Вплив катіонів лужноземельних і перехідних металів на функціонування мітохондрій печінки щурів - Автореферат

бесплатно 0
4.5 178
Вивчення механізмів дії катіонів металів, зокрема Ca2 , Sr2 , Mn2 , Cd2 і La3 , на дихання, ADP-фосфорилюючу і Са2 -акумулюючу функції мітохондрій печінки, та на стан неспецифічної проникності їх внутрішньої мембрани. Визначення ентальпії гідратації.


Аннотация к работе
Серед таких факторів одне з перших місць займають катіони металів, які характеризуються широким спектром патогенного впливу на організм людини i тварин. Проте більшість досліджень впливу катіонів металів на функціонування МХ носять фрагментарний характер i в основному повязані із вивченням кальційтранспортних функцій цих органел. Вивчити первинні механізми дії катіонів металів з різними фізико-хімічними властивостями (Ca2 , Sr2 , Mn2 , Cd2 , La3 ) на функціонування МХ печінки щурів. Ця мета досягалась вирішенням таких основних завдань: 1) зясувати механізми впливу катіонів металів на дихання МХ та транслокацію протонів через мембрану цих органел; 2) дослідити вплив металів на протонофор-стимульоване дихання МХ та фосфорилювання ADP цими органелами; 3) вивчити механізми впливу катіонів металів на Са2 -акумулюючу здатність МХ; 4) вивчити вплив катіонів металів на стан проникності внутрішньої мембрани МХ печінки та механізми цього впливу; 5) зясувати залежність ефектів катіонів металів на функціонування МХ від їх фізико-хімічних властивостей. У процесі досліджень отримано такі нові дані: 1) здатність катіонів металів стимулювати дихання МХ обумовлена їх енергозалежним транспортом у матрикс цих органел i характеризується оберненою кореляцією з ентальпією їх гідратації та спорідненістю до карбоксильних груп Са2 -уніпортера МХ; 2) вплив катіонів різних груп металів на дихання МХ не залежить від субстрату окислення; 3) здатність катіонів металів пригнічувати протонофор-стимульоване дихання МХ та фосфорилювання ADP цими органелами корелює з їх спорідненістю до SH-груп біолігандів; 4) катіони металів з високою спорідненістю до кисневмісних лігандів (Mn2 i ін.) інгібують транспорт Са2 у МХ за конкурентним типом, а катіони металів з високою спорідненістю до сірковмісних лігандів (Cd2 ) - за змішаним типом; 5) здатність катіонів металів інгібувати транспорт Са2 в МХ характеризується оберненою кореляцією з ентальпією їх гідратації та спорідненістю до карбоксильних груп Са2 -уніпортера; 6) катіони Са2 i Cd2 індукують перехід внутрішньої мембрани МХ у стан високої неспецифічної проникності за різними механізмами, проте шляхом формування одних i тих же пор; 7) катіони Sr2 i Mn2 пригнічують Са2 -індуковані зміни проникності внутрішньої мембрани МХ за конкурентним типом.Дослідження механізмів дії катіонів металів на функціонування МХ проводили в умовах in vitro. МХ ізолювали з печінки білих щурів методом диференціального центрифугування (Кондрашова, Григоренко, 1985). Дихання МХ вивчали полярографічним методом з використанням закритого електрода Кларка та кисневимірювального блоку ГФ-012 (НДІ біол. досліджень, Пущино, Росія). Середовище інкубації МХ містило (ммоль/л): сахароза - 150, KCL - 50, KH2PO4 - 1, tpic - 5, сукцинат - 0,35 (РН 7,4, t 26OC). Кальційакумулюючу функцію МХ вивчали з використанням радіоактивного ізотопу 45Ca2 (0,37 МБК/нмоль) у середовищі інкубації із зменшеною кількістю KH2PO4 (0,1 ммоль/л).Катіони La3 (50-400 мкмоль/л) не впливали на дихання МХ, а за відсутності у середовищі інкубації екзогенних фосфатів дещо пригнічували його. Дозова залежність швидкості виходу Н з МХ для катіонів Са2 , Sr2 i Mn2 (25-400 мкмоль/л) мала гіперболічний, а для катіонів Cd2 i La3 - куполоподібний характер. Разом з тим, пригнічення дихання МХ іонами La3 та куполоподібний характер дозової залежності ефектів Cd2 і La3 на вихід іонів Н з МХ печінки вказують на здатність цих металів взаємодіяти з іншими функціональними системами цих органел. Показано, що швидкість ADP-стимульованого дихання МХ (VADP, 200 мкмоль/л) після їх преінкубації з катіонами Са2 i Sr2 суттєво не відрізняється від VADP за відсутності в середовищі інкубації катіонів металів (34,66±0,33 нмоль О2/хв•мг білка) i становить відповідно 32,63?1,95 i 32,36?1,87 нмоль О2/хв•мг білка (P > 0,05). Встановлено, що катіони Sr2 (20-200 мкмоль/л), Cd2 i La3 (2-50 мкмоль/л), внесені у суспензію МХ одночасно з катіонами Са2 (30 мкмоль/л), пригнічують поглинання іонів Са2 цими органелами (рис.

