Вміст біологічно-активних речовин у фолікулярній рідині та їх вплив на процеси запліднення ооцитів і розвиток ембріонів in vitrо при безплідності - Автореферат

За результатами офіційних міжнародних звітів за 1986 - 1994 рр., частота отримання вагітності при лікуванні безплідності методом ЗІВ в різних клініках досягає в середньому 20-30% у розрахунку на один переніс ембріонів. Також серед дослідників не існує загальної уяви про значення обміну простагландинів, інтенсивності процесів ПОЛ і активності антиоксидантних ферментних систем у мікрооточенні ооциту, що свідчить про наукову новизну їх комплексного вивчення. Вивчити здатність ооцитів до запліднення, морфологічні характеристики і темпи дроблення ембріонів у програмах ЗІВ в залежності від концентрації простагландинів класів E2 та F2a у фолікулярній рідині; Вивчити вплив процесів перекисного окислення ліпідів і активності антиоксидантних систем у фолікулярній рідині на здатність ооцитів до запліднення, морфологічні характеристики і темпи дроблення ембріонів in vitro, частоту настання вагітності в програмі ЗІВ. Вперше було проведене комплексне дослідження, що включало визначення в ФР людини концентрації простагландинів E2 і F2a, визначення вмісту продуктів перекисного окислення ліпідів, активності антиоксидантних ферментних систем у фізіологічних циклах і в програмі ЗІВ.Досліджено 90 подружніх пар, що звернулися з приводу безплідності і були включені в програму лікування методом ЗІВ. У першу групу були включені подружні пари в програмі ЗІВ у тих випадках, коли відсоток запліднення ооцитів in vitro склав 66,7 - 100% (n = 30); у другу групу - 33,4 - 66,6% запліднення ооцитів in vitro (n = 30); у третю групу - 0 - 33,3% запліднення ооцитів in vitro (n = 30); Протипоказаннями для включення пацієнток у контрольну групу були виявлені порушення гормонального гомеостазу, використання будь-яких гормональних препаратів протягом 6 менструальних циклів перед оперативним втручанням, систематичний прийом негормональних фармакологічних препаратів, патологічні зміни тканини яєчників. Оцінювались слідуючи параметри ембріологічного етапу програми ЗІВ: морфологія ооцитів, відсоток запліднення ооцитів, морфологія та темпи дроблення ембріонів. Було встановлено, що морфологічні властивості, ступінь зрілості ооцитів і відсоток їх запліднення in vitro не повязані з концентрацією Pg F2a і концентрацією Pg E2, але був виявлений кореляційний звязок між здатністю ооцитів до запліднення і відношенням Pg E2/F2a (r = 0,322), що свідчить про більше діагностичне значення вивчення співвідношення простагландинів у ФР.Встановлено, що в фолікулярній рідині, отриманій в програмі ЗІВ, інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів і синтезу Pg F2a значно перевищує відповідні показники у фолікулярній рідині пацієнток у фізіологічних циклах, що свідчить про вихід цих процесів у преовуляторному фолікулі при стимуляції суперовуляції за фізіологічні межі. Підвищення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині негативно впливає на морфологічні й, у великій мірі, функціональні характеристики ооцитів, що проявляється в тенденції до збільшення кількості клітин з ознаками деградації, а також у достовірному зниженні їх здатності до запліднення, погіршенні морфологічних властивостей ембріонів. У фолікулярній рідині при підвищенні інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів відзначається достовірне збільшення концентрації відновленого глутатіона і супероксиддисмутазної активності. Запропонований комплекс біохімічних досліджень, що включає визначення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів, активності супероксиддисмутази, концентрації відновленого глутатіона і співвідношення Pg E2/F2a у фолікулярній рідині, може бути використаний при застосуванні допоміжних репродуктивних технологій для прогнозування здатності ооцитів до запліднення і вірогідності розвитку повноцінних ембріонів. З огляду на відсутність критеріїв для оцінки інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині пацієнток в програмі ЗІВ до пункції й аспірації ооцитів, є рекомендованим максимально скоротити перебування ооцитів у фолікулярній рідині після аспірації фолікулів.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ роботи

З метою підвищення ефективності лікування безплідності методом запліднення in vitro було проведене комплексне біохімічне дослідження фолікулярної рідини людини після стимуляції овуляції та в фізіологічних циклах, що дозволило уточнити деякі важливі аспекти, які впливають на результати лікування безплідності в програмі ЗІВ, і розробити ряд прогностичних критеріїв.

