Вплив гуморальних факторів т-лімфоцитів на особливості функціонування клітин раку молочної залози за умов сфероїдного та моношарового росту - Автореферат

Роботу було виконано на базі кафедри біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка МОН України та Відділення біотехнічних проблем діагностики Інституту проблем кріобіології та кріомедицини НАН України (лабораторія маркерних сполук) в рамках планових науково-дослідних робіт Відділення, як фрагмент теми "Дослідження морфогенетичних (регулятивних) взаємовідносин в системі "пухлина-організм" (в експерименті)" (2005-2007р. р. № державної реєстрації 0103U006657) і теми "Дослідження можливостей спрямованого впливу на морфогенез клітинних сфероїдів in vitro." (2008-2012р. р. № державної реєстрації 0109U007089), а також в рамках цільової програми: "Наноструктурні системи, наноматеріали, нанотехнології” за темою "Дослідження проліферації пухлинних клітин лінії раку молочної залози MCF-7 за дії фулеренів С60 на моделі сфероїдного росту" (2008-2009 рр. № державної реєстрації 01008U003518). Визначити основні морфологічні, кінетичні та біохімічні показники функціонування клітин MCF-7 за умов 2 - D та 3-D росту та під впливом гуморальних чинників Т-лімфоцитів як клітин-ефекторів. Оцінити кінетичні параметри росту, показники адгезії клітин MCF-7 в умовах 2-D та 3-D росту та їх зміни під впливом Т-лімфоцитів. Рівень клітинної проліферації, життєздатність та стадій клітинного циклу визначалися за допомогою фарбування трипановим синім та підрахунку у камері Горяєва, МТТ-аналізу, протокової цитофлюорометрії; візуалізація культур клітин досягалася методами цитологічного забарвлення та мікрофотографування; визначення рівня продукції оксиду азоту проводилося за допомогою реакції Грісса; для визначення впливу умов мікрооточення на експресію естрогенового рецептора використовували імуноцитохімічне забарвлення. Це дозволило зафіксувати зменшення реактивності клітин MCF-7 в пухлинних мікроагрегатах, по відношенню до впливу гуморальних факторів від клітин імунної системи та підвищення виживаності клітин у БПС, порівняно з моношарової культурою MCF-7.В клітинах виявлено рецептори до естрогенів, синтезується естрадіол. Клітини культивувалися в моношаровій (2-D) культурі. Клітини MCF-7 культивували у повному поживному середовищі DMEM (Sigma, США). Для визначення ролі факторів мікрооточення на основні показники функціонування клітин MCF-7 за умов моношарового та сфероїдного росту Т-лімфоцити (МТ-4 та донорські лімфоцити) висаджували в нітроцелюлозні камери (Sigma, США, розмір пор 0,2мкм), котрі в подальшому переносили у лунки з клітинами MCF-7 для співкультивування. Для визначення розподілу клітин за фазами циклу, рівня апоптозу та проліферативної активності на всіх термінах культивування клітин використовували метод протокової цитофлуориметрії, за методикою Nicoletti et al.Продемонстровано, що Т-лімфоцити, через систему гуморальних сигналів (цитокінів, хемокінів) здатні підвищувати проліфераційний, метастатичний та клоногенний потенціал клітин раку молочної залози в пухлинному мікровузлі. В роботі відпрацьовано культивування та визначення параметрів розвитку клітинних моделей моношарового та сфероїдного росту, системи "безконтактного" співкультивування клітин MCF-7 та Т-лімфоцитів. Встановлено, що проліферативна активність, виживаність клітин та адгезивна здатність клітин у 2-D та 3-D культурах in vitro мають достовірні розбіжності вже після першої доби культивування. При цитофлуориметричному дослідженні було виявлено, що під впливом Т-лімфоцитів у багатоклітинних сфероїдах достовірно (р ? 0,01) знижується частка апоптичних клітин та клітин у S фазі (р <0,05).

Основний зміст роботи

Продемонстровано, що Т-лімфоцити, через систему гуморальних сигналів (цитокінів, хемокінів) здатні підвищувати проліфераційний, метастатичний та клоногенний потенціал клітин раку молочної залози в пухлинному мікровузлі.

1. В роботі відпрацьовано культивування та визначення параметрів розвитку клітинних моделей моношарового та сфероїдного росту, системи "безконтактного" співкультивування клітин MCF-7 та Т-лімфоцитів.

2. Встановлено, що проліферативна активність, виживаність клітин та адгезивна здатність клітин у 2-D та 3-D культурах in vitro мають достовірні розбіжності вже після першої доби культивування. Гуморальні фактори Т-лімфоцитів стимулюють моношарову культуру до інтенсивної проліферації, зниження адгезивних контактів з субстратом та падіння виживаності. Натомість сфероїдна культура, навпаки, під впливом зазначених факторів, втрачає проліферативний потенціал, збільшується її адгезивна фракція, а виживаність залишається на рівні контролю.