План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Вывод
Вплив катіонів лужноземельних i перехідних металів на дихання мітохондрій та транслокацію протонів через мітохондріальну мембрану.

Відомо (Saris, Akerman, 1980), що катіони Са2 , Sr2 , Ba2 та Mn2 викликають стимуляцію дихання ізольованих МХ. Виявлений нами гіперболічний характер (рис. 1) дозової залежності ефектів Са2 , Sr2 , Mn2 та Cd2 (50-400 мкмоль/л) на дихання МХ печінки дозволив визначити константу напівнасичення (K0,5) та максимальну швидкість (Vmax) цього процесу методом лінеаризації у системі обернених координат Лайнуівера-Берка. Катіони La3 (50-400 мкмоль/л) не впливали на дихання МХ, а за відсутності у середовищі інкубації екзогенних фосфатів дещо пригнічували його. Інгібіторну константу (Ki) у цьому випадку визначали у координатах Уеба. Встановлено, що значення Vmax метал-стимульованого дихання МХ спадає у такому порядку: Катіони металів: Са2 > Sr2 > Cd2 > Mn2 >> La3

Vmax, нмоль О2/хв•мг білка: 35,71 33,90 26,32 22,02 9,04

K0,5 для досліджуваних металів та Ki для La3 , які характеризують чутливість МХ до катіонів металів утворюють такий ряд: Катіони металів: Cd2 < Ca2 << La3 < Sr2 < Mn2

K0,5, Ki (La3 ), мкмоль/л: 12,63 14,82 39,79 100,68 188,30

Вплив катіонів металів на швидкість дихання мітохондрій печінки (V, нмоль О2/хв•мг білка). а) Залежність швидкості дихання мітохондрій від концентрації катіонів металів ([Men ], мкмоль/л) у суспензії цих органел (пунктирна лінія - у середовищі інкубації відсутній екзогенний фосфат); б) вплив Ca2 , Sr2 , Mn2 (100 мкмоль/л) та Cd2 i La3 (50 мкмоль/л) на швидкість дихання мітохондрій під час окислення ними сукцинату (0,35 ммоль/л, заштриховані стовпчики) i ?-кетоглутарату (1 ммоль/л, темні стовпчики).

За здатністю стимулювати дихання МХ катіони металів утворюють аналогічний ряд під час окислення ними сукцинату (0,35 ммоль/л) i ?- кетоглутарату (1 ммоль/л) (див. рис. 1). Це свідчить, що вплив катіонів металів на дихання МХ мало залежить від субстрату окислення.

Відомо (Nicholls, Akerman, 1982), що енергозалежне поглинання Са2 мітохондріями супроводжується виходом із них Н . Зокрема, нами виявлено, що поглинання 55,99±7,47 нмоль Са2 МХ супроводжується виходом з цих органел 49,73±2,44 нмоль Н . Встановлено також, що катіони усіх досліджуваних металів стимулюють вихід Н з МХ печінки (рис. 2), що у випадку Са2 , Sr2 i Mn2 підтверджується даними інших авторів (Saris, Akerman, 1980). Дозова залежність швидкості виходу Н з МХ для катіонів Са2 , Sr2 i Mn2 (25-400 мкмоль/л) мала гіперболічний, а для катіонів Cd2 i La3 - куполоподібний характер. В цілому за здатністю стимулювати вихід Н з МХ (Vmax, нмоль Н /хв•мг білка) катіони металів утворюють такий ряд: Катіони металів: Ca2 > Sr2 >> La3 > Cd2 > Mn2

Vmax, нмоль Н /хв•мг білка: 990,10 800,00 166,95 108,39 95,15

Отриманий ряд аналогічний рядові металів, побудованому на основі їх здатності до стимуляції дихання МХ, за винятком іонів La3 , які у цьому ряді зміщуються вліво.

