Выделение фотохимически активных фрагментов тилакоидных мембран хлоропластов, обогащенных ФС-2 из листьев гороха. Выделение из них белков водоокисляющего комплекса. Влияние ионов двухвалентных металлов на карбоангидразоподобную активность PsbPи PsbQ.
Аннотация к работе
Углекислый газ, поступающий в клетку из окружающей среды, электроны в виде НАДФН и энергия в виде АТФ, поступающие из цепи переноса электронов, ассоциированной с тилакоидной мембраной обеспечивают синтез углеводов. Возник интерес действию других металлов на КА активность, например, входящих в КА или имеющих сходный радиус с теми металлами, для которых уже показана активность, либо установить действие тяжелых металлов. При возбуждении П700 в реакционном центре ФС-1 энергией, эквивалентной 1 кванту длинноволнового красного света, электрон захватывается мономерной формой хлорофилла a (A1; акцептор электрона) и затем последовательно передается переносчикам электронов А2 и Ав (железосерные белки FES), ферредоксину (водорастворимый FES-белок) и ферредоксин - NADP-оксидоредуктазе с FAD в качестве кофактора. РЦ входит в состав более крупного белкового комплекса, называемого «ядерным» В его состав у высших растений, кроме белков D1, D2, цитохром b-559 входят БЕЛКИСР43, CP47, PSBO; могут входить белки PSBP, PSBQ. Внутреннюю антенну ФС-2 составляют два белка - CP43 и CP47, которые расположены по обе стороны от D1 и D2 (белков РЦ ФС-2).Им может быть один (или несколько) из известных белков ФС-2, обладающий неизвестной ранее функцией (карбоангидразной активностью), или неизвестный белок.Принимая во внимание значимость карбоангидразной активности для функционирования донорной стороны ФС-2, особое внимание было уделено исследованию карбоангидразной активности внешних водорастворимых белков водоокисляющего комплекса. Особенно эффективным активатором КП-активности оказался ион Mg2 , несколько менее эффективными - ионы Ca, Cu, Mn. Вопрос о специфичности ионов металлов в активации КП-активности PSBP пока остается открытым. Было показано, что очищенный от ионов металлов белок PSBQОБЛАДАЛ КП-активностью, которая сильно возрастала в присутствии ионов Zn2 , в присутствии ионов Саи Mn КП-активность увеличивалась с в два раза меньшей эффективностью.Фрагменты тилакоидных мембран хлоропластов, обогащенных фотосистемой 2, выделенные из листьев гороха, обладали хорошей фотохимической активностью и по своему белковому составу соответствовали препаратам фотосистемы 2, описанным ранее в научной литературе. Выбранные нами методы и подходы позволили выделить изолированные фракции белков PSBPИ PSBQC сохранением их КП-активности.
Введение
ион металл белок фотохимический
Фотосинтез - процесс образования богатых энергией органических веществ из веществ энергетически бедных - углекислого газа и воды. Углекислый газ, поступающий в клетку из окружающей среды, электроны в виде НАДФН и энергия в виде АТФ, поступающие из цепи переноса электронов, ассоциированной с тилакоидной мембраной обеспечивают синтез углеводов. В состав тилакоидной мембраны входят три белковых комплекса - фотосистема 1, фотосистема 2 и цитохромный b6f комплекс.
Благодаря фотосинтезу стала возможной жизнь на поверхности нашей планеты. Кроме того, результатом деятельности фотосинтезирующих организмов являются запасы топлива, к сожалению, исчерпаемые. Однако, знание механизмов этого процесса поможет обрести человечеству источник неиссякаемой экологически чистой энергии. Например, знание механизма фотосинтетического расщепления воды позволит получать водород как топливо практически в неограниченном количестве.
Фотосинтетическое окисление воды происходит в ФС-2 в неорганическом ядре, состоящем из ионов Ca и Mn, стабилизированном тремя внешними водорастворимыми белками: PSBO, PSBP, PSBQ. Выяснено, что для стабилизации и функционирования ВОК также необходимы ионы бикарбоната (БК). Для поддержания необходимого уровня бикарбонатов ФС-2 может быть необходим специальный фермент - карбоангидраза, катализирующий обратимую гидратацию углекислого газа.Присутствие КА показано для всех четырех царств живой природы: бактерий, животных, грибов, растений. В последние десятилетия, после того как стало известно, что работа ФС-2 зависит от содержания БК, интерес к изучению КА активности резко возрос.
