Дослідження поліморфізму географічно віддалених ізолятів C. beticola за культуральними та фізіолого-біохімічними ознаками у чистій культурі. Визначення ступеню поліморфізму збудника церкоспорозу за ознакою вірулентності ізолятів в польових умовах.
Аннотация к работе
На даний час можна констатувати, що рівень стійкості до церкоспорозу більшості сортів та гібридів невисокий та нестабільний за роками досліджень (Перетятько, 1987, Роїк, 1998), і це залежить від того, що оцінка стійкості вихідних селекційних матеріалів цукрових буряків проводиться, переважно, на природному інфекційному фоні збудника церкоспорозу. Оскільки нейтралізація АФК у рослинних клітинах обумовлена функціонуванням системи антиоксидантного захисту (Elstner, 1991, Зенков, 1993, Foyer, 2003), представленої, зокрема, каталазою (Рубин, 1975, Королюк, 1988), неспецифічною пероксидазою (Андреева, 1988) та поліфенолоксидазою (Rautela, 1970, Рубин, 1975), то визначення характеру змін активності оксидазної ферментної системи (Тарчевский, 2002) може виступати маркерною ознакою стійкості цукрових буряків до збудника церкоспорозу. В основу роботи покладено дослідження, виконані у відповідності до річних тематичних планів науково-дослідних робіт Інституту цукрових буряків УААН науково-технічної програми “Цукрові буряки” на 2001-2005 рр. «Розробити генетико-фізіологічні основи ідентифікації і маркування генотипів і методи створення толерантних до стресових умов вихідних матеріалів з використанням біотехнологій» (номер державної реєстрації 0101U001246) та на 2006-2010 рр. „Вивчити склад та особливості популяції гриба Cercospora beticola та розробити методи добору селекційних матеріалів цукрових буряків, стійких до церкоспорозу, в умовах in vitro” (номер державної реєстрації 0105U007140). Метою роботи було встановлення ступеня внутрішньовидової мінливості ізолятів Cercospora beticola та розробка і удосконалення методів визначення стійкості цукрових буряків до церкоспорозу в культурі in vitro та польових умовах. удосконалити методику створення штучного інфекційного фону з використанням ізолятів C. beticola, виділених у чисту культуру, для оцінки стійкості селекційних матеріалів цукрових буряків до церкоспорозу.Створено колекцію з 32 ізолятів збудника церкоспорозу, відібраних із різних грунтово-кліматичних зон України та Росії. Встановлено, що досліджені ізоляти C. beticola проявляють значну мінливість за культуральними показниками (фенотиповими ознаками культур, ростом на живильних середовищах та накопиченням біомаси), яка не залежить від географічного походження ізолятів. Для виявлення поліморфізму збудника церкоспорозу проведено мікроскопічне дослідження культур, визначено вміст церкоспорину та рівень перекисного окислення ліпідів в клітинах ізолятів C. beticola. Удосконалено метод створення штучного інфекційного фону збудника церкоспорозу, в основу якого покладено можливість застосування в якості інокулюму міцелію ізолятів C. beticola. Дослідження вірулентності ізолятів показало відмінності між ізолятами за ступенем ураження рослин, впливом на врожайність, вміст цукру, натрію та калію в коренеплодах.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
Вывод
1. Створено колекцію з 32 ізолятів збудника церкоспорозу, відібраних із різних грунтово-кліматичних зон України та Росії. Встановлено, що досліджені ізоляти C. beticola проявляють значну мінливість за культуральними показниками (фенотиповими ознаками культур, ростом на живильних середовищах та накопиченням біомаси), яка не залежить від географічного походження ізолятів. Визначено, що уражені церкоспорозом тканини листків цукрових буряків можуть заселяти представники роду Drechslera.
2. Для виявлення поліморфізму збудника церкоспорозу проведено мікроскопічне дослідження культур, визначено вміст церкоспорину та рівень перекисного окислення ліпідів в клітинах ізолятів C. beticola. Встановлено, що застосування методу люмінесцентної мікроскопії дозволяє достовірно ідентифікувати представників виду C. beticola за специфічною флуоресценцією гіф та токсину гриба.
3. За результатами молекулярно-генетичних досліджень встановлено, що популяція збудника церкоспорозу складається з дискретних груп, які утворені генетично відмінними ізолятами C. beticola. Показано відсутність звязку між географічним походженням ізолятів, вмістом токсину та їх філогенетичною близькістю.
4. Удосконалено метод створення штучного інфекційного фону збудника церкоспорозу, в основу якого покладено можливість застосування в якості інокулюму міцелію ізолятів C. beticola. Застосування даного методу дозволяє виявляти особливості патогенезу ізолятів C. beticola.
5. Дослідження вірулентності ізолятів показало відмінності між ізолятами за ступенем ураження рослин, впливом на врожайність, вміст цукру, натрію та калію в коренеплодах. Ізоляти C. beticola С-3 та С-6 виявились значно агресивнішими (ступінь розвитку хвороби 80-90%) за ізоляти С-1 та С-2 (40-50%). Інокуляція посівів слабовірулентними ізолятами (С-1 та С-2) пригнічувала вплив природного інфекційного фону збудника церкоспорозу, що, вірогідно, повязано з проявом індукованого імунітету. Не виявлено толерантності досліджених ізолятів збудника церкоспорозу до фунгіцидів фундазол та альто супер.