Для зясування ролі транспорту катіонів досліджуваних металів у матрикс МХ у реалізації їх впливу на функціонування цих органел нами була проведена серія дослідів з використанням неконкурентного інгібітора Са2 - уніпортера мітохондріальної мембрани - рутенію червоного. Показано, що рутеній червоний (10 мкмоль/л) зменшує сумарний вихід Н з МХ печінки, який стимульовали катіонами Са2 , Sr2 i Mn2 (100 мкмоль/л), відповідно на 97, 100 та 90% (P< 0,05). Проте рутеній червоний не впливав на сумарний вихід Н з МХ печінки, який стимулювали катіонами Cd2 i La3 (50 мкмоль/л), хоча зменшував його швидкість на 65 i 43% (P< 0,05). Це свідчить, що стимуляція дихання МХ та виходу з них Н катіонами Ca2 , Sr2 , Mn2 визначається їх транспортом в ці органели за участю Са2 -уніпортера. Куполоподібний характер дозової залежності ефектів Cd2 i La3 на вихід Н з МХ та неповне інгібування цього процесу рутенієм червоним свідчать, що він лише частково визначається їх транспортом у МХ через Са2 -уніпортер.

Таблиця 1 Кореляційний аналіз залежності кінетичних параметрів метал-стимульованого дихання мітохондрій від фізико-хімічних властивостей іонів металів.

Коефіцієнт кореляції, r

Кінетичні параметри дихання мітохондрій Іон. радіус, нм ?Но гідр, ккал/моль LGK1 метал-ацетат LGK1 метал-Asp LGK1 метал-Cys

Vmax, нмоль О2/ хв•мг білка -0,25 p=0,35 -0,95 p>0,98 -0,90 p=0,96 -0,84 p=0,93 -0,20 p=0,28

Примітка. р - вірогідність коефіцієнта кореляції.

Ряд металів, побудований на основі їх здатності до стимуляції дихання МХ, характеризується тісною оберненою кореляцією (табл. 1) з ентальпією гідратації катіонів металів (r = -0,95), та константами стійкості їх комплексів з ацетатом (r = -0,90) та аспарагіновою кислотою (r = -0,84). Це свідчить про важливу роль дегідратації катіонів металів та їх взаємодії з карбоксильними групами Са2 -уніпортера під час їх енергозалежної транслокації в матрикс МХ.

Таким чином, МХ печінки здатні до енергозалежної акумуляції катіонів Ca2 , Sr2 , Mn2 і Cd2 , швидкість якої визначається ентальпією гідратації катіонів металів та їх спорідненістю до СОО-груп Са2 -уніпортера МХ. Разом з тим, пригнічення дихання МХ іонами La3 та куполоподібний характер дозової залежності ефектів Cd2 і La3 на вихід іонів Н з МХ печінки вказують на здатність цих металів взаємодіяти з іншими функціональними системами цих органел.

Вплив катіонів перехідних i лужноземельних металів на протонофор-стимульоване дихання та ADP-фосфорилюючу здатність мітохондрій

Відомо, що швидкість дихання МХ, стимульованого протонофорами, зокрема n-трихлорметоксикарбонілціанідфенілгідразоном (CCCP) та 2,4-динітрофенолом (DNP), визначається інтенсивністю процесів окислення у дихальному ланцюгу цих органел. Нами встановлено, що CCCP (0,5 мкмоль/л) різко збільшує швидкість дихання МХ (VCCCP) після їх преінкубації з іонами Са2 , Sr2 та Mn2 (100 мкмоль/л) (рис. 3). У цьому випадку VCCCP мало залежала від виду катіонів металів (P > 0,05) i становила 57,40?2,51- 58,20?1,15 нмоль О2/хв•мг білка. Інкубація МХ з катіонами La3 (50 мкмоль/л) супроводжувалась суттєвим зниженням VCCCP до рівня 28.95?1.28 нмоль О2/хв•мг білка (P < 0,001). Разом з тим CCCP (0,5 мкмоль/л), а також DNP (1 мкмоль/л) не впливали на швидкість дихання МХ після їх взаємодії з катіонами Cd2 (50 мколь/л). Пригнічення протонофорстимульованого дихання МХ під впливом іонів Cd2 i La3 свідчить про здатність цих катіонів інгібувати процеси мітохондріального окислення. Інгібуючий ефект іонів Cd2 розвивається після попередньої стимуляції дихання, обумовленої їх енергозалежною акумуляцією в МХ.

Порушення мітохондріального окислення під впливом катіонів металів (50-100 мкмоль/л) суттєво позначається на процесах окисного фосфорилювання у МХ.

