Розгляд процесів мутагенезу під впливом екзогенних послідовностей вірусного та клітинного походження. Особливості експресії ранніх регуляторних генів, що стимулюють реплікації та злоякісну трансформацію клітин. Дестабілізація генетичних елементів.
Аннотация к работе
Регуляція мутаційного процесу в клітинах вищих еукаріот при дії екзогенних біологічних чинників є однією з найактуальніших і найменш вивчених проблем, що мають загальнобіологічне значення. Ці дослідження були пізніше відзначені в книзі "Непостійність геному" (Хесін, 1984) та в журналі "Trends in genetics" (Sassone-Corsi, 1986) як новий напрямок, присвячений дослідженню мутагенної активності трансформуючих вірусних генів та їх регуляції. Дисертаційна робота Лукаш Л.Л. відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу генетики людини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України: бюджетні теми "Вивчення частоти мутацій, що знову виникають, у дітей та в модельних системах" (№ держ. реєстрації 80061026, 1980-1982 рр.), "Оцінити генетичні ефекти впливу ряду біологічних факторів забруднення оточуючого середовища на людину та в модельних системах" (№ держ. реєстрації 01.83.0005627, 1983-1987 рр.), "Вивчити можливу трансформуючу та мутагенну дію генноінженерних конструкцій, що містять гени людини" (№ держ. реєстрації 01.88.0081989, 1988-1992 рр.), "Розробка експериментальних підходів до захисту геному людини від токсичних та мутагенних дій з використанням модельних систем" (№ держ. реєстрації 0193U026687, 1993-1997 рр.). Частково робота виконувалась в рамках отриманих на конкурсних засадах вітчизняних та міжнародних проектів: "Регуляція мутаційного процесу в клітині" (програма "Фонд фундаментальних досліджень" ДКНТ України, шифр 5.2/22, 1993-1994 рр.), "Комплексна оцінка частоти мутацій в геномі ссавців і розробка засобів їх захисту від шкідливих дій" (програма "Захист генофонду населення України", ДКНТ України, шифр 1.01.01/041-92, 1992-1995 рр.), "Розробка способу одержання білків людини (інсулін та інш.) в культурі клітин ссавців (программа "Біотехнологія", ДКНТ України, шифр 1.11.04/012-92, 1992-1995 рр.), гранти DHHS CA21253 (V.M.M.), CA18137 (A.E.P.) та CA47228 (M.E.D.) від Національного Інституту Рака, США. 5) Вивчити вплив на мутаційний процес в системі екзогенна ДНК - клітина нестабільного генетичного елемента Alu з області помірних повторів геному людини, де локалізуються сайти переважної інтеграції ДНК-вмісних вірусів;Рекомбінантні ДНК, що містять геном вірусу гепатиту В, ген препроінсуліну та Alu-повтор геному людини (всього 10 препаратів) надано з відділу регуляторних механізмів клітини ІМБІГ НАНУ. Множинність інфікування клітин вірусами становила від 0,01 до 80,00 БУО/кл., а діапазон концентрацій ДНК у різних експериментах - від 0.5 до 10 мкг/мл (10-700 тисяч молекул на клітину). Якщо це так, то індукований мутагенез в системі аденовірус - клітина безпосередньо залежить від рівня експресії вірусних генів і дії регуляторних чинників, що його змінюють. Показано, що аденовіруси з різними онкогенними та інфекційними властивостями здатні трансформувати клітини гризунів in vitro та спричиняти статистично достовірне підвищення частоти мутацій в унікальних послідовностях клітинної ДНК (на прикладі трьох генних локусів), та областях помірних ДНК-повторів (хромосомні розриви) в ранні терміни після інфікування. Таким чином, нами було доведено, що в непермісивних для аденовірусу клітинах мутагенний ефект залежить від експресії та взаємодії системи ранніх оперонів Е1А, Е1В та Е4, які відповідають за злоякісну трансформацію клітин.Сформульовано і експериментально обгрунтовано концепцію регуляції мутаційного процесу під впливом екзогенних нуклеотидних послідовностей вірусного та клітинного походження в соматичних клітинах ссавців на підставі узагальнення літературних і власних даних. Додатковим чинником мутагенезу, який підвищує ймовірність прояву мутацій, є відтягування репаративних та інших ДНК-звязуючих ферментів на взаємодію з молекулами генетичної матриці екзогенного походження. Вперше розроблено і апробовано комплексний методичний підхід: конструювання модельних систем екзогенна ДНК - клітина з використанням регуляторних факторів (генетичні елементи, пухлинний промотор ТРА, нуклеотидтрифосфати), для вивчення онкогенних та мутагенних властивостей екзогенних нуклеотидних послідовностей, а також механізмів їхньої дії.
