Культивирование ксилотрофного базидиомицета Lentinus edodes. Химический состав и физико-химические свойства его внеклеточных лектинов. Определение условий проявления их биологической активности во взаимосвязи с ростовыми характеристиками культуры.
Аннотация к работе
При этом кроме факторов, определяемых самим организмом, т.е. вид и штамм гриба, возраст культуры, способность к вегетативному размножению и образованию биологически активных веществ, интенсивность дыхания и др., необходимо учитывать и регулировать факторы внешней среды, влияющие на физиологические и биохимические процессы, как важнейшие факторы, определяющие активность гетеротрофных организмов [Дворнина, 1990]. В частности, лектиновая активность высших грибов изучена явно недостаточно, лишь отдельные работы касаются изучения лектинов в связи с физиологическими аспектами, проблемами морфогенеза грибов. На стадиях, предшествующих плодоношению и характеризующихся у отдельных видов формированием специализированных вегетативных структур, таких как коричневая мицелиальная пленка шиитаке, исследование лектиновой активности приобретает особую актуальность, поскольку биохимические условия возникновения подобных особенностей морфогенеза и способов дальнейшего развития (перехода либо к нормальному плодоношению, либо к образованию недифференцированных базидиом) давно интересовали исследователей, оставаясь неопределенными. Не были выявлены регуляторы внеклеточной лектиновой активности, поэтому представляло интерес изучить не только эффекторы - компоненты синтетических сред культивирования, но и обнаружить какие-либо эндогенные низкомолекулярные регуляторы указанной активности, внешние условия их биосинтеза и проявления, что удалось реализовать в рамках настоящей работы. Выявлена взаимосвязь активности лектинов с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре; с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании; с биосинтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам.L2 содержит в своем составе (90,3 ± 1,0) % (m/m) углеводов, представленных глюкозой (73 % (m/m) углеводной части молекулы лектина) и галактозой (27 % (m/m) углеводной части молекулы лектина). Установлено, что активность и динамика образования лектинов L. edodes зависят от условий культивирования, а именно: температуры, количества посевного мицелия, возраста культуры, а также от состава среды глубинного культивирования: соотношения количеств углерода и азота, природы компонентов - источников углерода и азота, кислотности среды. Прослеживается взаимосвязь активности внеклеточных лектинов шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам, что может свидетельствовать об участии лектинов L. edodes в морфогенетических процессах и инициации плодообразования. Изменения активности внеклеточных лектинов L. edodes при различных условиях взаимодействия препаратов лектинов с соединениями - представителями ряда 1,5-ди(4-R-фенил)-3-селенпентандионов-1,5 в зависимости от структуры селенсодержащего компонента реакционных смесей, его концентрации, от стадии очистки белков, позволяют выявить влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий в химических процессах с участием лектинов. Взаимосвязь молекулярной структуры источника азота и активности внеклеточных лектинов при глубинном культивировании Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler]// Микробиология.
Вывод
1. В культуральной жидкости и на поверхности мицелия ряда штаммов базидиомицета Lentinus edodes обнаружены лектины, имеющие в зависимости от штамма различную специфичность к углеводам.
2. Культура L. edodes F-249 синтезирует два внеклеточных лектина, различающихся по составу и физико-химическим свойствам. Внеклеточный лектин L1 из L. edodes - гликопротеин с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 43 КДА. L1 имеет в своем составе (10,5 ± 1,0) % (m/m) углеводов, представленных глюкозой. Внеклеточный лектин L2 - протеогликан с моносубъединичной структурой, молекулярной массой 37 КДА. L2 содержит в своем составе (90,3 ± 1,0) % (m/m) углеводов, представленных глюкозой (73 % (m/m) углеводной части молекулы лектина) и галактозой (27 % (m/m) углеводной части молекулы лектина). В L2 высоко содержание Asn: 42 % (m/m) от суммы аминокислот. Этот факт наряду с составом углеводной части молекулы (Glc Gal) позволяет отнести L2 к N-аспарагинсвязанным белкам.
3. Два лектина L1 и L2 различаются по углеводной специфичности. Оба белка специфичны к D-галактозе и D-лактозе при одинаковой для L1 и L2 минимальной ингибирующей концентрации этих углеводов (2,08 ММ Gal; 8,33 ММ Lac). Другие углеводы, к которым лектины проявляют более или менее высокое сродство: для L1 это Rha (4,16 ММ); для L2 - Ara (4,16 ММ) и MANOH (8,33 ММ).
4. Два лектина L1 и L2 различаются по антигенным свойствам, имея при этом общие антигенные детерминанты. Очищенные внеклеточные лектины L. edodes высоко избирательны при узнавании определенных структур на поверхности трипсинизированных эритроцитов кролика, не реагируя с эритроцитами других животных и человека.
