Скринінг геномної бібліотеки винограду для відбору повторюваних послідовностей в якості молекулярних проб. Підбір комбінацій проба / фермент та праймерів. Зв’язок мінливості фенотипових ознак клонів досліджених сортів з поліморфізмом фрагментів ДНК.
Аннотация к работе
Клонова селекція винограду спрямована на відбір форм з певними якісними варіаціями і найкращими значеннями кількісних ознак, які мають безперервний характер варіювання у певних умовах зовнішнього середовища. Важливе значення має вивчення на їх основі вітчизняних та інтродукованих сортів і клонів, що культивують в Україні. Ретельного вивчення потребує ідентифікація ділянок ДНК, повязаних з мінливістю якісних і кількісних ознак клонів. У звязку з цим теоретичний і практичний інтерес являють дослідження молекулярної структури геному винограду, молекулярно-генетичний аналіз послідовностей нуклеотидів фракції частих повторів, проведення відбору комбінацій проба / фермент і праймерів для дослідження внутрішньосортової мінливості ДНК, дослідження поліморфізму ДНК клонів сортів винограду та оцінка звязку між поліморфізмом фрагментів ДНК і варіаціями фенотипових ознак. Відбір за допомогою молекулярних ДНК-маркерів, що ґрунтується на специфічності звязку між поліморфними фрагментами ДНК та фенотиповою варіацією якісних і кількісних ознак, дасть можливість на новому рівні проводити етапи практичної селекції клонів сортів винограду і вести спрямований відбір переважно за генотипом.Матеріалом для дослідження слугували: сорт Рупестріс дю Ло (Vitis rupestris Sheele), сорт Ріпаріа Глуар де Монпельє (Vitis riparia Michx.), міжвидові гібриди Ріпаріа х Рупестріс 101-14 (РХР 101-14, V. riparia х V. rupestris), Роднічок ([(V. vinifera х Vitis amurensis Rupr.) х V. vinifera] х (V. riparia х V. rupestris х V. vinifera)), Голубок ((V. vinifera х V. amurensis) х V. vinifera), Оригінал (V. vinifera х (V. riparia х V. rupestris х V. vinifera)); сорти V. vinifera: Каберне Совіньон, Рислінг рейнський, Ркацителі, Мускат гамбурзький, Мускат таїровський; 11 клонів підщепного сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14 (4923, 832, 992, 1182, 6733, 672, 4244, 6114, 2382, 12161, 22121), 3 клони підщепного сорту Ріпаріа Глуар де Монпельє (454, 852, 3121), 10 клонів Каберне Совіньон (143113, 1441, 1473, 2043, 22103, 30251, 1076, 441, ІНРА, ЄНТАВ), 5 клонів технічного сорту Рислінг рейнський (13101, 14161, 2071, 6846, 8121); 10 індивідуальних рослин клону 4923 сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14, по 5 індивідуальних рослин клонів 1076, 441, ЄНТАВ сорту Каберне Совіньон. Клони сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14 розрізнялись за якісними ознаками: «тип квітки», «забарвлення верхівки пагона»; за кількісними ознаками: «навантаження кущів пагонами», «кількість чубуків з куща», «діаметр чубука», «кількість повних серцевинних променів», «прошарки твердого лубу», «відношення діаметра чубука до діаметра серцевини», «сума вуглеводів». Клони технічного сорту Каберне Совіньон розрізнялись за якісною ознакою: «форма грона»; за кількісними ознаками: «маса урожаю з пагона», «маса грона», «маса 100 ягід», «продуктивність пагона», «концентрація цукру», «кислотність соку». Дані якісних і кількісних ознак клонів сорту Каберне Совіньон, що отримані за 1991-1995 рр., надані: к.б.н., зав. відділу селекції і сортовивчення Тулаєвою М.І, д.с.-г.н., зав. лабораторії клонової селекції Хільком В.Ф, к.с.-г.н., с.н.с. лабораторії клонової селекції Чісніковим В.С, н.с. лабораторії клонової селекції Мазуренко Л.С.; за 2002-2004 рр. - к.б.н., зав. відділу селекції і сортовивчення Тулаєвою М.І, д.с.-г.н., зав. лабораторії клонової селекції Хільком В.Ф, н.с. лабораторії клонової селекції Мазуренко Л.С. Скринінг клонованих фрагментів ДНК винограду проведено шляхом гібридизації з [?-32P] - міченою фракцією послідовностей ДНК винограду [Фейнберг и др., 1983] з С0t = 10-2 моль • сек/л.На основі аналізу поліморфізму ДНК сортів V. vinifera запропоновано принцип підбору праймерів для детекції внутрішньосортової варіабельності ДНК винограду. Встановлено, що генетична мінливість клонів досліджених сортів винограду зумовлена поліморфізмом ДНК, виявленим за допомогою методів ПДРФ (комбінація проба / фермент - PTU3/ALUI) та ампліфікації з довільними (Р5, Р8, Р14, Р18) і ISSR-праймерами ((GTG)7A, (ACC)6G, (GAG)6C, (AG)9C, (GA)9C). На основі статистичного аналізу звязку мінливості фенотипових ознак з поліморфізмом фрагментів ДНК клонів сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14 і Каберне Совіньон запропоновано спосіб добору перспективних клонів та клонів з певною морфологією. Особистий внесок дисертанта: проведено генотипування видів, сортів і клонів винограду ПДРФ-методом за допомогою чотирьох проба / фермент комбінацій. Особистий внесок дисертанта: проведено детекцію варіабельності клонів сортів винограду за допомогою відібранних комбінації проба / фермент, довільних, ISSR-праймерів.