6. Розроблено метод введення з насіннєвого матеріалу в культуру in vitro представників роду Beta L., який підвищує вихід експлантів з насіння буряків до 85-97% та вирівнює час їх виділення, що дозволяє отримати гомогенні за віком та фізіологічною зрілістю клональні мікрокультури.
7. Удосконалено методики визначення активності каталази, пероксидази та поліфенолоксидази шляхом проведення ферментних реакцій у мікротитрувальних планшетах та спектрофотометричним визначенням концентрації реагентів.
8. В результаті досліджень визначено особливості змін ферментної активності тканин цукрових буряків в умовах in vitro при дії культуральних метаболітів гриба C. beticola. Встановлено, що збереження високої активності поліфенолоксидази (від 37 до 67% рівня активності ПФО порівняно з контролем) під дією культурального фільтрату виступає маркерною ознакою стійкості генотипу цукрових буряків до церкоспорозу.
Рекомендації виробництву
1. Для визначення систематичної приналежності культур, виділених з уражених церкоспорозом тканин, пропонується застосовувати метод люмінесцентної мікроскопії. Ідентифікацію збудника церкоспорозу в такий спосіб можна проводити за характерними відмінностями у забарвленні гіф міцелію гриба.
2. У селекційних програмах зі створення матеріалів цукрових буряків, стійких до церкоспорозу, рекомендується використовувати розроблений метод оцінки стійкості клональної мікрокультури буряків до збудника хвороби (на основі культуральних метаболітів гриба C. beticola).
3. Для підвищення ефективності доборів при оцінці селекційних матеріалів цукрових буряків на стійкість до церкоспорозу пропонується проводити створення штучних інфекційних фонів із застосуванням найагресивніших ізолятів гриба C. beticola, виділених у культуру.
Список литературы
1. Сюмка А.А., Нурмухаммедов А.К., Коротич П.П. Створення інфекційного фону гриба Cercospora beticola Sacc. та оцінка стійкості селекційних матеріалів цукрових буряків до церкоспорозу: Метод. рекомендації. - К.: ІЦБ, 2004. - 24 с. (Особистий внесок здобувача 80%).
2. Сюмка А.А., Нурмухаммедов А.К. Внутрішньовидова мінливість Cercospora beticola Sacc. // Карантин і захист рослин, 2006. - № 6 (120). - С. 19-20. (Особистий внесок здобувача 80%. Визначені завдання, проведені експериментальні дослідження, сформульовані висновки, написана стаття).
3. Сюмка А.А., Нурмухаммедов А.К., Коротич П.П. Внутрішньовидова мінливість збудника // Карантин і захист рослин, 2006. - № 8 (122). - С. 11-13. (Особистий внесок здобувача 70%. Визначені завдання, проведені експериментальні дослідження, сформульовані висновки, написана стаття).
4. Сюмка А.А., Соляник Е.В., Попик М.Л. Поиск маркера устойчивости свеклы к церкоспорозу в культуре in vitro // Фактори експериментальної еволюції організмів: Зб. наук. праць. - К.: Логос, 2006. - Т. 3. - С. 510-515. (Особистий внесок здобувача 60%. Визначені завдання, проведені дослідження, проаналізований матеріал, написана стаття).
5. Сюмка А.А., Шаюк Л.В., Соляник О.В., Кобилінський О.О. Поліморфізм Cercospora beticola Sacc. // Досягнення і проблеми генетики, селекції та біотехнології: Зб. наук. праць. - К.: Логос, 2007. - Т. 1. - С. 315-319. (Особистий внесок здобувача 60%. Визначені завдання, проведені дослідження, проаналізований матеріал, написана стаття).
6. Спосіб отримання експлантів представників роду Beta L. для введення в культуру in vitro: Деклараційний патент на корисну модель - А.А. Сюмка. - № 2004020784; Заявл. 03.02.04; Пат. 3133 UA, МПК 7 А01Н4/00. Опубл. 15.10.04. - Бюл. № 10.
7. Спосіб отримання інокулюму для створення інфекційного фону збудника церкоспорозу - гриба Cercospora beticola: Деклараційний патент на корисну модель - А.А. Сюмка. - № 20040604715; Заявл. 16.06.04. Пат. 4598 UA, МПК 7 А01Н4/04. Опубл. 17.01.05. - Бюл. № 1.
8. Сюмка А.А., Соляник Е.В. Экспресс-метод определения активности пероксидазы в тканях растений рода Beta L. // Матеріали конф. молодих вчених-ботаніків “Актуальні проблеми ботаніки та екології” (Канів, 7-10 вересня 2004 р.). - Камянець-Подільський: АБЕТКА, 2004. - Вип. 9. - С. 186-188.
9. Syumka A. Investigation of the Ukrainian Cercospora beticola isolates // Reparstvi and sladovnicky jecmen. Sbornik z konference 18.-19.02. 2004. - Praha: Ceska zemedelska univerzita v Praze, 2004. 4 rocnik. - Str. 86-88.