Изучение внутри- и межпопуляционной генетической изменчивости вида с помощью RAPD- и STR-маркеров. Тип наследования микросателлитных маркеров в экспериментальных скрещиваниях русского осетра. Скрининг каспийской, азовской и черноморской популяций.
Аннотация к работе
Русский осетр (Acipenser gueldenstaedtii Brandt, 1833) относится к реликтовой группе хрящевых ганоидов, первые находки которых датируются верхнеюрским периодом (более 200 млн. лет). На сегодняшний день, русский осетр, как и другие 24 представителя отряда Acipenseriformes, отнесен к группе редких видов и включен в Приложение II CITES (Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna and Flora) (Raymakers, 2006). Катастрофическое снижение численности русского осетра в основном обусловлено интенсивным строительством гидротехнических сооружений, препятствующих проходу половозрелых особей к местам нереста, расположенным в верховьях рек. Восполнение численности русского осетра в значительной мере осуществляется за счет искусственного воспроизводства на рыбоводных заводах. Ранее проведенные исследования русского осетра выявили высокий уровень полиморфизма белков крови (Субботкин, 1987) и митохондриальной ДНК (Birstein, 2000; Корниенко и др.Примечание: жирным шрифтом выделены показатели, имеющие промежуточные значения при сравнении трех популяций. Сравнительный анализ, проведенный на основании данных многолетнего мониторинга размерно-возрастного состава азовской популяции и средних показателей размеров разных возрастных групп каспийской и черноморской популяций, выявил, что азовская популяция характеризуется достоверно более интенсивной скоростью роста (F - 0,93 и 1,10, соответственно, р <0,05). Сравнительная межпопуляционная оценка средних значений данных морфометрии, проведенная с помощью F-критерия Фишера, выявила существенное различие только между азовской и каспийской популяциями по единственному морфометрическому показателю - количеству лучей в спинном плавнике (D). Показатели изменчивости анализируемых групп русского осетра по RAPD-локусам, полученным с помощью пяти праймеров Результаты RAPD-анализа использовали для расчета эффективной численности популяций.Сравнительный анализ трех популяций русского осетра свидетельствует о высокой внутривидовой изменчивости основных морфометрических характеристик русского осетра, на фоне которых азовскую популяцию отличают пропорции головы (C/AL) и более интенсивная скорость роста, каспийскую - больший полиморфизм по всем изученным признакам. Результаты анализа геномной ДНК по RAPD-и STR-маркерам подтверждают высокий внутрипопуляционный полиморфизм русского осетра.
Вывод
Морфологический полиморфизм популяций русского осетра. Результаты морфометрического анализа азовской популяции в сравнении с каспийской и черноморской приведены в табл. 1.
Таблица 1. Сравнительная характеристика популяций A. gueldenstadtii по морфометрическим показателям
Показатель Популяции
Каспийская Азовская Черноморская
Число лучей в спинном плавнике (D) среднее значение 41,0 35,7 36,3* пределы 33-51 27-41 30-43
Число лучей в анальном плавнике (А) среднее значение 25,8 21,9 23,9 пределы 21-33 18-25 20-28
Число жаберных тычинок (GR) среднее значение 23,5 21,5 21,8 пределы 19-29 16-26 17-27
Колво спинных жучек (DS) среднее значение 12,1 11,9 12,0 пределы 9-18 8-15 9-15
Колво боковых жучек (LS) среднее значение 39,0 30,5 34,2 пределы 30-50 25-36 27-38
Колво брюшных жучек (VS) среднее значение 9,8 9,6 9,6 пределы 7-12 8-11 7-12
Отношение длины головы к абсолютной длине тела (С/AL), % 18,1 16,4 17,5
Примечание: жирным шрифтом выделены показатели, имеющие промежуточные значения при сравнении трех популяций. Значения показателей каспийской и черноморской популяции приводятся по (Берг, 1948; Подушка, 2003).
Самая большая из трех по численности каспийская популяция обладает большим размахом изменчивости по всем изученным признакам. По большинству морфометрических показателей черноморская популяция занимает промежуточное положение по отношению к каспийской и азовской выборкам (табл. 1). Сравнительный анализ, проведенный на основании данных многолетнего мониторинга размерно-возрастного состава азовской популяции и средних показателей размеров разных возрастных групп каспийской и черноморской популяций, выявил, что азовская популяция характеризуется достоверно более интенсивной скоростью роста (F - 0,93 и 1,10, соответственно, р < 0,05).