План
2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Вывод
1. Сформульовано і експериментально обгрунтовано концепцію регуляції мутаційного процесу під впливом екзогенних нуклеотидних послідовностей вірусного та клітинного походження в соматичних клітинах ссавців на підставі узагальнення літературних і власних даних. Первинним чинником індукованого мутаційного процесу в системі аденовірус - клітина є експресія ранніх регуляторних генів, відповідальних за стимуляцію реплікації і злоякісну трансформацію клітин. Вторинним чинником дестабілізації є перепрограмування клітинного геному (зміна активності та мутації клітинних генів, транспозиції мобільних генетичних елементів) під впливом експресії вірусних генів та інтеграції їх з хромосомною ДНК. Додатковим чинником мутагенезу, який підвищує ймовірність прояву мутацій, є відтягування репаративних та інших ДНК-звязуючих ферментів на взаємодію з молекулами генетичної матриці екзогенного походження.
2. Вперше розроблено і апробовано комплексний методичний підхід: конструювання модельних систем екзогенна ДНК - клітина з використанням регуляторних факторів (генетичні елементи, пухлинний промотор ТРА, нуклеотидтрифосфати), для вивчення онкогенних та мутагенних властивостей екзогенних нуклеотидних послідовностей, а також механізмів їхньої дії. На прикладі фізичних, хімічних та біологічних чинників продемонстровано, що ТРА вибірково підсилює мутагенний ефект тільки тих із них, що мають канцерогенну активність.
3. Встановлено, що біологічно активні аденовіруси, здатні до злоякісної трансформації клітин in vitro, спричиняють статистично достовірне підвищення частоти генних мутацій та хромосомних аберацій: а) вперше показано, що аденовірус є комплексним мутагеном, результуючий мутагенний ефект якого в непермісивних клітинах визначається взаємодією ранніх регуляторних оперонів: Е1А, Е1В та Е4;
б) максимальний мутагенний ефект виявляється при введенні у клітини in vitro повної трансформуючої області Е1 BAV3-3 у віддалені строки після трансфекції і збігається у часі (3 тижні) з проявом пухлиноутворення при тестуванні трансформованих клітин на сингенних мишах in vivo;
в) різниця в онкогенності та мутагенності досліджуваних аденовірусних клонів BAV3-1 та BAV3-3, можливо, повязана з внутрішньою гетерогенністю їх популяцій внаслідок відбору і домінування вірусних часточок з різним рівнем експресії онкогена при культивуванні інфікованих клітин за різних умов.
4. Мутагенна активність раннього оперону Е1В (клоновані фрагменти геному BAV3-1 та BAV3-3) корелює з проявом онкогенної активності і залежить від регуляторних чинників, що впливають на рівень його експресії: присутності енхансера і оперону Е1А, довжини нестабільної нуклеотидної послідовності між оперонами Е1А та Е1В і дії пухлинного промотору ТРА.
5. Мутаторна природа раннього оперону Е1В BAV3-3, відповідального за здатність клітин до пухлиноутворення, остаточно підтверджується в експериментах щодо встановлення мутаційного темпу в популяції трансформованих клітин, що містять інтегровані вірусні послідовності, за допомогою флуктуаційного тесту.
6. Показано, що регуляторні гени вірусів (ранні оперони аденовірусу, онкогени ретровірусів, ген тимідинкінази вірусу герпесу), і нуклеотидні послідовності клітинного похождення (ген препроінсуліну, Alu-елемент геному людини), які односпрямовано стимулюють реплікацію та інші матричні процеси на клітинній ДНК, можуть підвищувати при цьому рівень мутацій і підсилювати мутагенну дію один одного.