Встановлено, що в фолікулярній рідині, отриманій в програмі ЗІВ, інтенсивність процесів перекисного окислення ліпідів і синтезу Pg F2a значно перевищує відповідні показники у фолікулярній рідині пацієнток у фізіологічних циклах, що свідчить про вихід цих процесів у преовуляторному фолікулі при стимуляції суперовуляції за фізіологічні межі. Ці дані вказують на підвищену небезпеку впливу реактивних кисневих сполук на ооцити при лікуванні безплідності в програмі ЗІВ.

При зіставленні результатів виміру у фолікулярній рідині концентрації простагландинів, продуктів перекисного окислення ліпідів та активності антиоксидантних ферментних систем у стимульованих циклах встановлено, що вибір схеми стимуляції суперовуляції не впливає на досліджені показники.

Виявлено достовірний взаємозвязок між станом процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині і здатністю ооцитів до запліднення in vitro. Підвищення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині негативно впливає на морфологічні й, у великій мірі, функціональні характеристики ооцитів, що проявляється в тенденції до збільшення кількості клітин з ознаками деградації, а також у достовірному зниженні їх здатності до запліднення, погіршенні морфологічних властивостей ембріонів.

Підвищення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині найбільш виражене в групах з найменшим відсотком запліднення ооцитів і з більшою фрагментацією ембріонів. Про це свідчить підвищений вміст продуктів перекисного окислення ліпідів (малонового діальдегіду і дієнових конюгатів) у фолікулярній рідині.

У фолікулярній рідині при підвищенні інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів відзначається достовірне збільшення концентрації відновленого глутатіона і супероксиддисмутазної активності. Збільшення активності супероксиддисмутази в 3,8 рази у групі з найменшим відсотком запліднення свідчить про значення супероксидного радикала, як найбільш небезпечної реактивної кисневої сполуки у фолікулярній рідині.

Достовірних змін активності глутатіонпероксидази, глутатіонтрансферази і каталази у фолікулярній рідині в звязку зі змінами інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів не виявлено.

Збільшення інтенсивності перекисного окислення ліпідів значною мірою впливає на обмін простагландинів у фолікулярній рідині. Надмірний вплив реактивних кисневих сполук приводить до зміни концентрації простагландинів у фолікулярній рідині - зростає концентрація Pg F2a при відносному зниженні концентрації Pg E2. У більшому ступені змінюється співвідношення Pg E2/F2a ;

Запропонований комплекс біохімічних досліджень, що включає визначення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів, активності супероксиддисмутази, концентрації відновленого глутатіона і співвідношення Pg E2/F2a у фолікулярній рідині, може бути використаний при застосуванні допоміжних репродуктивних технологій для прогнозування здатності ооцитів до запліднення і вірогідності розвитку повноцінних ембріонів.

ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

1. З огляду на відсутність критеріїв для оцінки інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині пацієнток в програмі ЗІВ до пункції й аспірації ооцитів, є рекомендованим максимально скоротити перебування ооцитів у фолікулярній рідині після аспірації фолікулів. Для досягнення цієї мети є оптимальною система активної аспірації з використанням промивних середовищ у процесі пункції. Ця методика сприяє більшому розведенню фолікулярної рідини на момент аспірації і мінімізації впливу компонентів фолікулярної рідини на ооцит.

2. Метод дослідження активності супероксиддисмутази у фолікулярній рідині є швидким, методично простим, неінвазивним, високоінформативним і є рекомендованим як експрес-метод для визначення здатності ооцитів до запліднення in vitro.

3. Комплекс методів в обсязі визначення у фолікулярній рідині активності супероксиддисмутази, концентрації малонового діальдегіду, дієнових конюгатів, відновленого глутатіона, співвідношення Pg E2/F2a може бути використаний для більш точного прогнозування здатності ооцитів до запліднення і вірогідності розвитку повноцінних ембріонів у програмі ЗІВ.

4. При виявленні підвищеної активності супероксиддисмутази у фолікулярній рідині, нам здається, можна ставити питання про застосування процедури intracytoplasmic sperm injection навіть при відносно задовільних характеристиках сперми. Це дозволить попередити додатковий вплив на ооцит реактивних кисневих сполук, що виробляють спермії при стандартній процедурі ЗІВ, і підвищити відсоток запліднення ооцитів in vitro.

