до евтектичних температур, тоді як пошкодження клітин в області субевтектичних температур майже не досліджувалось. Оскільки фазово-структурні переходи, які відбуваються в області субевтектичних температур, впливають на результат кріоконсервування і залежать від режимів охолодження - нагріву та складу кріозахисного середовища актуальним є вивчення перебігу нерівноважних фазових перетворень в області температур від температури евтектики до температури рідкого азоту та розробка нових підходів до оптимізації режимів охолодження біологічних обєктів у цій області температур. Визначено межі текучості, модулі зрушення та сумарне збільшення деформації повзучості заморожених водних розчинів ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500, розчинів ДМСО на середовищі 199 та ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС поблизу температур склування цих розчинів. Ці порогові концентрації для водних розчинів ДМСО, розчинів ДМСО на середовищі 199 та розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС складають 5% (мас/мас), а для водних розчинів ПЕО-1500 та гліцерину - 6 і 7% відповідно.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Вывод
Наразі всебічно досліджено фізико-хімічні ефекти, що виникають на етапі від початку кристалізації біообєкту до евтектичних температур, тоді як пошкодження клітин в області субевтектичних температур майже не досліджувалось. Оскільки фазово-структурні переходи, які відбуваються в області субевтектичних температур, впливають на результат кріоконсервування і залежать від режимів охолодження - нагріву та складу кріозахисного середовища актуальним є вивчення перебігу нерівноважних фазових перетворень в області температур від температури евтектики до температури рідкого азоту та розробка нових підходів до оптимізації режимів охолодження біологічних обєктів у цій області температур.
Визначено межі текучості, модулі зрушення та сумарне збільшення деформації повзучості заморожених водних розчинів ДМСО, гліцерину, ПЕО-1500, розчинів ДМСО на середовищі 199 та ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС поблизу температур склування цих розчинів.
Запропоновано новий підхід до визначення значень концентрацій розчинів кріопротекторів, за яких відокремлені одна від одної рідинні включення перетворюються у наскрізні прошарки між кристалами льоду. Ці порогові концентрації для водних розчинів ДМСО, розчинів ДМСО на середовищі 199 та розчинів ДМСО на середовищі 199 з додаванням 10% ЕС складають 5% (мас/мас), а для водних розчинів ПЕО-1500 та гліцерину - 6 і 7% відповідно.
Встановлено, що після заморожування та нагріву клітин S. cerevisiae та клітин культур людини (КДКЛ та КФЛ) з розчинами кріопротекторів спостерігається стрибкоподібне збільшення життєздатності клітин при досягненні концентрації ДМСО, ПЕО-1500 та гліцерину 5, 6 і 7% відповідно. Отримані результати вказують на існування загального механізму виявленого ефекту.
При кріоконсервуванні S. cerevisiae з водними розчинами ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 збільшення початкової концентрації кріопротектора у кріозахисному розчині від 3% до 5% для ДМСО, від 5% до 6% для ПЕО-1500, від 6% до 7% для гліцерину призводить до стрибкоподібного зростання життєздатності клітин на 25% для ДМСО, на 21% для ПЕО-1500 та на 18% для гліцерину.
Життєздатність клітин культур людини (КДКЛ та КФЛ) при кріоконсервуванні з розчинами ДМСО на середовищі 199 та ДМСО на середовищі 199 у присутності 10% ЕС стрибкоподібно збільшується у відсутності ЕС на 31% для КДКЛ та на 18% для КФЛ, а при додаванні 10% ЕС на 33% для КДКЛ та на 24% для КФЛ.
Розроблено оригінальний тензодилатометричний спосіб визначення кількості льоду та обємної частки зразка, що склується в процесі кристалізації кріозахисного середовища і залежності зміни концентрації кріопротектора у міжкристалічній рідині під час заморожування від температури.
Методом термопластичної деформації визначено субевтектичні інтервали температур водних розчинів кріопротекторів (ДМСО, гліцерин, ПЕО-1500), де підвищується імовірність механічного пошкодження біологічних обєктів за рахунок пластичної релаксації підвищеного тиску, який виникає у відокремлених одне від одного рідиннофазних включеннях, а також інтервали температур склування, де відбувається пошкодження біообєктів за рахунок термопружних напруг.