Сравнительная межпопуляционная оценка средних значений данных морфометрии, проведенная с помощью F-критерия Фишера, выявила существенное различие только между азовской и каспийской популяциями по единственному морфометрическому показателю - количеству лучей в спинном плавнике (D). Таким образом, полученные результаты показывают, что на практике использование классической морфометрии для идентификации популяционной принадлежности особей неэффективно.
Межпопуляционные различия русского осетра по RAPD-маркерам. Пример RAPD-профилей, полученных для двух нерестовых популяций (каспийской и азовской) русского осетра, приведен на рис. 1.
Рис. 1. Электрофореграмма RAPD-фрагментов русского осетра по праймеру 0РА07. 1-8 - особи азовской популяции, 9-16 - особи каспийской популяции, L - маркер молекулярной массы ДНК ?/PSTI (Fermentas)
Размеры проанализированных RAPD-фрагментов варьировали от 250 до 1000 пн. Общее количество RAPD-фрагментов по пяти использованным праймерам составило 295, из которых 22 являются мономорфными и, при сравнении с RAPD-профилями севрюги и стерляди, видоспецифичными. Среднее количество фрагментов на особь варьировало от 23,2 (ОРА-05) до 30,5 (ОРА-07). Анализ генетической изменчивости выборок русского осетра из азовской популяции, относящихся к поколениям 1978-1983 гг. и 1993-2000 гг., показал недостоверность различий (средние значения гетерозиготности - Hji 0,355 0,135 и 0,316 0,137, соответственно), что свидетельствует об отсутствии в популяции временного тренда.
Сравниваемые выборки каспийской и азовской популяций в целом имеют высокий уровень полиморфизма (табл. 2). Кластерный анализ (UPGMA), проведенный на основании RAPD-спектров, не выявил межпопуляционных различий. На фоне высоких значений внутрипопуляционного полиморфизма (Hji, Р) уровень межпопуляционной дифференциации оказался также недостоверным (FST= 0,011).
Таблица 2. Показатели изменчивости анализируемых групп русского осетра по RAPD-локусам, полученным с помощью пяти праймеров
Популяции Среднее значение t-критерий (Р<0.001)Уровень полиморфизма
Р, %Среднее значение гетерозиготности HJIДИСПЕР-сия
Var (Hji)
Азовская 0,813 5,809 92,3 0,379 0,060
Каспийская 0,799 93,6 0,396 0,059
Результаты RAPD-анализа использовали для расчета эффективной численности популяций. Оказалось, что для сохранения с 99%-ой вероятностью наиболее редкого RAPD-аллеля ( = 0,016) количество производителей, отбираемых для искусственного воспроизводства русского осетра, должно быть не менее 205.
Анализ наследования STR-маркеров русского осетра. Нами получены результаты анализа распределения генотипов в трех экспериментальных скрещиваниях русского осетра. Согласно полученным данным во всех вариантах скрещивания распределение комбинаций аллелей и их частоты у потомства соответствуют тетрасомному типу наследования (достоверность различий оценена с помощью критерия ?2).Пример наследования аллелей в экспериментальном скрещивании представлен на рис. 2.
Неполное совпадение опытного и ожидаемого распределения в отдельных случаях наиболее вероятно вызвано ограниченностью размеров выборки потомства. Учитывая менделеевские закономерности, распределение аллельных частот в F1 было использовано для уточнения генотипа гетерозиготных тетраплоидных родителей.
Рис. 2. Тетрасомный характер наследования в микросателлитном локусе Afug41. Генетический анализ экспериментального скрещивания BCDD x >ABDE (в центре) и генотипы полученного потомства (указаны для каждого F1). Каждый потомок наследует два любых аллеля одного родителя, и два другого в случайной комбинации.
Межпопуляционные различия русского осетра по STR-локусам. Данные микросателлитного анализа трех популяций русского осетра по четырем локусам представлены в табл. 3 и на рис. 3.
Анализ STR-спектров выявил в исследованной выборке в среднем более семи аллелей на локус. Все локусы оказались полиморфными. В сумме у проанализированных особей (n=540) в четырех локусах выявлено 74 аллеля. Число аллелей на локус в среднем варьировало от 11,5 (AOXD165) до 17,5 (Afug51). Каждая из исследованных популяций имела набор аллелей, достоверно различающихся по частотам (р<0.01). Исключение составил локус AOXD165, по которому не выявлено различий между каспийской и азовской популяциями.