5. З огляду на дані про здатності реактивних кисневих сполук безпосередньо впливати на генетичний апарат клітини, доцільно акцентувати увагу на випадках, в яких виявляється підвищення інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів у фолікулярній рідині. Імовірно, ця група хворих має потребу в більш пильному спостереженні і медико-генетичному консультуванні в тих випадках, коли настала вагітність в результаті лікування безплідності в програмі ЗІВ.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗДОБУВАЧА ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Использование фолликулярной жидкости человека на этапе культивирования гамет и эмбрионов в программе ЭКО // Проблемы репродукции. - М., - 1999. - № 6. - С. 43-47 (співавт.: Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П., Пиняев В.И.; огляд літературних джерел).

2. Влияние интенсивности процессов перекисного окисления липидов в фолликулярной жидкости человека на оплодотворение ооцитов и развитие эмбрионов при лечении бесплодия методом оплодотворения in vitro // Медицина сьогодні і завтра. - Харків, - 2000. - № 1. - С. 102 - 104 (співавт.: Рязанцев В.В.; збір матеріалу та його аналіз, огляд літературних джерел, підготовка до друку).

3. Роль антиоксидантных ферментных систем фолликулярной жидкости в процессах оплодотворения ооцитов при лечении бесплодия с использованием вспомогательных репродуктивных технологий // Медицина сьогодні і завтра. - Харків, - 2001. - № 3. - С. 102 - 104 (співавт.: Петрушко М.П., Піняєв В.И., Рязанцев В.В.; збір матеріалу, огляд літературних джерел, статистична обробка, підготовка до друку).

4. Процеси перекисного окислення ліпідів, антиоксидантні ферментні системи фолікулярної рідини та процеси запліднення ооцитів in vitro при використанні допоміжних репродуктивних технологій // Педіатрія акушерство та гінекологія. - 2002. - № 2. - С. 104-107 (співавт.: Петрушко М.П., Піняєв В.И., Рязанцев В.В.; огляд літератури, збір та аналіз матеріалу, підготовка до друку).

5. Патент 48932А Україна, МПК 7, G01N33/00. Спосіб прогнозування запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro / (Україна). - № 2002075610; Заявлено 08.07.2002; Опубл. 15.08.2002, Бюл.№8. (співавт.: Петрушко М.П., Піняєв В.И., Рязанцев В.В.; огляд літератури, пошук прототипів, збір та аналіз матеріалу, підготовка заявки).

6. Заявка № 2002075609 Україна, МПК 7 G01N33/00 від 08.07.2002 на “Спосіб прогнозування запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro”, рішення на видачу патенту від 28.08.2002.

7. Заявка № 2002075611 Україна, МПК 7 G01N33/00 від 08.07.2002 на “Спосіб прогнозування запліднення ооцитів при лікуванні безплідності в програмі запліднення in vitro”, рішення на видачу патенту від 28.08.2002.

8. Морально-этические проблемы вспомогательных репродуктивных технологий // Тези доповідей міжнародного симпозіуму ""Біоетика на порозі III тисячоліття". - Харків, - 2000. - С. 98 - 99 (співавт.: Грищенко В.И., Петрушко М.П., Пиняев В.И., Юрченко Г.Г.; огляд літератури, збір матеріалу).

9. Влияние активности антиоксидантных ферментов в фолликулярной жидкости человека на оплодотворение ооцитов и развитие эмбрионов при лечении бесплодия с использованием вспомогательных репродуктивных технологий // Збірник тез конференції молодих вчених “Медицина третього тисячоліття”. - Харків, - 2001. - Т. 3. - С. 48 (співавт.: Петрушко М.П., Піняєв В.И., Рязанцев В.В.; збір матеріалу, огляд літературних джерел, статистична обробка, підготовка до друку).

10. Оптимизация программы экстракорпорального оплодотворения путем использования биологически активных сред // Збірник наукових праць. Асоціація акушерів - гінекологів України. - К.: “Фенікс”, 2001. - С. 173 - 175 (співавт.: Грищенко В.И., Геродес А.Г., Петрушко М.П., Пиняев В.И.; огляд літературних джерел).

11. Влияние интенсивности перекисного окисления липидов в фолликулярной жидкости человека на развитие эмбрионов при лечении бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения // Збірник тез конференції молодих вчених “Медицина третього тисячоліття”. - Харків, - 2002. - С. 113 (співавт.: Петрушко М.П., Піняєв В.И., Рязанцев В.В.; огляд літературних джерел, збір матеріалу та його аналіз, підготовка до друку).

12. Интенсивность процессов перекисного окисления липидов в фолликулярной жидкости в естественных менструальных циклах и в программе оплодотворения in vitro // Збірник наукових праць Асоціації акушерів - гінекологів України. - К.: “Інтермед”, 2002. - С. 163 - 165.