Известно, что тилакоиды имеют как минимум два источника КА активности в ФС-2. Один из источников - Mn-стабилизирующий белок PSBO (молекулярная масса 33 КДА), другой источник - ассоциирован с ФС-2, который можно выявить путем отмывки белка PSBO 1М раствором CACL2. В ходе экспериментов было установлено, что источники КА активности зависят от присутствия ионов металлов Ca2 , Mn2 . Возник интерес действию других металлов на КА активность, например, входящих в КА или имеющих сходный радиус с теми металлами, для которых уже показана активность, либо установить действие тяжелых металлов. Выяснение механизма действия ионов тяжелых металлов на ФС-2 является актуальной проблемой, важной для развития сельского хозяйства и фундаментальных представлений о механизме функционирования ФС-2. Так как, по имеющимся в настоящий момент данным, ионы металлов могут влиять на КП-активность белков ВОК ФС-2, необходимо изучить этот вопрос более детально. Поэтому целью нашей работы явилось изучение влияния ионов металлов на карбоангидразоподобную активность внешних водорастворимых белков PSBP и PSBQ фотосистемы 2. Для достижения данной цели мы выделили несколько задач: 1) Выделить фотохимически активные фрагменты тилакоидных мембран хлоропластов, обогащенных ФС-2 из листьев гороха (PISUMSATIVUML. cv. Moscowski 559);
2) Выделить из них белки водоокисляющего комплекса - PSBPИ PSBQ;
3) Установить влияние ионов двухвалентных металлов на карбоангидразоподобную активность белков PSBPИ PSBQ;
1. Фотосинтез
1.1 Роль фотосинтеза
Фотосинтез - это окислительно-восстановительный процесс, протекающий в несколько этапов, в котором происходит восстановление диоксида углерода до углеводов и окисление воды до кислорода.. (http://fizrast.ru/fotosintez/etapy.html)
Результатом возникновения фотосинтеза в процессе эволюции являетсявеликое множество различных представителей живого мира на Земле. Нефть, газ и уголь - это биотопливо, накопившееся в результате захвата и преобразования солнечной энергии фотосинтезирующими организмами. В настоящее время фотосинтезможет помочь человечеству обрести источник неиссякаемой экологически чистой энергии. Так как процесс расщепления воды может дать практически неограниченное количество водорода.
Более трех миллиардов лет назад первые фотосинтезирующие организмы (фотосинтезирующие бактерии) приобрели способность эффективно захватывать и преобразовывать солнечную энергию для синтеза органических молекул в процессе аноксигенного фотосинтеза. Ископаемые животные организмы и растительные остатки, найденные в земной коре, Следующим этапом эволюции фотосинтеза является появление оксигенного фотосинтеза. Этот процесс осуществлялся у первых цианобактерий и сопровождался выделением молекулярного кислорода.Накопление кислорода в атмосфере благодаря широкому распространению цианобактерий привело к первой экологической катастрофе на планете - возникновение аэробной атмосферы. Это позволило предкам современных живых организмов существовать на суше.а также нынешнее разнообразие живых организмов дают представление о значимости фотосинтеза. Ведь именно этот процесс привел к взрыву биологической активности на Земле, позволив жизни процветать и значительно изменяться.
1.2 Строение и функционирование фотосинтетического аппарата высших растений
Основным органом, где протекает фотосинтез в высших растениях является лист, а органоидами - хлоропласты. Внутри хлоропластов располагаются тилакоиды и в их мембранах находятся фотосинтетические пигменты, улавливающие кванты света. В молекуле хлорофилла - основного фотосинтетического пигмента (рис. 1) -выделяют порфириновую «головку» с атомом магния в центре и фитольный «хвост». Порфириновая «головка» представляет собой плоскую структуру, является гидрофильной, поэтому обращена к водной среде стромы. За счет своей гидрофобности фитольный «хвост» удерживает молекулу хлорофилла в мембране тилакоидов.