5. Установлено, что активность и динамика образования лектинов L. edodes зависят от условий культивирования, а именно: температуры, количества посевного мицелия, возраста культуры, а также от состава среды глубинного культивирования: соотношения количеств углерода и азота, природы компонентов - источников углерода и азота, кислотности среды. Оптимальный состав жидкой среды выращивания с целью получения максимальной лектиновой активности шиитаке включает в качестве источника углерода L-Ara или D-Glc, источника азота - L-Asn.
6. Одним из значимых факторов, влияющих на лектиновую активность глубинной культуры L. edodes, является присутствие в среде культивирования катионов металлов(II). В отношении величин титров гемагглютинации и периодов проявления наибольшей лектиновой активности имеет значение не только концентрация катиона M2 , но и источник углеродного питания грибной культуры. Полученные данные для металлов, образующих эти катионы, позволяют составить следующий ряд в порядке уменьшения положительного эффекта на активность внеклеточных лектинов шиитаке: Mg>Ca>Cu>Fe>Mn>Zn~Sn>Co>Ni. Влияние двухзарядных катионов металлов триады железа на активность внеклеточных лектинов L. edodes изменяется симбатно с энергиями реакций хелатообразования гексааквокомплексов металлов с модельным бидентатным лигандом этиленгликолем.
7. При воздействии неблагоприятных для роста мицелия грибной культуры условий (температурного и питательного стресса) наблюдается значительное увеличение лектиновой активности, что можно связать со стабилизирующей, адаптогенной ролью лектинов L. edodes.
8. Прослеживается взаимосвязь активности внеклеточных лектинов шиитаке с формированием коричневой мицелиальной пленки в глубинной культуре, с процессами роста и развития грибного мицелия при твердофазном культивировании, с синтезом соединений, относящихся к важнейшим компонентам химического состава мицелия - липидам и углеводам, что может свидетельствовать об участии лектинов L. edodes в морфогенетических процессах и инициации плодообразования.
9. Изменения активности внеклеточных лектинов L. edodes при различных условиях взаимодействия препаратов лектинов с соединениями - представителями ряда 1,5-ди(4-R-фенил)-3-селенпентандионов-1,5 в зависимости от структуры селенсодержащего компонента реакционных смесей, его концентрации, от стадии очистки белков, позволяют выявить влияние электрофильных свойств реагента и гидрофобных взаимодействий в химических процессах с участием лектинов. При этом результаты квантовохимических расчетов и QSAR свойства косвенно подтверждают бoльшую склонность Met замещать атом серы на селен в биохимических процессах по сравнению с Cys.
10. Выявлено взаимодействие лектинов L. edodes с фитогормоном ИУК, при этом значительно (в 8-64 раза) увеличивается титр гемагглютинации в системе "лектин-ИУК". Продукты взаимодействия с ИУК для двух лектинов имеют, вероятно, одинаковую химическую природу. Возможность взаимодействия в указанной системе in vivo может основываться на участии обоих компонентов (и лектинов, по данным нашей работы, и ИУК, по литературным данным) в процессах морфогенетической дифференцировки мицелия высших грибов.
11. Впервые из внеклеточных метаболитов Lentinus edodes выделен галактолипид S3, являющийся одним из эндогенных регуляторов активности внеклеточных лектинов L. edodes. Галактолипид представляет собой D-галактопиранозу (15 % (m/m) S3 содержат сульфат-Gal), ацилированную остатками октадекановой или нонадекановой кислот в соотношении 28 % и 72 % (m/m) от суммы двух ЖК соответственно.
12. Предложена методика эффективного разделения двух внеклеточных лектинов L. edodes, основанная на дифференциации их хроматографических свойств в присутствии Cu(II).
ОСНОВНЫЕ РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Pankratov A.N., Tsivileva O.M., Nikitina V.E. Laccase of Lentinus edodes catalyzed oxidation of amines and phenolic compounds: a quantum chemical consideration // J. Biochem. Mol. Biol. 2000. Vol. 33, № 1. P. 37-42.
2. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова Л.В., Завьялова Л.А., Игнатов В.В. Гемагглютинирующая активность Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler]// Микробиология. 2000. Т. 69, № 1. С. 38-44.
3. Tsivileva O.M., Nikitina V.E., Garibova L.V., Ignatov V.V. Lectin activity of Lentinus edodes // International Microbiology. 2001. Vol. 4, № 1. P. 41-45.
4. Никитина В.Е., Озерова Р.А., Цивилева О.М. Особенности роста мицелия Lentinus edodes на различных средах // Бюллетень Ботанического сада Саратовского государственного университета. Саратов: Научная книга, 2003. Вып. 2. С. 176-179.