Показано, що швидкість ADP-стимульованого дихання МХ (VADP, 200 мкмоль/л) після їх преінкубації з катіонами Са2 i Sr2 суттєво не відрізняється від VADP за відсутності в середовищі інкубації катіонів металів (34,66±0,33 нмоль О2/хв•мг білка) i становить відповідно 32,63?1,95 i 32,36?1,87 нмоль О2/хв•мг білка (P > 0,05).

Преінкубація МХ з катіонами Mn2 та La3 супроводжувалась зменшенням VADP відповідно до 26,16?2,25 та 15,58?1,09 нмоль О2/хв•мг білка, тобто на 25 та 31% (P < 0,05). Інкубація МХ з катіонами Cd2 призводила до повного пригнічення ADP-стимульованого дихання цих органел. За здатністю пригнічувати протонофор- та ADP-стимульоване дихання МХ катіони металів утворюють такий ряд: Катіони металів: Са2 , Sr2 < Mn2 < La3 < Cd2

Зменшення VCCCP, %: 0 1 0 50 100

Зменшення VADP, %: 6 7 25 31 100

Інгібуючий ефект катіонів металів на VCCCP i VADP тісно корелює (r = 0,93 - 0,99) з константами стійкості комплексів цих металів з SH-групами цистеїну (табл. 2). Таким чином, катіони досліджуваних металів, зокрема Cd2 , La3 і частково Mn2 пригнічують процеси окислення і фосфорилювання в МХ печінки. Здатність катіонів металів пригнічувати процеси окислення і фосфорилювання в МХ визначається їх спорідненістю до сірковмісних лігандів цих органел.

Таблиця 2 Залежність інгібуючих ефектів катіонів металів на протонофор- та ADP-стимульоване дихання мітохондрій від їх фізико-хімічних властивостей

Параметри Коефіцієнт кореляції, r дихання мітохондрій Іон. радіус, нм ?Но гідр, ккал/моль LGK1 метал-ацетат LGK1 метал-Asp LGK1 метал-Cys

Зменшення VCCCP, % 0,15 p=0,22 0,32 p=0,59 0,67 p=0,81 0,66 p=0,75 0,93 p=0,98

Зменшення VADP, % -0,17 p=0,22 0,07 p=0,15 0,50 p=0,61 0,63 p=0,75 0,99 p>0,99

Примітка. р - вірогідність коефіцієнта кореляції.

Механізми дії катіонів лужноземельних і перехідних металів на калційакумулючу функцію мітохондрій

Відомо, що висока кальційакумулююча здатність МХ має важливе значення у підтриманні кальцієвого гомеостазу клітини (Gunter, Pfeiffer, 1990, Костерин, Бурдыга, 1993) та у регуляції функціонування цих органел (MCCORMACK et al., 1990). Встановлено, що катіони Sr2 (20-200 мкмоль/л), Cd2 i La3 (2-50 мкмоль/л), внесені у суспензію МХ одночасно з катіонами Са2 (30 мкмоль/л), пригнічують поглинання іонів Са2 цими органелами (рис. 4).

Дозова залежність ефектів катіонів Sr2 , Cd2 i La3 мала експоненціальний характер. Катіони Mn2 у концентраціях 10-50 мкмоль/л також пригнічували поглинання кальцію мітохондріями печінки. Проте збільшення концентрації іонів Mn2 у суспензії МХ в діапазоні 50-200 мкмоль/л супроводжувалось зменшенням їх інгібуючого впливу на поглинання іонів Са2 мітохондріями. Подібний ефект був відмічений і іншими авторами (Hughes , Exton , 1983, Allshire et al., 1985) які виявили здатність іонів Mn2 стимулювати поглинання Са2 МХ печінки щурів та мозку морської свинки. Ймовірно, іони Mn2 у високих концентраціях здатні взаємодіяти з катіонзвязуючими групами Са2 -уніпортера, що супроводжується модифікацією його провідності.

Лінії дозової залежності інгібуючих ефектів катіонів Sr2 , Mn2 та La3 на поглинання Са2 мітохондріями у координатах Уеба перетинають вісь ординат у точках, близьких до одиниці (рис. 5). Це вказує на конкурентний тип інгібування цими катіонами транспорту Са2 у МХ. У випадку з іонами Cd2 координати точки перетину отриманої лінії з віссю ординат значно відрізняються від одиниці, що свідчить про інший тип інгібування.