Растения имеют характерную зеленую окраску изза того, что хлорофиллы отражают зеленый, а поглощают красный и сине-фиолетовый свет. Молекулы хлорофилла в мембранах входят в состав пигмент-белково-липидных комплексов, названных фотосистемами. У растений и сине - зеленых водорослей имеются ФС-1 и ФС-2, у фотосинтезирующих бактерий - ФС-1. Только ФС-2 имеет способность отбирать электроны у воды.
Световая фаза фотосинтеза осуществляется при участии двух фотосистем - ФС-1 и ФС-2, содержащих пигменты и различные белки. Они вместе с цитохромным комплексом являются основными компонентами фотосинтетической цепи переноса электронов. Электрон-транспортная цепь организована в мембране в виде трансмембранных белковых комплексов (ФС-1, ФС-2 и цитохромный b6f комплекс) и подвижных переносчиков электрона (пластоцианин,ферредоксин и пул пластохинонов). (http://fizrast.ru/fotosintez/etapy.html). Эти комплексы фотосинтетического аппарата гетерогенно распределены в мембране тилакоидов (рис.2). (В. Н. Гольцев, 2014)
Рис. 2. Схематическое изображение белковых комплексов, включенных в реакции фотоиндуцированного переноса электронов и протонов в тилакоидной мембране фотосинтетических оксигенных организмов
Рис. 3. Z-схема фотосинтеза
Z-схема, или схема нециклического транспорта электронов, получила свое название изза сходства с буквой Z. Ее принцип впервые был предложен в 1960 г. Р. Хиллом и Ф. Бендаллом и в 1961 г. был подтвержден работами Л. Дюйзенса.
Конечным этапом световых стадий фотосинтеза является восстановление NADP , которое осуществляет ФС-1. При возбуждении П700 в реакционном центре ФС-1 энергией, эквивалентной 1 кванту длинноволнового красного света, электрон захватывается мономерной формой хлорофилла a (A1; акцептор электрона) и затем последовательно передается переносчикам электронов А2 и Ав (железосерные белки FES), ферредоксину (водорастворимый FES-белок) и ферредоксин - NADP-оксидоредуктазе с FAD в качестве кофактора. Наконец, редуктаза восстанавливает NADP . Именно в ФС-2 происходит фотоиндуцированное окисление воды. П700 является сильным окислителем. Донором электронов для него является ФС-2. Электроны от ФС-2 переходят на ФС-1 посредствам мобильных переносчиков и цитохромом b6f-комплексов.Исходным донором электронов для ФС-2 является вода.Энергия, освобождающаяся при движении электронов от П680 до П700, используется для синтеза АТФ из АДФ и неорганического фосфата (фотофосфорилирование). (Холл Д., Рао К., 1983)
Фотохимический реакционный центр ФС-2П680 поглощает энергию, эквивалентную 1 кванту коротковолнового красного света, и переходит в синглетное возбужденное состояние, отдает электрон феофетину (Фео). От Фео электроны, теряя энергию, последовательно передаются на пластохиноны - QA и QB, в пул липидорастворимых молекул пластохинона (PQ), переносящих через липидную фазу мембраны электроны и протоны в цитохромный b6f комплекс, который затем восстанавливает Cu-содержащий белок пластоцианин (Пц). Электроны с Пц переходят на вакантное место в П700.
Вакантное место («дырка») в П680 заполняется двумя электроном из содержащего Mn - неорганического ядра водоокисляющего комплекса. Этот комплекс связывает воду и восстанавливается за счет ее электронов. Для осуществления этой реакции в белковом комплексе необходимы Mn и С1-, а также Са2 . Таким образом, основным источником электронов для восстановления NADP является вода, разложение которой происходит в ФС-2.
1.3 Фотосистема 2
ФС-2 (Рис. 4) содержит более 20 различных белков и пигмент-белковых комплексов, ее состав зависит от условий окружающей среды. Полипептиды ФС-2 выполняют ряд важных функций: часть поглощают энергию света и передают энергию возбуждения, участвуют в разделении зарядов и окислении воды, стабилизируют структуру димеров ФС-2, участвуют в сборке мономера и образовании димера, связывают и ориентируют молекулы хлорофилла а и b, а также каротиноиды. В ФС-2 условно выделяют части, выполняющих разные функции: 1) реакционный центр , 2) светособирающий комплекс, 3) водоокисляющий комплекс.