З урахуванням отриманих експериментальних даних оптимізовано режими охолодження клітин S. cerevisiae і встановлено, що життєздатність цих клітин після кріоконсервування їх з водними розчинами ДМСО, гліцерину та ПЕО-1500 підвищується, якщо перетин субевтектичного температурного інтервалу здійснюється зі швидкістю охолодження 20...25?С/хв, а перетин температурного інтервалу склування - зі швидкістю охолодження 1°С/хв.
Список литературы
1. Осецкий А.И. Изучение кинетики расстеклования водных растворов криопротекторов методом термопластической деформации / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М Гурина // Проблемы криобиологии. - 2005. - Т.15, № 2. - С. 137-146.
3. Кирилюк Г.Л. Теоретичне та експериментальне дослідження процесу льодоутворення в розчинах кріопротекторів методом тензодилатометрії / Г.Л. Кирилюк, В.І. Рєзников, Т.М. Гуріна // Біофізичний вісник. - 2006. - Вип.17(1). - С. 95-102.
4. Осецкий А.И. Применение метода пластической деформации для определения пороговых концентраций криопротекторных веществ при криоконсервировании Saccharomyces cerevisiae / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М. Гурина, И.П. Высеканцев // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т.17, № 1. - С. 71-79.
5. Осецкий А.И. О возможном механизме повреждения криоконсервируемых биологических объектов за счет пластической релаксации давлений в замкнутых жидкофазных включениях / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М Гурина // Проблемы криобиологии. - 2007. - Т.17, № 3. -
6. Гурина Т.М. Влияние пороговой концентрации криозащитного раствора на жизнеспособность клеток культур человека в процессе их криоконсервирования / Т.М Гурина, А.Л. Кирилюк, Т.Ф. Петренко, Е.И. Гончарук // Експериментальна і клінічна медицина. - 2008. - №1. - С. 81-84.
7. Гурина Т.М. Влияние контролируемых скоростей охлаждения при температурах ниже -30°С на жизнеспособность криоконсервированных дрожжей Saccharomyces cerevisiae / Т.М Гурина, А.Л. Кирилюк, И.П. Высеканцев // Медицина сьогодні і завтра. - 2008. - №1. - С.43-46.
8. Пат. України № 18660, МПК G 01 N 25/02 Спосіб дослідження розчинів охолоджуваних кріопротекторів / Рєзніков В.І., Кирилюк Г.Л.; заявник і патентовласник Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. - № u 2006 05586. заявл. 22.05.06; опубл. 15.11.06. Бюл. №11.
9. Пат. України № 26502 МПК G 01 N 25/02 Спосіб дослідження розчинів кріопротекторів при заморожуванні / Осецький О.І., Кирилюк Г.Л., Гуріна Т.М.; заявник і патентовласник Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. - № u 2007 05234. заявл. 14.05.07; опубл. 25.09.07. Бюл. №15.
10. Осецкий А.И. Особенности кинетики расстеклования замороженных криопротекторных растворов / А.И. Осецкий, А.Л. Кирилюк, Т.М. Гурина // Проблеми біологічної і медичної фізики: I Укр. наук. конф., 20-22 вересня 2004 р.: тези доп. - Х., 2004. - С. 122.
11. Кирилюк А.Л. Влияние колебаний температуры хранения в диапазоне -196°С…-100°С на жизнеспособность клеток с различной структурной организацией / А.Л. Кирилюк, Л.Г. Абрафикова, С.В. Казанжан // Холод в биологии и медицине: конф. молодых ученых ИПКИК НАН Украины, 17-18 мая, 2005 р.: тезисы докл. - Х., 2005. - С. 10.
12. Kyryliuk A.L. Physical substantiation of three-step freeze-thawing as optimal regimen for changing temperature during biological system cryopreservation / A.L. Kyryliuk, A.I. Osetsky, T.M. Gurina // Cryo-2006: 43rd Annual Meeting of the Society for Cryobiology, July 24-27, 2006 y.: abstract. - Hamburg, 2006. - Р. 15.
13. Высеканцев И.П. Роль контролируемых скоростей охлаждения в субэвтектическом температурном интервале при криоконсервировании криолабильных микроорганизмов / И.П. Высеканцев, Т.М. Гурина, А.Л. Кирилюк // Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии: VI Междунар. науч. конф., 2-6 июня, 2008 г.: материалы конф. - Минск, 2008. - С. 45-46.