3. При цитофлуориметричному дослідженні було виявлено, що під впливом Т-лімфоцитів у багатоклітинних сфероїдах достовірно (р ? 0,01) знижується частка апоптичних клітин та клітин у S фазі (р < 0,05). На противагу, частка клітин у фазі G0/G1 збільшується. Одночасно в 2-D культурі, в контролі, спостерігається перерозподіл клітин на користь синтетичної фази (52%), а в присутності Т-лімфоцитів збільшується частка клітин у G0/G1 фазі.

4. Встановлено, що контрольні концентрації іонів NO для багатоклітинних сфероїдах є цитотоксичними для моношарової культури. Для сфероїдів контрольні показники вищі та знаходяться у діапазоні 17,5-18,0 нмоль/л, для моношару - 8,5-9,0 нмоль/л. Причому виживаність клітин MCF-7, у цих діапазонах, має зворотну залежність від концентрації NO. Співкультивування з Т-лімфоцитами призводить до зниження загального рівня міжклітинного NO та підвищення проліферативного потенціалу пухлинних клітин.

5. За результатами імуноцитохімічного фарбування відмічено суттєве посилення експресії ЕР клітинами MCF-7 в моношарі при додаванні К-середовища від МТ-4, активованих імуногенними препаратами.

1. Perepelitsyna O.M. Formation of Multicellular Aggregates under Different conditions of microenvironment / Perepelitsyna O. M., Garmanchouk L. V., Sydorenko M. V., Ostapchenko L.I. // Cytology and genetics. - 2010. - Vol.44, №1. - P. 19-22. (Особистий внесок здобувача: культивування клітин у моделі багатоклітинних сфероїдів, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.)

2. Perepelitsyna O.M. Growth Kinetics of 2 - and 3-D Cell Models as Influenced by the Microenviroment / Garmanchouk L. V., Perepelitsyna O. M., Sydorenko M. V., Ostapchenko L.I. // Cytology and genetics. - 2009. - Vol.43, №.5. - P.305-310. (Особистий внесок здобувача: культивування 2-D та 3-D клітинних модлей, співкультивування з Т-лімфоцитами, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.)

3. Perepelitsyna O.M. Reactivity and sensibility of breast adenocarcinoma (MCF-7) in coculture depends on architecture of cells model / Perepelitsyna O. M.,Garmanchouk L. V., Sydorenko M. V., Ostapchenko L.I. // Physics of the Alive - 2008. - Vol.16, № 2. - P.105-111. (Особистий внесок здобувача: культивування 2-D та 3-D клітинних модлей, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.)

4. Перепелиціна О.М. Влияние гуморальных факторов, продуцируемых Т-лимфоцитами, на пролиферацию и выживаемость клеток MCF-7/Перепелиціна О.М., Гарманчук Л.В., Кобельська О.С., Сидоренко М.В. // Імунологія та алергологія. - 2008. - № 2. - С.88-90. (Особистий внесок здобувача: культивування Т-лімфоцитів, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.)

5. Перепелиціна О.М. Сравнительное изучение иммунокорригирующего действия нейропептидных препаратов при острой эксперементальной цереброваскулярной патологи /А.Е. Кульчиков, О.С. Моложавая, О.В. Скачкова, Л.В. Гарманчук, М.В. Сидоренко, Е.М. Перепелицына, Н.Н. Храновская, А.Н. Макаренко // Цитокины и воспаление. - 2009. - №3. - С 18-23. (Особистий внесок здобувача: культивування Т-клітин з імунокоригуючими препаратами, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.).

6. Перепелиціна О.М. Цитопротекторное действие нейропептидов на иммунокомпетентные клетки (исследование in vitro) /Гарманчук Л.В., Перепелицына Е.М., Сидоренко М.В., Макаренко А.Н., Кульчиков А.Е. / Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т.79,№ 4. - С 28-32. (Особистий внесок здобувача: культивування імунних клітин, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні статті.).

7. Перепелиціна О.М. Патент на корисну модель "Спосіб тестування біологічно активних сполук на їх придатність як лікарських засобів”/ Перепелиціна О.М., Гарманчук Л.В., Сидоренко М. В // № 35037, від 26.08.08. (Особистий внесок здобувача: культивування 2-D та 3-D клітинних модлей, вимірювання виживаності та кількості живих клітин, мікрофотографування, статистична обробка результатів та участь у написанні патенту.)

8. Perepelytsina O.M. Development of multicellular tumor spheroids of breast adenocarcinoma (MCF-7) under influences of T-lymphocytes / Perepelytsina O., Garmanchouk L., Nepiyvoda K., Gergeliuk T., Ostapchenko L., Sydorenko M. // Int. conference "Tumor and host”. - 2010. - V.32, supplement, p.32.

9. Perepelytsina O.M. Immunotherapy and development of the culture breast cancer / O. M. Perepelytsina, L. V. Garmanchouk, M. V. Sidorenko, O. S. Kobelska, N. J. Spivak, A. N. Makarenko // Annals of Oncology. - 2009. - Vol. 20. - supplement 2, P.85.

10. Perepelitsyna O.M. Indirect influence of cocultures MT-4 on multicellular spheroids of breast adenocarcinoma (MCF-7) / Perepelitsyna O. M.,Garmanchouk L. V., Sydorenko M.V. // UICC08, World cancer congress. - 2008. - POS-B146.