Кінетичний аналіз інгібуючого впливу катіонів металів на поглинання Са2 мітохондріями печінки в системі координат Уеба (а) та Лайнуівера-Берка (б). а) 1/[Men ] - обернені величини концентрації катіонів металів у суспензії мітохондрій, V0/(V0-Vi) - обернені величини частки неінгібованої швидкості поглинання Са2 мітохондріями; б) 1/[Ca2 ] - обернені значення концентрацій катіонів Са2 у суспензії мітохондрій; 1/V - обернені значення швидкості поглинання кальцію мітохондріями.

Визначення типу інгібування катіонами Cd2 транспорту Са2 в МХ проводили графічним методом у координатах Лайнуівера-Берка. Для порівняння у цій системі координат був оцінений тип інгібування поглинання Са2 мітохондріями катіонами Mn2 . Виявлене під впливом Mn2 (50 мкмоль/л) збільшення К0,5 поглинання Са2 мітохондріями з 56,99 до 113,68 мкмоль/л та відсутність суттєвих змін Vmax цього процесу підтверджує конкурентний характер інгібування. Під впливом Cd2 (10 мкмоль/л) К0,5 поглинання кальцію МХ збільшувалась з 56,99 до 67,37 мкмоль/л, а Vmax цього процесу зменшувалась з 913,79 до 532,50 нмоль Са2 /хв•мг білка, що вказує на змішаний тип інгібування. Можливим механізмом цього є виявлене нами пригнічення під впливом іонів Cd2 процесів окислення у дихальному ланцюгу МХ.

Порівняння інгібуючого впливу катіонів металів на кальційакумулюючу здатність МХ проводили на основі інгібіторних констант (Ki), які визначали методом лінеаризації експоненціальних кривих доза-ефект в координатах Уеба (див. рис. 5). Для порівняльного аналізу була використана також Ki транспорту Са2 в МХ іонами Ва2 , визначена К.Акерманом із співавторами (Akerman et al, 1977). Встановлено, що за зменшенням інгібуючого впливу на поглинання кальцію мітохондріями (Кі, мкмоль/л) катіони металів утворюють такий ряд: Катіони металів: La3 < Cd2 < Mn2 < Sr2 < Ba2

Ki, мкмоль/л: 2,11 10,36 49,29 66,43 70,00

Отриманий ряд характеризується тісною оберненою кореляцією (табл. 3) з ентальпією гідратації (r = -0,78) іонів металів та константами стійкості їх комплексів з карбоксильними групами ацетату (r = -0,96) та аспарагінової кислоти (r = - 0,91). Це вказує на важливу роль процесів дегідратації катіонів металів та їх взаємодії з карбоксильними групами Са2 -уніпортера у механізмах транслокації Са2 через мембрану МХ та у пригніченні цього процесу катіонами металів. На користь цього свідчить високий вміст (24%) дикарбонових амінокислот у складі Са2 -транспортного глікопротеїну МХ серця бика (Миронова, Утешева, 1989).

Таблиця 3 Залежність інгібуючих ефектів катіонів металів на поглинання Са2 мітохондріями від фізико-хімічних властивостей іонів металів.

Кінетичні параметри Коефіцієнт кореляції, r інгібування поглинання Са2 мітохондріями Іон. радіус, нм ?Но гідр, ккал/моль LGK1 метал-ацетат LGK1 метал-Asp LGK1 метал-Cys

Ki поглинання Са2 , мкмоль/л -0,26 p=0,35 -0,78 p=0,90 -0,96 p>0,98 -0,91 p=0,97 -0,72 p=0,83

Примітка. р - вірогідність коефіцієнта кореляції.

Таким чином, катіони металів інгібують транспорт Са2 в МХ печінки за конкурентним (Sr2 , Mn2 , La3 ) та змішаним (Cd2 ) типом. Здатність катіонів металів інгібувати транспорт Са2 в МХ визначається ентальпією їх гідратації та спорідненістю до карбоксильних груп Са2 -уніпортера цих органел.

Вплив катіонів лужноземельних і перехідних металів на неспецифічну проникність внутрішньої мембрани мітохондрій

Відомо (Zoratti , Szabo, 1995), що нагромадження кальцію у МХ за певних умов призводить до переходу їх внутрішньої мембрани у стан високої неспецифічної проникності (ВНП), набухання цих органел, що супроводжується втратою ними здатності до окисного фосфорилювання. Поряд з тим дані про вплив катіонів металів на стан проникності мембрани МХ, що може бути одним із механізмів реалізації їх впливу на функціонування цих органел, обмежені. Нами встановлено, що індуковане Са2 (30-100 мкмоль/л) набухання МХ включає фази повільного (лаг-фаза) та швидкого набухання цих органел (рис. 6). Зменшення світлопоглинання суспензії МХ, що свідчить про їх набухання, досягало 0,178±0,003 од. екст/мг білка (P 0,05). Очевидно, що катіони Sr2 , Mn2 та La3 у досліджуваних концентраціях не викликають переходу внутрішньої мембрани МХ у стан ВНП.