План
Основний зміст
Вывод
1. Детектовано генетичну мінливість клонів підщепних сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14, Ріпаріа Глуар де Монпельє, технічного сорту Каберне Совіньон. Показано, що клони сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14, Ріпаріа Глуар де Монпельє представлено двома групами, сорту Каберне Совіньон - трьома групами.
2. При вивченні кінетики процесу відновлення вторинної структури ДНК винограду сорту Рислінг рейнський встановлено, що малокопійні і унікальні послідовності становлять 59,5%, повторювані послідовності - 40,5%, з яких фракція частих повторів - 11,5%.
3. Створено бібліотеку фрагментів ДНК винограду сорту Рислінг рейнський. Відібрано 25 клонованих послідовностей фракції ДНК, що часто повторюються, проведено аналіз 94 комбінацій проба / фермент. За результатами Саузерн-аналізу комбінації PRR71/ECORI, PRR133/ECORI, PRR133/TAQI є перспективними для детекції варіабельності ДНК винограду.
4. На основі аналізу поліморфізму ДНК сортів V. vinifera запропоновано принцип підбору праймерів для детекції внутрішньосортової варіабельності ДНК винограду. Критерієм інформативності довільних і ISSR-праймерів для відбору є рівень поліморфізму ДНК серед сортів, що становить понад 55%.
5. Встановлено, що генетична мінливість клонів досліджених сортів винограду зумовлена поліморфізмом ДНК, виявленим за допомогою методів ПДРФ (комбінація проба / фермент - PTU3/ALUI) та ампліфікації з довільними (Р5, Р8, Р14, Р18) і ISSR-праймерами ((GTG)7A, (ACC)6G, (GAG)6C, (AG)9C, (GA)9C).
6. На основі статистичного аналізу звязку мінливості фенотипових ознак з поліморфізмом фрагментів ДНК клонів сортів Ріпаріа х Рупестріс 101-14 і Каберне Совіньон запропоновано спосіб добору перспективних клонів та клонів з певною морфологією.
Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації
1. Сиволап Ю.М. Анализ генетических дистанций ПДРФ у винограда / Ю.М. Сиволап, Т.Г. Вербицкая, М.И. Тулаева, И.А. Барышева // Цитология и генетика. - 1993. - №6. - С. 24-29.
Особистий внесок дисертанта: проведено генотипування видів, сортів і клонів винограду ПДРФ-методом за допомогою чотирьох проба / фермент комбінацій. Визначено генетичні дистанції між представленими видами, сортами і клонами. Для подальшої роботи відібрано одну комбінацію проба / фермент.
2. Барышева И.А. Исследование внутрисортовой изменчивости ДНК винограда ПДРФ и ПЦР-методами / И.А. Барышева, М.И. Тулаева, В.С. Чисников // Цитология и генетика. - 2003. - Т. 37. - №6. - С. 31-38.