Рис. 3. Распределение частот аллелей микросателлитных локусов в популяциях русского осетра. По осям абцисс - размеры аллелей, пн; по осям ординат - аллельные частоты, выраженные в долях с обозначением 95%-ных доверительных интервалов.
Таблица 3. Значения показателей межпопуляционной изменчивости русского осетра по микросателлитным локусам
Локус Число аллелей Гетерозиготность наблюдаемая, H0 Гетерозиготность ожидаемая, НЕ Коэффициент внутри выборочный FIS
Азовская популяция
An 20 11 0,940 0,969 0,033
Afug 41 15 0,986 0,998 0,010
Afug 51 13 0,730 0,999 0,267
AOXD 165 10 0,911 0,957 0,035
Среднее значение 0,892 0,096
Каспийская популяция
An 20 13 0,971 0,971 -0,000
Afug 41 23 0,995 0,999 0,005
Afug 51 18 0,837 0,998 0,155
AOXD 165 16 0,962 0,992 0,027
Среднее значение 0,941 0,046
Черноморская популяция
An 20 14 0,871 0,944 0,068
Afug 41 15 0,971 0,997 0,025
Afug 51 20 0,885 0,998 0,108
AOXD 165 9 0,796 0,934 0,080
Среднее значение 0,881 0,109
Значения наблюдаемой гетерозиготности (Н0) по микросателлитным локусам близки к ожидаемым (НЕ) в каспийской выборке и несколько занижены в азовской и черноморской (табл. 3). Наибольшее аллельное разнообразие по всем локусам выявлено в каспийской выборке. В результате тестирования данных микросателлитного анализа на соответствие равновесию Харди-Вайнберга в черноморской и азовской популяциях (FIS > 0) был выявлен дефицит гетерозигот. В азовской популяции снижение гетерозиготности, возможно, вызвано дрейфом генов, поскольку анализировали выборки, усредненные по многим генерациям. Каждое поколение формировалось искусственно относительно небольшим числом особей, используемых в качестве производителей на осетровых рыбоводных заводах. Этот же эффект вероятен и для черноморской выборки. Кроме того, так как она представлена двумя нерестовыми субпопуляциями - днепровской и дунайской, то в данном случае может иметь место эффект Валунда, характерный для выборок из генетически подразделенных популяций (Алтухов, 1997).
Таблица 4. Матрица значений FST (в верхней правой части таблицы) между выборками русского осетра и результаты вероятностного теста р на значимость различий (в левой нижней части таблицы).
Каспийская Азовская Черноморская
Каспийская - 0,070 0,058
Азовская 0,00024 - 0,043
Черноморская 0,00293 0,06641 -
Высокая вариабельность внутри популяций и тетраплоидная природа локусов определила небольшой уровень межпопуляционной изменчивости русского осетра (1,9%). Тем не менее, полученные значения генетических расстояний FST для каждой пары исследованных групп достоверно значимы (табл. 4). При этом межпопуляционные генетические различия в 4 - 7 раз превышают межгодовые различия между поколениями в азовской популяции.
Выявленное распределение аллельных частот в каждой популяции русского осетра было использовано для оценки эффективности популяционной идентификации особей. Для этого использовали выборки, полностью состоящие из особей одной популяции. Для каждой особи на основании наблюдаемого распределения аллельных частот в четырех локусах рассчитывали вероятность принадлежности к каждой из трех популяции. Наибольший показатель вероятности определял особь в соответствующую популяцию. В среднем, доля особей, принадлежность которых была определена корректно, составила 86%. Максимальная точность определения рассчитана для черноморской популяции - 96%, для каспийской популяции этот показатель составил 86%, для азовской - только 67%.
Следует отметить, что точность идентификации зависит от общего числа признаков (в нашем случае - аллелей). Ранее в исследовании популяционной принадлежности нерки по STR-маркерам было показано, что для достижения 80%-ной точности необходимо проанализировать не менее 80 аллелей (Beachem et al., 2002). Кроме того, разрешающая способность микросателлитного анализа зависит от степени полиморфизма локусов. В работе исследовали высокополиморфные маркеры. Для повышения корректности идентификации особей азовской популяции следует увеличить количество STR-локусов.