5. Панкратов А.Н., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Учаева И.М. Квантовохимическое рассмотрение возможной роли источника азота в связи с активностью внеклеточных лектинов при глубинном культивировании Lentinus edodes // Органические реагенты в организованных средах: Межвузовский сборник научных статей. Вып. 7. Саратов: Научная книга, 2003. C. 220-225.
6. Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Никитина В.Е., Гарибова Л.В. Взаимосвязь молекулярной структуры источника азота и активности внеклеточных лектинов при глубинном культивировании Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler]// Микробиология. 2004. Т. 73, № 4. С. 486-490.
7. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Гарибова Л.В. Стимуляторы лектиновой активности Lentinus edodes на синтетических агаризованных средах // Биотехнология. 2004. № 3. С. 49-54.
8. Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Древко Б.И., Никитина В.Е. Влияние 1,5-дифенил-3-селенпентандиона-1,5 на лектиновую активность глубинной культуры Lentinus edodes // Карбонильные соединения в синтезе гетероциклов: Сборник науч. трудов / Под ред. проф. А.П. Кривенько. Саратов: Научная книга, 2004. C. 301-303.
9. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н., Древко Б.И. Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на морфолого-культуральные характеристики съедобного гриба шиитаке // "Вавиловские чтения - 2004": Материалы Всероссийской научно-практической конф., посв. 117-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова. Саратов, 24-26 ноября 2004. Секция физиологии и защиты растений. - Саратов: Изд-во СГАУ, 2004. - С. 36-39.
10. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова Л.В. Влияние состава среды культивирования на активность внеклеточных лектинов Lentinus edodes // Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41, № 2. С. 200-203.
11. Tsivileva O.M., Pankratov A.N., Nikitina V.E., Garibova L.V. Effect of media components on the mycelial film formation in submerged culture of Lentinus edodes (Shiitake) // Food Technol. Biotechnol. 2005. Vol. 43, № 3. P. 227-234.
12. Силина Ю.Е., Кучменко Т.А., Коренман Я.И., Цивилева О.М., Никитина В.Е. Применение полного факторного эксперимента для разработки газового сенсора на основе экстрактов мицелиального гриба Pleurotus ostreatus // Журн. аналит. химии. 2005. Т. 60, № 7. С. 759-764.
13. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н., Древко Б.И., Лощинина Е.А., Гарибова Л.В. Влияние селенсодержащего препарата ДАФС-25 на рост и лектиновую активность Lentinus edodes // Биотехнология. 2005. № 2. С. 56-62.
14. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров О.Е., Гарибова Л.В. Взаимосвязь углеводной специфичности лектинов и углеводного состава мицелия Lentinus edodes (Berk.) Sing [Lentinula edodes (Berk.) Pegler] на разных стадиях морфогенеза // Микробиология. 2005. Т. 74, № 5. С. 714-716.
15. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Лощинина Е.А. Поиск группоспецифичных лектинов грибного происхождения // Успехи медицинской микологии. Том V / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2005. С. 201-205.
16. Pankratov A.N., Tsivileva O.M., Nikitina V.E. A Brief Guide to Mycology Web Resources // Online Information Review. 2006. Vol. 30, № 1. P. 43-52.
17. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Гарибова Л.В. Использование двухвалентного марганца при получении посевного мицелия Lentinus edodes // Микология и фитопатология. 2006. Т. 40, вып. 2. С. 142-145.
18. Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Лощинина Е.А., Никитина В.Е. Экспериментальное и теоретическое исследование влияния катионов металлов триады железа на активность внеклеточных лектинов Lentinus edodes // Вестник Московского университета. Серия 2. Химия. 2006. Т. 47, № 2. С. 91-96.
19. Степанова Л.В., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Лощинина Е.А., Гарибова Л.В., Тюрюкина Е.В. Гемагглютинирующая активность некоторых базидиальных ксилотрофов на стадии дикариотического мицелия // Микология и фитопатология. 2006. Т. 40, вып. 4. С. 307-313.
20. Лощинина Е.А., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Пономарева Е.Г., Шелудько А.В. Морфолого-культуральные характеристики базидиомицета Lentinus edodes при совместном культивировании с бактериями рода Azospirillum // Вестник СГАУ. 2006, № 6, вып. 2. С. 24-26.
21. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А. Взаимоотношения ксилотрофных базидиомицетов и почвенных азотфиксирующих бактерий рода Azospirillum // Успехи медицинской микологии. Том VII / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2006. С. 293-294.
22. Цивилева О.М., Макаров О.Е., Никитина В.Е., Гарибова Л.В. Изменение жирнокислотного состава общих липидов и лектиновой активности Lentinus edodes в процессе морфогенеза // Микология и фитопатология. 2007. Т. 41. № 5. С. 450-455.