Часова кінетика впливу катіонів металів (50 мкмоль/л) на світлопоглинання суспензії мітохондрій (?E520, од. екст./мг білка).

Катіони Cd2 у концентраціях 15 i 50 мкмоль/л суттєво змінювали кінетику Са2 -індукованого набухання МХ, наближаючи її до кінетики власного впливу (табл. 4). Так, катіони Cd2 (50 мкмоль/л) зменшували амплітуду Са2 -індукованого (30 мкмоль/л) набухання МХ з 0,178?0,003 до 0,076?0,005 од. екст./мг білка (P < 0,001), а також тривалість лаг-фази та загальну тривалість набухання. Відсутність адитивності ефектів іонів Ca2 i Cd2 на набухання МХ свідчить, що їх вплив реалізується через формування одних i тих же пор у мембрані цих органел. Проте особливості кінетики Са2 - i Cd2 -індукованого набухання вказують на різні механізми ініціації формування цих пор, в основі чого може лежати неодинакова спорідненість катіонів цих металів до карбоксильних i сульфгідрильних груп біолігандів.

Катіони Sr2 i Mn2 у концентрації 50-200 мкмоль/л суттєво пригнічували Са2 -індуковане набухання МХ (див. табл. 4). Інгібуючий ефект катіонів Sr2 i Mn2 збільшувався із зростанням їх концентрації у суспензії МХ. Так, катіони Mn2 у концентрації 50 мкмоль/л збільшували тривалість лаг-фази Са2 - індукованого (30 мкмоль/л) набухання МХ від 268,50±32,03 до 562,00±72,38 с (P < 0,01), а у концентрації 200 мкмоль/л повністю запобігали розвитку цього процесу. Аналогічні, хоча i менш виражені зміни, спостерігались під впливом іонів Sr2 . Інгібуючий вплив катіонів Sr2 i Mn2 на Са2 -індуковане набухання МХ зменшувався із збільшенням концентрації Са2 у середовищі інкубації. Так, катіони Mn2 у концентрації 100 мкмоль/л збільшували тривалість лаг-фази набухання МХ, індукованого Са2 у концентраціях 30 та 100 мкмоль/л, відповідно на 110 (P < 0,01) та 32% (P < 0,05).

Таблиця 4 Вплив катіонів металів на Са2 -індуковане набуханя мітохондрій печінки (M??m, n = 4)

Концентрація катіонів металів, мкмоль/л Відносні зміни обєму мітохондрій, ?Е520 од. екст./хв•мг білка Відносна швидкість набухання мітохондрій, ?Е520 од. екст. /хв•мг білка Загальна тривалість процесу, c Тривалість лаг-фази, c

Ca2 ,30 0,178±0,003 0,080±0,008 839,63 ±4,31 268,50±32,03

Ca2 ,100 0,166±0,004 0,099±0,008 750,69±43,67 258,60±31,74

Cd2 ,50 0,065±0,002 0,089±0,004 283,20±23,03 23,72±0,85

Ca2 ,30 Cd2 ,50 0,076±0,005 P10,05 376,50±19,19 P1<0,001 28,20±2,24 P1<0,001

Ca2 ,100 Cd2 ,50 0,090±0,007 P10,05 451,80±15,40 P1<0,001 31,00±1,00 P1<0,001

Ca2 ,30 Sr2 ,50 0,175±0,010 P1>0,05 0,038±0,004 P10,05

Ca2 ,30 Sr2 ,100 0,159±0,016 P1>0,05 P2>0,05 0,032±0,001 P1<0,01 P2<0,05 1241,00±32,05 P1<0,01 P2<0,01 440,25±62,85 P1<0,01 P2<0,05

Ca2 ,100 Sr2 ,50 0,163±0,007 P1>0,05 P3>0,05 0,058±0,005 P10,05 P30,05 P3>0,05

Ca2 ,30 Mn2 ,50 0,184±0,001 P1>0,05 0,099±0,017 P1>0,05 1115,00±32,79 P1<0,01 562,00±72,38 P1<0,01

Ca2 ,30 Mn2 ,200 0,008±0,001 P1<0,01 P2<0,01 Н а б у х а н н я в і д с у т н є

Ca2 ,100 Mn2 ,50 0,166±0,003 P1>0,05 P30,05 P3>0,05 891,75±41,33 P1<0,05 P3<0,01 341,25±30,10 P1<0,05 P3<0,05

Примітка. P1 - достовірність різниці показників Са2 -індукованого набухання мітохондрій у присутності та за відсутності у середовищі іонів металів; P2 - достовірність різниці показників Са2 -індукованого (30 мкмоль/л) набухання мітохондрій у присутності різних концентрацій іонів металів; P3 - достовірність різниці показників набухання мітохондрій, індукованого різними концентраціями Са2 (30 i 100 мкмоль/л) у присутності іонів металів.