Определение BL и GUE митотипов. Ранее было показано, что около трети особей русского осетра из Каспийского моря имеют гаплотип, четко отличающийся от МТДНК, типичной для этого вида (Jenneckens и др., 2000; Мюге и др., 2008), и характеризующийся высокой гомологией с МТДНК сибирского осетра (A.baerii). По аналогии с латинским наименованием вида этот митотип был обозначен как «baerii-like» (BL). Мы провели массовый скрининг по данному митохондриальному маркеру и видоспецифичному для русского осетра GUE-митотипу в выборках трех популяций (табл. 5).
Таблица 5. Количество особей с митотипами «baerii-like» (BL) и видоспецифичным (GUE) в популяциях русского осетра.
Популяции Колво исследованных особей Колво особей с видоспецифичным (GUE) митотипом Колво особей с «baerii-like» (BL) митотипом абсолютное % абсолютное %
Частота встречаемости BL-особей в каспийской популяции была близка ранее показанной и составила 31%. В черноморской выборке во всех исследованных образцах BL-митотип отсутствовал. В азовской популяции из 759 исследованных рыб идентифицировано 14 BL-особей. Для определения происхождения BL-митотипа в Азовском море дополнительно были проанализированы выборки из полностью сменившихся поколений азовской и черноморской популяций, относящихся к генерациям естественного нереста. В этих группах (табл. 5) BL - маркер не обнаружен.
В настоящее время русский осетр обитает в пределах морей, весьма различающихся по экологическим особенностям, а его внутривидовая дифференциация связана с эволюцией трех морей. Известно существование распресненного водоема, располагавшегося в Азово-Черноморском бассейне, когда связь со Средиземным морем прекратилось в конце плейстоцена вследствие падения уровня Мирового океана 15-40 тыс. лет назад (Федоров, 1978; Свиточ и др., 1999). Азовское море в этот период исчезало и превратилось в низменную долину, пересекаемую рекой Дон. Отсутствие BL-митотипа в черноморской популяции свидетельствует о незначительности или отсутствии миграции русского осетра из Каспийского моря в бассейн Черного моря по существовавшему непродолжительное время в конце ледникового периода Кумо-Манычскому водосбросу. Последовавшая затем трансгрессия Черного моря, вызванная прорывом средиземноморских соленых вод через Босфор, и появление вследствие подъема уровня вод Азовского моря позволили сформироваться азовской популяции русского осетра из части черноморской популяции и закрепили изоляцию популяций русского осетра в северо-западной части Черного моря и в Азове.
На основании анализа результатов исследований можно высказать предположение, что дивергенция каспийской и черноморской популяций русского осетра предшествовала отделению азовской популяции, что объясняет промежуточное положение черноморских особей, как по морфометрическим показателям (табл. 1), так и по данным микросателлитного анализа (рис. 3).
Данные о распространении митохондриального BL-маркера (табл. 5) в современных популяциях и отсутствие его в Черном море позволяют сделать предположение о том, что появление осетров с BL-митотипом в Азовском море вероятнее всего произошло в 20 веке, когда проводилась интродукция каспийский осетровых в Азовское море (Реков, 2000), что подтверждается отсутствием маркера в выборке азовского осетра до 1960-х годов (до начала планомерного вселения осетра из Каспия).
Таким образом, генетическая структура русского осетра отражает историю формирования современного ареала вида, процессы расселения и изоляции его локальных популяций, вследствие геологических преобразований внутриевразийских водоемов. В то же время, появление осетров с BL-митотипом в азовской популяции связано с началом интродукции каспийских осетровых в Азовское море. Данные микросателлитного анализа свидетельствуют о наименьшем уровне генетической изменчивости азовской популяции, испытывающей на протяжении последнего столетия наибольшее антропогенное давление.1. Сравнительный анализ трех популяций русского осетра свидетельствует о высокой внутривидовой изменчивости основных морфометрических характеристик русского осетра, на фоне которых азовскую популяцию отличают пропорции головы (C/AL) и более интенсивная скорость роста, каспийскую - больший полиморфизм по всем изученным признакам.
2. Результаты анализа геномной ДНК по RAPD- и STR-маркерам подтверждают высокий внутрипопуляционный полиморфизм русского осетра. По результатам STR-анализа генетическое расстояние, определенное для азовской и каспийской популяций несколько выше (FST=0,070), чем генетические дистанции, отделяющие черноморскую от каспийской и азовской (FST=0,058 и 0,043 соответственно).