Рис. 4. Схематическое изображение фотосистемы 2 в тилакоидной мембране. D1 ИD2 белкиреакционногоцентра (РЦ). (Mn) - марганцевый кластер, участвующийв фотоокислении воды; P680 (П680) - специальная пара молекул хлорофилла реакционного центра; Phe (Фео) - феофитин; QA - связанный пластохинон; QB - пластохинон, подвижный переносчик электронов;Tyr - аминокислотный остаток тирозина-161 белка D1 (Yz); PQ - пул подвижных молекул пластохинона. Антенные комплексы: LHC-II (ССК-2) - периферийный светособирающий комплекс ФС-2; CP47 и CP43- хлорофилл-белковые комплексы внутренней антенны, имеющие соответственно молекулярные массы 47 и 43 КДА.
1.3.1 Реакционный центр
Реакционный центр обеспечивает фотосинтетическое разделениезарядов - первый этап преобразования солнечной энергии в энергию химических связей. Он содержит интегральные белки D1 (PSBA) и D2 (PSBD), каждый из которых образован пятью трансмембранными ?-спиралями, расположенными в мембране пррактически параллельно друг другу (Barberetal., 1987). В состав РЦ ФС-2 также входит третий интегральный белок - цитохром b559,количество молекул которого на один РЦ точно не установлено (предполагается 1-2 молекулы).
На белках D1 и D2 расположены кофакторы переноса электрона в ФС-2 - фотоактивная А-цепь: TYRZ, П680, CHLD1, PHEOD1, QA и QB. Энергия света, поглощенная пигментами светособирающего комплекса ФС-2, переносится к первичному донору электрона P680 - специализированному димеру хлорофиллов а (Renger, 1992).Разделение зарядов в реакционном центре происходит за счет перехода молекулы Р680в возбужденное синглетное состояние, за счет энергии поглощенного кванта света. В первой стадии разделения зарядов принимает участие молекула хлорофилла a (CHLD1), которая располагается между П680 и PHEOD1 (рис. 5.). Энергия возбуждения возможно делокализуется между четырьмя молекулами хлорофилла(специальная пара PD1PD2 и вспомогательными CHLD1 и CHLD2). (Barber, 2002)
РЦ входит в состав более крупного белкового комплекса, называемого «ядерным» В его состав у высших растений, кроме белков D1, D2, цитохром b-559 входят БЕЛКИСР43, CP47, PSBO; могут входить белки PSBP, PSBQ.
Структура ядерного комплекса высших растений крайне близка к структуре цианобактерий: для цианобактерии Thermosynechococcus elongatus показано наличие 35 молекул хлорофилла а, 2 молекул феофитина, 3-х пластохинонов и 12 ?-каротинов в расчете на один мономер, а также марганцевого кластера и других кофакторов. Для «ядерных» комплексов из высших растений (шпината) показано наличие от 35 до 80 молекул хлорофилла, одной молекулы QA и марганцевого кластера в расчете на один РЦ.
Рис. 5. Схема расположения кофакторов переноса электрона в ФС-2 (Guskovetal., 2009). Красные стрелки - этапы переноса электронов с указанием времени переноса электрона. Голубые - возможные пути переноса электрона (Muh et al., 2012).
1.3.2 Светособирающий комплекс (ССК)
Светособирающий комплекс необходим для эффекктивного улавливания квантов света с большой площади и направленной передачи энергии света в виде энергии возбужденного состояния хлорофилла в реакционный центр ФС-2. Белки ССК выполняют следующие функции: - определяют специфичное связывание, ориентацию и распределение молекул пигментов;
- служат посредниками во взаимодействии с другими белковыми компонентами в структурной организации антенных систем, обеспечивая перенос энергии возбуждения и регуляцию этого процесса
ССК условно разделяют на внешнюю и внутреннюю антенны.