Аналогічні зміни спостерігались під впливом Sr2 . Наведені результати свідчать про конкурентний характер пригнічення Са2 -індукованого збільшення неспецифічної проникності мембрани МХ катіонами Sr2 i Mn2 . В основі цього лежить, імовірно, пригнічення цими катіонами акумуляції катіонів Са2 мітохондріями та їх взаємодія з Са2 -звязуючими групами пороутворюючих білків мембрани МХ

Таким чином, катіони Са2 і Cd2 індукують перехід внутрішньої мембрани МХ у стан ВНП. Особливості кінетики Са2 - і Cd2 -індукованого набухання МХ свідчать про відмінність механізмів їх впливу на стан проникності мембрани цих органел, що, ймовірно, обумовлено їх неодинаковою спорідненістю до СОО- і SH-груп. Катіони Sr2 , Mn2 i La3 не індукують набухання МХ. Sr2 і Mn2 пригнічують Са2 -індуковані зміни проникності внутрішньої мембрани МХ за конкурентним типом.

В И С Н О В К И

1. Мітохондрії печінки здатні до енергозалежної акумуляції катіонів ряду лужноземельних (Ca2 , Sr2 ) i перехідних (Mn2 , Cd2 ) металів, що супроводжується стимуляцією їх дихання та виходом Н з цих органел. Катіони La3 (50-400 мкмоль/л) не змінюють, а у відсутності екзогенного фосфату частково пригнічують швидкість дихання мітохондрій, хоча і стимулюють вихід Н з цих органел.

2. Здатність катіонів металів стимулювати дихання мітохондрій (Vmax), обумовлена їх транслокацією в матрикс цих органел, визначається ентальпією гідратації катіонів металів та їх спорідненістю до карбоксильних груп Са2 -уніпортера мітохондріальної мембрани і спадає у такому ряді: Ca2 > Sr2 > Cd2 > Mn2 >> La3 .

3. Катіони Ca2 , Sr2 i Mn2 (100 мкмоль/л) не впливають, а катіони Cd2 i La3 (50 мкмоль/л) пригнічують дихання мітохондрій, стимульоване протонофорами (СССР, 0,5 мкмоль/л; DNP, 10 мкмоль/л), що свідчить про безпосереднє інгібування ними процесів окислення в дихальному ланцюгу цих органел. В цілому, здатність катіонів металів пригнічувати процеси окислення в дихальному ланцюгу мітохондрій збільшується у такому порядку: Са2 , Sr2 , Mn2 < La3 < Cd2 .

4. Катіони Mn2 (100 мкмоль/л), Cd2 i La3 (50 мкмоль/л) пригнічують ADP-стимульоване дихання мітохондрій, а катіони Са2 і Sr2 (100 мкмоль/л) не впливають на цей процес. Здатність іонів металів пригнічувати ADP-стимульоване дихання мітохондрій зростає в ряді: Са2 , Sr2 < Mn2 < La3 < Cd2 .

5. Здатність катіонів металів пригнічувати процеси окислення i фосфорилювання в мітохондрій визначається їх спорідненістю до SH- груп макромолекул дихального ланцюга цих органел.

6. Катіони Mn2 , Sr2 i La3 інгібують транспорт Са2 у мітохондрії за конкурентним, а катіони Cd2 - за змішаним типом. Інгібіторна константа (Ki, мкмоль/л) транспорту Са2 у мітохондрії для катіонів металів збільшувалась у такому порядку: La3 < Cd2 < Mn2 < Sr2 . Здатність катіонів металів інгібувати транспорт Са2 в мітохондрії значною мірою визначається ентальпією їх гідратації та спорідненістю до карбоксильних груп Са2 -уніпортера цих органел.

7. Катіони Са2 (30-100 мкммоль/л) i Cd2 (15-50 мкмоль/л) індукують перехід внутрішньої мембрани мітохондрій у стан високої неспецифічної проникності за різними механізмами, проте шляхом формування одних і тих же пор. Найбільш імовірно в основі цього лежить неодинакова спорідненість катіонів Са2 i Cd2 до карбоксильних i сульфгідрильних груп макромолекул мембрани мітохондрій.