3. С помощью микросателлитного анализа родительских пар и поколения F1, полученного в результате экспериментальных скрещиваний, определен тетрасомный тип наследования использованных в работе STR-маркеров.
4. Исследованные маркеры микросателлитной и митохондриальной ДНК позволяют с высокой точностью определять принадлежность особей русского осетра к каспийской и черноморской популяциям (точность определения по данным STR анализа - 86 и 96% соответственно).
5. Распределение частот встречаемости «baerii-like» маркера митохондриальной ДНК дифференцирует популяции русского осетра. Обнаружение BL-маркера МТДНК в Азовском море и данные микросателлитного анализа свидетельствует об изменениях в сложившейся популяционной структуре и генном разнообразии русского осетра уже в исторический период в результате искусственного воспроизводства и интенсивного рыболовства.
Список литературы
1. Войнова Н.В., Чистяков В.А., Тимошкина Н.Н., Олейникова Н.Л., Соколова И.В., Брень А.Б. ДНКАЗНАЯ активность гомогенатов метаболически активных тканей русского осетра Acipenser gueldenstaedtii (Acipenseridae) как показатель пригодности тканей для генетического коллекционирования // Вопросы ихтиологии. 2001. Т. 41. №6. С. 842-845.
2. Корниенко И.В., Войнова Н.В., Чистяков В.А., Тимошкина Н.Н., Вечканов Е.М., Петров А.В. Полиморфизм первичной последовательности сегмента гена цитохрома b митохондриальной ДНК азовской популяции Acipenser gueldenstaedtii // Вопросы ихтиологии. 2003. Т. 43. №1. С. 73-77.
3. Черенкова И.Ф., Чистяков В.А., Тимошкина Н.Н., Соколова И.В. Интенсивность свободнорадикальных процессов в гомогенатах метаболически-активных тканей русского осетра Acipenser gueldenstaedtii (Acipenseridea) как показатель пригодности тканей для генетического коллекционирования // Вопросы ихтиологии. 2003. Т. 43. №1. С. 142-144.
4. Voynova N.V., Mirzoyan A.V., Timoshkina N.N., Rynza E.T. Occurrence of non-native specimens of Caspian origin within the Sea of Azov population of the Russian sturgeon (Acipenser gueldenstaedtii) // J. Appl. Ichthyol. 2008. V. 24. P. 50-51.
5. Чистяков В.А., Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т., Мирзоян А.В., Войнова Н.В. RAPD анализ генетического разнообразия азовской популяции севрюги (Acipenser stellatus) и русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii) // Вопросы рыболовства. 2008. Т 9. №4 (36). С. 797-801.
7. Небесихина Н.А., Тимошкина Н.Н. Патент №63172. Лабораторный стенд для инкубации икры рыб. Зарегистрировано в Госреестре полезных моделей РФ 27.05.2007.
8. Чистяков В.А., Мирзоян А.В., Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т. Способ хранения ДНК. Заявка №2007142152/13 (046147) от 20.10.2008. Дата приоритета 14.11.2007.
9. Рынза Е.Т., Тимошкина Н.Н., Мухоньков М.М. Видовая идентификация археологического материала осетровых рыб с помощью метода полимеразной цепной реакции // Сб. науч. тр. АЗНИИРХ (2004-2005 гг.) - Ростов-на-Дону: «МЕДИАПРЕСС». 2006. С. 289-292.
10. Тимошкина Н.Н., Небесихина Н.А. Сравнительный анализ морфометрических показателей современной азовской популяции русского осетра // Сб. науч. тр. АЗНИИРХ (2006-2007 гг.) - Ростов-на-Дону: «МЕДИАПРЕСС», 2008. (в печати).
11. Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т. Исследование влияния интродукции на генетическую структуру азовской популяции Acipenser gueldenstadtii // там же.
12. Тимошкина Н.Н. Идентификация «сибирского» митотипа в азовской популяции русского осетра // Материалы Межд. науч. конф. «Проблемы устойчивого функционирования водных и наземных экосистем». Ростов-на-Дону, 9-12 октября 2006 - Ростов-на-Дону: 2006. С. 424-425.
13. Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т., Усатов А.В. ДНК-идентификация «baerii-like» митотипа в азовской популяции русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii) // Сб. науч. тр. Съезда Украинского общества генетиков и селекционеров «Достижения и проблемы генетики, селекции и биотехнологии» - Киев: Логос. 2007. Т.1. С. 326-329.
