Влияние восстановленного глутатиона и ингибитора каталазы на пероксидную резистентность и скорость лизиса эритроцитов при действии хлорида железа - Дипломная работа

В настоящее время установлено, что внутрисосудистый лизис эритроцитов при патологиях и действии стрессорных факторов вызывает развитие сосудистых повреждений за счет накопления в крови гем-и железо-содержащих продуктов гемолиза. Высвободившиеся из гема ионы Fe3 увеличивают выработку активных форм кислорода, которые способны индуцировать адгезию клеток крови к стенкам сосудов и вызывать окисление липопротеинов низкой плотности.Непосредственными эндогенными предшественниками гидроксильного радикала, инициирующего цепное окисление липидов, служат ионы двухвалентного железа гемоглобина и перекись водорода (реакция Фентона)[1]. Наиболее чувствительной к окислению фракцией липидов в данном случае является фосфатидилэтаноламин, Перекись водорода служит инициатором перекисного процесса, в результате ее превращений образуются свободные радикалы, которые инициируют перекисное окисление липидов по типу цепной реакции [2]. Под влиянием эндогенной перекиси водорода в результате аутокаталитических реакций также образуются перекиси и гидроперекиси липидов. Гемоглобин может действовать как ловушка (scavenger) для пероксида водорода, при этом ион железа гемоглобина Fe (II) окисляется до Fe (III) и даже до Fe (IV) с образованием соответственно таких форм гемоглобина как метгемоглобин и феррил гемоглобин. Под влиянием перекиси водорода могут образовываться не только метгемоглобин и феррил гемоглобин, но и временно существующие белковые радикалы гемоглобина и гем-белковые сшивки.Эритроциты (гематокрит 20%) инкубировали при 370С в изотоническом буфере без добавок (контроль) или в присутствии соответствующих реагентов (опытные группы, табл.2.1). Инкубация в присутствии хлорида железа (III) как интактных, так и предварительно обработанных одним из дополнительных реагентов (азидом натрия, глутатионом, цистеином или сапонином) эритроцитов проводилась в течение 60 минут. Эритроциты, предварительно инкубированные в присутствии азида натрия (для ингибирования каталазы), глутатиона или цистеина (для модуляции тиолового статуса), или сапонина (для увеличения проницаемости липидного бислоя), далее осаждались (10 мин при 3 тыс. об/мин) и осадок эритроцитов добавляли в среду, содержащую FECL3. В контрольных пробах к 5.5 мл изотонического буфера добавлялось 50 мкл эритроцитов 50 мкл азида натрия, в опытных к 5 мл изотонического буфера добавлялось 50 мкл эритроцитов, 50 мкл азида натрия , а затем добавлялось 50 мкл перекиси водорода до конечной концентрации 0,3% (предварительная обработка эритроцитов глутатионом и азидом натрия (группы 3 и 5) происходила в течение 15 минут при 37°С в термостате при помешивании, после чего эритроциты осаждали в течение 10 мин при 3 тыс. об/мин, отмывали азид натрия, и вносили 0,5 мл эритроцитов каждой группы в колбочки, содержащие 0,05% раствор FECL3 в 4,5 мл изотонического буфера и инкубировались 60 минут при 37°С в термостате при помешивании; эритроциты 2 и 4 группы инкубировались в течение 15 минут при 37°С в термостате при помешивании соответствующими реагентами, после чего эритроциты осаждали в течение 10 мин при 3 тыс. об/мин, отмывали азид натрия, и вносили 0,5 мл эритроцитов в 4,5 мл изотонического буфера и инкубировались 60 минут при 37°С в термостате при помешивании)У эритроцитов, инкубировавшихся в присутствии азида натрия в выбранной концентрации, в том числе после их последующей инкубации с хлоридом железа установлено снижение каталазной активности на 30% и на 20%, соответственно. Инкубация в присутствии хлорида железа или хлорида железа после предобработки глутатионом не вызывала изменений каталазной активности. Предварительная инкубация эритроцитов в присутствии ингибитора каталазы азида натрия вызывала повышение процента лизиса относительно интактных эритроцитов в 1,5-4 раза в зависимости от последующего воздействия (в контрольной группе как обработанных перекисью водорода, так и не обработанных ею - приблизительно в 2,5 раза, в группе, инкубировавшейся в присутствии глутатиона и хлорида железа - в 3 раза) .Добавление Н2О2 в среду инкубации вызвало дальнейшее повышение процента лизиса только эритроцитов, предварительно инкубированных с восстановленным глутатионом (в 1,8 раз). Предварительная обработка азидом натрия эритроцитов, использовавшихся для изучения пероксидного гемолиза, привела к повышению степени лизиса в контрольной группе, при инкубации с глутатионом, а также при инкубации с глутатионом и хлоридом железа. Восстановленный глутатион, очевидно, участвует в восстановлении ионов железа до Fe2 с их последующим вступлением в реакцию Фентона, что может объяснить значительное снижение пероксидной резистентности эритроцитов при совместной обработке глутатионом и хлоридом железа, в то время как каталазная активность сохраняется на уровне контроля..У эритроцитов, инкубированных в присутствии азида натрия в выбранной концентрации, в том числе после их последующей инкубации с хлоридом железа установлено снижение каталазной активности на 30% и на 20%, соответственно. Предварительная инкубация

В настоящее время установлено, что внутрисосудистый лизис эритроцитов при патологиях и действии стрессорных факторов вызывает развитие сосудистых повреждений за счет накопления в крови гем- и железо-содержащих продуктов гемолиза. Высвободившиеся из гема ионы Fe3 увеличивают выработку активных форм кислорода, которые способны индуцировать адгезию клеток крови к стенкам сосудов и вызывать окисление липопротеинов низкой плотности. Из литературных данных известно, что содержание железа в окисленной форме коррелирует с риском сердечнососудистых заболеваний, что обуславливает постоянный научный интерес к изучению факторов, отвечающих за устойчивость эритроцитов к гемолизу. Особую актуальность приобретает изучение пероксидной резистентности клеток крови, т.к. повышенное содержание перекиси водорода в кровяном русле отмечается при различных патологических состояниях, в том числе инфекциях и воспалении.

Учитывая прооксидантный характер действия ионов железа на мембраны клеток, можно предположить ключевую роль антиоксидантных систем в защите эритроцитов от лизиса. Вместе с тем, механизмы гемолитического действия соединений железа, а также роль каталазы и восстановленного глутатиона, как ключевых компонентов антиоксидантной защиты, в поддержании пероксидной резистентности эритроцитов остаются малоизученными. В связи с вышесказанным, целью настоящей работы являлось изучение влияния хлорида железа (ІІІ) на пероксидную резистентность и скорость лизиса эритроцитов человека в условиях ингибирования каталазной активности и повышения содержания восстановленного глутатиона в опытах in vitro.