8. Катіони Sr2 (50-100 мкмоль/л), Mn2 (50-200 мкмоль/л) та La3 (2-50 мкмоль/л) не індукують набухання мітохондрій печінки. Разом з тим вони пригнічують Са2 -індуковані зміни проникності внутрішньої мембрани мітоходрій за конкурентним типом. В основі цього лежить, імовірно, пригнічення цими катіонами акумуляції катіонів Са2 мітохондріями та їх взаємодія з Са2 -звязуючими групами пороутворюючих білків мембрани мітохондрій.

9. Катіони ряду лужноземельних (Ca2 , Sr2 ) i перехідних (Mn2 , Cd2 , La2 ) металів суттєво впливають на функціонування мітохондрій печінки, зокрема на дихання, ADP-фосфорилюючу та кальційакумулюючу функції мітохондрій, а також на стан проникності внутрішньої мембрани цих органел. Здатність катіонів металів взаємодіяти з різними функціональними системами мітохондрій неодинакова i визначається їх фізико-хімічними властивостями: ентальпією гідратації, спорідненістю до карбоксильних i сульфгідрильних груп макромолекул. Це створює можливості для направленого пошуку антидотів до металів з різною спорідненістю до кисне- і сірковмісних лігандів клітини.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦЇ

1. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С. Вплив катіонів перехідних металів на дихання i продукування Н мітохондріями печінки // Укр. біохім. журн. - 1996. - Т. 68, N 5. - С. 59-63.

2. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., Полотнюк С.Я. Роль кальційтранспортних систем i мітохондрій у порушенні екзоцитозу секреторних клітин шлунка катіонами перехідних металів // Актуал. пробл. медицини, біології, ветеренарії та сільського господарства. - Львів: Віче, 1997. - С. 59-62.

3. Вовканич Л.С., Дубицький Л.О. Вплив катіонів лужноземельних i перехідних металів на неспецифічну проникність внутрішньої мембрани мітохондрій // Експериментальна та клінічна фізіологія i біохімія. - 1998. - N 1. - С. 5-9.

4. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С. Дослідження впливу катіонів перехідних металів на Са2 -стимульоване дихання мітохондрій печінки щурів // Матеріали 1-го зїзду Українського біофізичного товариства. - Київ. - 1994. - С. 90 - 91.

5. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., Сабадаш Г.І. Дослідження впливу катіонів перехідних металів на функціональну активність секреторних клітин шлунка. // Тез. доп. XIV зїзду Українського фізіологічного товариства ім. І.П. Павлова. - Київ. - 1994. - С. 157.

6. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С. Дослідження адаптивних реакцій мітохондрій печінки щурів при інтоксикаціях металами // Мат. наук.-практ. симп. "Медико-біологічні проблеми адаптації в сучасних умовах існування організму" (14-16 березня 1995 р., м. Кузнецовськ). - Львів, 1995. - С. 19.

7. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., Сабадаш Г.І., Синюк З.В. Вплив катіонів перехідних металів на системи підтримання кальцієвого гомеостазу секреторних клітин шлунку // Експериментальна та клінічна фізіологія. - Львів, 1995. - С. 148-149.

8. Vovkanych L.S. Investigation of the mechanisms of metals` cations effect on respiration and H release of rat liver mitochondria // Book of abstracts of the 4-th International students` scientific conference. - Gdansk, 1996. - P. 6.

9. Vovkanych L.S., Dubitsky L.O. Investigation of the mechanisms of metals` cations effect on respiration of rat liver mitochondria // 9-th European bioenergetic conference. - August 17-22, EBEC Reports. - Biochim. Biophys. Acta. - 1996, V. 9. - P.192.

10. Дубицький Л.О., Вовканич Л.С., Полотнюк С.Я. Дослідження ролі кальційтранспортних систем в порушенні функціональнои активності секреторних клітин катіонами металів // Тез. доп. VII Укр. біохім. зїзду. - Київ, 1997. - С. 40-41.

11. Вовканич Л.С., Дубицький Л.О. Вплив катіонів металів на дихання та кальційтранспортні процеси у мітохондріях печінки щура // Матеріали XV зїзду Українського фізіологічного товариства (Донецьк, 1998). - Фізіол. журн. - 1998. - Т. 44, N 3. - С. 156.

Размещено на .ru
Заказать написание новой работы



Дисциплины научных работ



Хотите, перезвоним вам?