14. Тимошкина Н.Н., Усатов А.В. Исследование полиморфизма микросателлитных локусов русского осетра // Сб. науч. тр. IX Съезда Белорусского общества генетиков и селекционеров, Гомель, Республика Беларусь 2-5 окт. 2007 - Минск: 2007. С 134-135.
15. Тимошкина Н.Н., Усатов А.В. Наследование микросателлитных маркеров у русского осетра (Acipenser gueldenstadtii) // Мат. конф. «Вавиловские чтения - 2007». Саратов, 26-30 ноября 2007 - Саратов: Научная книга. 2007. Ч. 1. С. 344-347.
16. Мирзоян А.В., Горбачева Л.Т., Тимошкина Н.Н., Чихачева В.П. Биологические основы сохранения русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii) азовской популяции // Материалы Второй Межд. научно-практ. Конф. «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов». Москва, 26-27 ноября 2008 - М.: изд-во ВНИРО. 2008. С. 206-208.
17. Тимошкина Н.Н., Барминцева А.Е., Мюге Н.С., Усатов А.В. Анализ генетического полиморфизма русского осетра (Acipenser gueldenstadtii) с помощью маркеров ядерной и митохондриальной ДНК // Мат. II Межд. науч. конф. «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» Ростов-на-Дону, 8-10 октября 2008 г. - Ростов н/Д: Изд-во ЮФУ. 2008. - С. 79-81.
18. Войнова Н.В., Тимошкина Н.Н., Чистяков В.А., Барминцев В.А., Абрамова А.Б., Чудинов О.С. Генетическая паспортизация производителей осетровых рыб // Тез. докл. междунар. конф. «Новые технологии в защите биоразнообразия в водных экосистемах». Москва, 27-29 мая 2002 - М.:МАКС Пресс. 2002. С. 91.
19. Чистяков В.А., Барминцев В.А., Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т. Количественный анализ генетических параметров азовской популяции русского осетра на основе RAPD маркеров // Тез. докл. междунар. конф. «Проблемы естественного и искусственного воспроизводства рыб в морских и пресноводных водоемах». Ростов-на-Дону, 9-10 июня 2004 - Ростов-на-Дону: изд. ООО «ЦВВР». 2004. С. 148-150.
20. Чистяков В.А., Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т., Мухоньков М.М., Мирзоян А.В. Использование RAPD-ПЦР для оценки генетического разнообразия азовских популяций русского осетра и севрюги // Тез. докл. межд. сем. «Современные технологии мониторинга и освоение природных ресурсов южных морей России» - Ростов-на-Дону: изд. ООО «ЦВВР». 2005. С. 161-163.
21. Тимошкина Н.Н. Исследование микросателлитных локусов производителей русского осетра // Сбор. тр. III научно-практ. конф. «Экологические проблемы. Взгляд в будущее». СОЛ «Лиманчик», 4-7 сентября 2006 - Ростов-на-Дону: 2006. С. 209-210.
22. Мирзоян А.В., Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т., Чистяков В.А. Генетическое разнообразие азовских популяций русского осетра и севрюги: мониторинг и сохранение при искусственном воспроизводстве // Тез. 1-ой Межд. конф. «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов». Москва, 1-2 ноября 2006 - М.: изд-во ВНИРО. 2006. С 87.
23. Voinova N., Timoshkina N., Myrzoyn A., Rynsa E. Preliminary results on identification of Russian Sturgion (Acepernser gueldenstaedtii) individuals of the Caspian origin in Asov sea // 2NDWORKSHOP. Identification of Acipenseriformes Species in Trade. 29 Sept. - 1 Oct. 2006. Berlin. - 2006. Р. 22.
24. Тимошкина Н.Н., Рынза Е.Т., Мирзоян А.В., Усатов А.В. Использование маркера МТДНК для оценки внутривидового полиморфизма русского осетра (Acipenser gueldenstaedti) // Сб. науч. тр. IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11 - 15 мая 2008. С. 272.
25. Тимошкина Н.Н., Небесихина Н.А. Сравнительный анализ морфометрических показателей современной азовской популяции русского осетра // Межд. симп. «Структура и функционирование естественных и антропогенных экосистем». Кишинев, 18 августа 2008. С. 121.