7. Часткова інактивація екзогенної ДНК за допомогою алкілування призводить до зниження, а повна - до втрати мутагенності. В той же час присутність чужорідної матриці, що є відволікаючим субстратом для ДНК-звязуючих ферментів, у першу чергу репаративних мутагенів: а) порівняно з молекулами активної ДНК алкіловані нуклеотидні послідовності, які є більш спорідненим субстратом до репаративного ферменту АГТ, призводять до значнішого підвищення мутагенного ефекту нітрозогуанідину; мутагенез вірусний генетичний б) максимальний синергідний ефект спостерігається при комбінованій дії на клітини О6-бензилгуаніну (практично повне пригнічення репаративної активності О6-алкілгуанін-ДНК-алкілтрансферази) та нітрозогуанідину;
в) одержано опосередковані дані (підвищена чутливість клітин гризунів порівняно з клітинами людини до комбінованої обробки), що свідчать про певну роль ексцизійної системи репарації в поновленні пошкоджень, індукованих нітрозогуанідином.
8. Молекулярний аналіз мутацій, індукованих нітрозогуанідином за умов активної та пригніченої репарації, дозволив виявити деякі особливості роботи ферменту АГТ: однакову ефективність стосовно ниток ДНК, що транскрибуються і не транскрибуються, і підвищену точність виправлення пошкоджень на ГЦ-багатих ділянках, які мають більш високу температуру плавлення і довше зберігають двониткову структуру.
9. Екзогенні ДНК вірусного та клітинного походження є розповсюдженими біологічними чинниками, що мають матричні властивості і здійснюють регуляторно-інформаційний вплив на мутагенез в соматичних клітинах ссавців. Це вказує на необхідність визначення ролі цих чинників в мінливості біосистем і на напрямок подальших досліджень механізмів регуляції мутаційного процесу за допомогою нуклеотидних послідовностей певної структури і функцій.
Список литературы
1. Лукаш Л.Л. Мутационный процес и злокачественная трансформация, индуцированные аденовирусами в клетках млекопитающих // Цитология и генетика. - 1986. - 20, №1. - С. 55-58.
2. Бужиевская Т.И., Лукаш Л.Л. Биологические мутагены окружающей среды // Генетические последствия окружающей среды. -Киев: Наукова думка, 1989. - С. 121-143.
3. Лукаш Л.Л. Взаимосвязь мутагенеза и злокачественной трансформации, эволюционные аспекты // Генетические последствия загрязнения окружающей среды. - Киев: Наукова думка, 1989. - С. 144-164.
4. Лукаш Л.Л. Мутагенез и злокачественная трансформация, вызванные онкогеном аденовируса // Мутагенное действие природных и синтетических полинуклеотидов. - Киев: Наукова думка, 1991. - С. 76-93.
5. Лукаш Л.Л. Мутагенез і антимутагенез - протилежно спрямовані процеси, що визначають рівень генетичної мінливості та стабільності // Биополимеры и клетка. - 1998. - 14, №6. - С. 500-511.
6. Lukash L.L., Buzhievskaya T.I., Varshaver N.B., Shapiro N.I. Oncogenic adenovirus as mutagen for Chinese hamster cells in vitro // Somatic Cell Genetics. - 1981. - 7, №2. - P. 133-146.
7. Чарикова Е.В., Лукаш Л.Л., Залманзон Е.С. Мутагенное действие высокоонкогенного бычьего аденовируса типа 3 (БАВ-3) // Биологические науки. - 1983. - №4. - С. 86-89.
9. Рубашевский Е.Л., Лукаш Л.Л., Бужиевская Т.И., Ландау С.М., Сасина Л.К., Стецяк Т.И. Мутагенность ДНК вируса простого герпеса и плазмиды PBR325tk // Доклады АН СССР. - 1984. - 279, №3. - С. 752-754.
10. Лукаш Л.Л., Кононенко Л.И., Бужиевская Т.И., Быкорез А.И., Шапиро Н.И. Усиление с помощью ТФА мутагенного и трансформирующего действия бычьего аденовируса типа 3 на культивируемые клетки мыши // Экспериментальная онкология. - 1985. - 7, №1. - С. 30-32.
11. Лукаш Л.Л., Варшавер Н.Б., Бужиевская Т.И., Шапиро Н.И. Роль онкогена в мутагенной активности бычьего аденовируса типа 3 // Биологические науки. - 1985. - №5. - С. 80-84.