Особистий внесок дисертанта: проведено детекцію варіабельності клонів сортів винограду за допомогою відібранних комбінації проба / фермент, довільних, ISSR-праймерів. Отримано специфічні ДНК-локуси для клонів кожного сорту. Запропоновано спосіб підбору праймерів для детекції внутрішньосортової мінливості ДНК. Показано ефективність аналізу за допомогою ампліфікації з довільними та ISSR-праймерами порівняно з ПДРФ-аналізом для визначення внутрішньосортової мінливості ДНК.
3. Барышева И.А. ДНК-маркерные системы для идентификации сортов винограда / И.А. Барышева // Физиология и биохимия культурных растений. - 2004. - Т. 36. - №6. - С. 463-477.
4. Баришева І.А. Аналіз молекулярної структури ДНК винограду Рислінг рейнський (Vitis vinifera) / І.А. Баришева // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2006. - №102. - С. 24-30.
5. Баришева І.А. Аналіз звязку мінливості фенотипових ознак з поліморфізмом локусів ДНК клонів підщепного сорту винограду Ріпаріа х Рупестріс 101-14 / І.А. Баришева, І.А. Ковальова, М.І. Тулаєва, В.С.Чісніков // Науковий вісник Національного аграрного університету. - 2007. - №105. - С. 57 - 66.
Особистий внесок дисертанта: проведено статистичний аналіз звязку мінливості фенотипових ознак з даними ДНК-аналізу підщепного сорту Ріпаріа х Рупестріс 101-14. Одержано достовірні коефіцієнти кореляції між якісними ознаками «тип квітки», «забарвлення верхівки пагона» і поліморфними фрагментами ДНК та достовірність різниці середніх значень кількісних ознак у груп клонів підщепного сорту, утворених на основі ДНК-аналізу. Визначено можливість добору клонів перспективних за врожайністю та певною морфологією.
6. Вербицкая Т.Г. ПДРФ-анализ различных генотипов винорада / Т.Г. Вербицкая, Ю.М. Сиволап, М.И. Тулаева, И.А. Барышева // Управление генетической изменчивостью сельскохозяйственных растений: материалы международного симпозиума; 29.09. - 01.10. 1992 г.: тези докл. - Ялта, 1992. - С. 8.
Особистий внесок дисертанта: проведено молекулярно-генетичний аналіз видів, сортів і клонів винограду ПДРФ-методом. Виявлено специфічні фрагменти ДНК у досліджених видів і сортів.
7. Barysheva I. RAPD-analysis of different genotipes of grape / I. Barysheva, T. Verbiskaya, Yu. Sivolap // Plant Genom ІІІ: The international conference on the status of plant genome research; 15-19 jan. 1995. - San Diego, USA, 1995. - Р. 83.
Особистий внесок дисертанта: проведено молекулярно-генетичний аналіз видів, сортів і клонів винограду методом ампліфікації з довільними праймерами. Визначено генетичні дистанції між представленими видами, сортами і клонами.
8. Баришева І.А. Дослідження міжвидової та внутрішньовидової мінливості винограду з допомогою ПЛР / І.А. Баришева, Т.Г. Вербицька, Ю.М. Сиволап // Наслідки наукових пошуків молодих вчених-аграрників в умовах реформування АПК: Матеріали міжнародної науково-практичної конференції молодих вчених та спеціалістів. Частина І; 18 січ. 1996 р.: тези докл. - Чабани, 1996. - С. 219.
Особистий внесок дисертанта: проведено генотипування клонів винограду методом ампліфікації з довільними праймерами. Виявлено можливість детекції внутрішньосортової мінливості даним типом метода ампліфікації. Отримано специфічні фрагменти ДНК для різних генотипів.
9. Балашова И.А. Молекулярно-генетический полиморфизм винограда / И.А. Балашова, И.А. Барышева, Ю.М. Сиволап // Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционых исследованиях: науч.-метод. руков.; под ред. Ю.М. Сиволапа. - К: Аграрна наука, 1998. - С. 116-120.
Особистий внесок дисертанта: перевірено 22 довільних праймера для виявлення молекулярно-генетичного поліморфізму клонів винограду. Відібрано 7 для детекції внутрішньосортової мінливості.
10. Барышева И.А. Оценка сопряженности ДНК-маркеров с морфологическими и хозяйственными признаками клонов сортов винограда Рипариа х Рупестрис 101-14 и Каберене Совиньон / И.А. Барышева // Пути повышения эффективности хранения и переработки сельскохозяйственной продукции: сб. научных статей. - ОЦНТЭИ, Одесса, 1999. - С. 15-20.