23. Цивилева О.М., Панкратов А.Н., Никитина В.Е., Бычков Н.А., Лощинина Е.А. Влияние некоторых неорганических соединений на активность внеклеточных лектинов гриба Lentinus edodes // Известия Саратовского университета. Новая серия. 2007. Т. 7. Серия: Химия. Биология. Экология. Вып. 1. C. 21-27.
24. Nikitina V.E., Tsivileva O.M., Pankratov A.N., Bychkov N.A. Lentinula edodes Biotechnology - From Lentinan to Lectins // Food Technology and Biotechnology. 2007. Vol. 45, № 3. P. 230-237.
25. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Лощинина Е.А., Макаров О.Е., Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Пучкова Т.А. Биохимические особенности развития мицелия Lentunus edodes в совместной культуре с диазотрофными бактериями Azospirillum brasilense // Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 9-12.
26. Пучкова Т.А., Филимонова Т.В., Бабицкая В.Г., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Щерба В.В., Иконникова Н.В. Меланиновые пигменты грибов Lentinus edodes и Ganoderma lucidum // Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 17-20.
27. Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Пучкова Т.А., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Иконникова Н.В., Смирнов Д.А., Осадчая О.В. Гликопротеины Lentinus edodes: факторы, влияющие на их образование // Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 142-144.
28. Смирнов Д.А., Щерба В.В., Никитина В.Е., Рожкова З.А., Бабицкая В.Г., Цивилева О.М., Пучкова Т.А., Осадчая О.В. Сравнительное изучение экзо- и эндополисахаридов, образуемых Lentinus edodes при различных способах культивирования // Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 181-183.
29. Никитина В.Е., Цивилева О.М., Бабицкая В.Г., Щерба В.В., Пучкова Т.А. Современные биотехнологические аспекты глубинного культивирования Lentunus edodes // Успехи медицинской микологии. Том IX / Под общей научной редакцией акад. РАЕН Ю.В. Сергеева. М.: Национальная академия микологии, 2007. С. 247-251.
30. Цивилева О.М., Никитина В.Е. Соединения селена в процессах жизнедеятельности биотехнологически значимых грибных культур // Нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и продукты. Сборник научных трудов. Выпуск 16. - М.: РАЕН, 2007. C. 47-58.
31. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е.., Панкратов А.Н. Жирные кислоты мицелия на разных стадиях морфогенетического развития Lentinus edodes // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. C. 116-118.
32. Бычков Н.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Панкратов А.Н. Способ выделения индивидуальных экзолектинов из жидких сред культивирования базидиомицета Lentinus edodes // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. C. 74-76.
33. Бычков Н.А., Панкратов А.Н., Цивилева О.М., Липатов И.А., Никитина В.Е., Древко Б.И. Взаимодействие соединений ряда 1,5-ди(4-R-фенил)-3-селенпентандионов-1,5 с лектинами базидиомицета Lentinus edodes // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. C. 331-333.
34. Бычков Н.А., Панкратов А.Н., Цивилева О.М. DFT-исследование взаимодействия L-цистеина с кислотами селена // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. C. 337-339.
35. Бычков Н.А., Панкратов А.Н., Цивилева О.М., Былинкина Н.Н., Никитина В.Е. Рентгенофазовый анализ экзолектинов базидиомицета Lentinus edodes // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. C. 71-74.
36. Бычков Н.А., Панкратов А.Н., Цивилева О.М. Сравнительный анализ реакционной способности L-цистеина и L-метионина: предпосылки замещения атома серы на селен в биохимических процессах // Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии: Сборник научных трудов. Саратов: Научная книга, 2007. C. 328-330.
37. Лощинина Е.А., Цивилева О.М., Никитина В.Е., Макаров О.Е. Экспериментальные предпосылки отнесения пути биосинтеза фитогормона ИУК базидиомицетом Lentinus edodes к триптофанзависимому типу // "Вавиловские чтения - 2007": Материалы межд. научно-практ. конф., посв. 120-й годовщине со дня рожд. акад. Н.И. Вавилова. Саратов, 27-30 ноября 2007. Т. 1. - Саратов: Научная книга, 2007. С. 37-38.
38. Ветчинкина Е.П., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Гарибова Л.В. Активность внутриклеточных лектинов Lentinus edodes на разных стадиях развития гриба // Прикл. биохимия и микробиология. 2008. Т. 44, № 1. С. 76-83.
39. Никитина В.Е., Цивилева О.М. Способ выращивания съедобных грибов Lentinus edodes // Патент РФ № 2239983. Бюл. изобр. № 32 от 20.11.2004.
40. Цивилева О.М., Никитина В.Е., Кучменко Т.А., Силина Ю.Е., Панкратов А.Н. Биомодификатор для определения фенола и его производных / Положительное решение формальной экспертизы № 2005121083/13(023786). Приоритет от 13.12.2006.