Внутреннюю антенну ФС-2 составляют два белка - CP43 и CP47, которые расположены по обе стороны от D1 и D2 (белков РЦ ФС-2). СР43 (с ним скоординировано 13 молекул хлорофилла) находится со стороны белка D1, а СР47 (содержит 16 молекул хлорофилла) - со стороны белка D2.К внутренней антенне акже относят белки CP29, CP26, CP24. Внешняя антенна представленна белками ССК-2 разного состава.
Эти комплексы формируют внешнюю антенну с высоким соотношением пигмент: белок. Регулирование светособирающей функции происходит за счет обратимого, находящегося под окислительно-восстановительным контролем фосфорилирования белков ССК-2 (Lhcb1 и Lhcb2), и происходящая в результате латеральная миграция ССК-2 от ФС-2 к фотосистеме 1 (ФС-1) приводит к перераспределению энергии возбуждения между ФС-2 и ФС-1. (Шитов, 2013)
1.3.3 Водоокисляющий комплекс (ВОК)
Для окисления воды в растениях и цианобактериях требуются мембранные белки РЦ и внутренней антенны: СР47, СР43, D1, D2, ? и ? субъединицы цитохрома b-559. Фотоокисление воды происходит в части ФС-2, обращенной в просвет тилакоида.
В активном центре водоокисляющий комплекс содержит четыре иона марганца и один ион кальция, которыесвязаны между собой при помощи ?-оксо мостиков (Mn4CAO5-кластер), активный в окислительно-восстановительном отношении тирозин-161 (TYRZ) и другие аминокислотные остатки, которые вместе функционируют как каркас. Mn4CAO5 - кластер ФС-2 высших растений окружен полипептидными цепями интегральных белков РЦ и периферических белков водоокисляющего комплекса (PSBO, PSBP, PSBQ). Эти полипептидные цепи стабилизируют структуру Mn4CAO5-кластера, создавая условия для фотоокисления воды. Для образования одной молекулы кислорода требуется две молекулы воды, дающие 4 электрона. Для полного разложения воды требуется 4 кванта света. В результате в люмен выходят четыре полученные протона. (Холл Д., Рао К., 1983)
2Н2О - 4е - 4Н > О2^
Важную роль в обеспечении стабильности Mn4CAO5 - кластера играет белок PSBO (марганец - стабилизирующий белок). В процесс образования кислорода также принимают участие: ион Ca2 ; один или два иона Cl-. Предполагается, что в обеспечении этими ионами в процессе сборки водоокисляющего комплекса, а также в их сохранении в нормально функционирующей ФС-2 участвут внешние водорастворимые белки ВОК PSBPИ PSBQ.
2. Карбоангидразная активность фотосистемы 2
Кромеионов Mn2 ,Са2 ИCL- важное значение для функционирования ФС-2 имеют ионы бикарбоната. В обеспечении ФС-2 ионами бикарбоната может быть нужен специальный фермент - карбоангидраза.
Карбоангидраза (карбонатгидролиаза, К.Ф.4.2.1.1.) - фермент, катализирующий обратимую гидратацию углекислого газа (СО2 Н2О ? Н2СО3 ? Н НСО3), присутствует во всех живых организмах: растениях, животных, бактериях, грибах. Карбоангидразы делят на 6 основных классов - ?, ?, ?, ?, ? и ?, представители которых имеют незначительные сходства в аминокислотных последовательностях. В одном организме могут находиться представители различных классов карбоангидраз (Moroney etal., 2001; Куприянова и Пронина, 2011). Карбоангидразы играют важную роль в фотосинтезе многих организмов, как цианобактерий, так водорослей и высших растений (Moroneyetal., 2011). В ФС-2 высших растений и некоторых одноклеточных водорослей обнаружена карбоангидразная активность.
2.1 Карбоангидразная активность ФС-2 высших растений и ее свойства
Впервые наличие карбоангидразной активности было показано на листьях кукурузы в работе Алана Стемлера 1986 года. (Stemler, 1986). В 1999 году на горохе (как одном из представителей С3 растений) впервые было показано присутствие двух источников карбоангидразной активности в тилакоидах, один из которых ассоциирован с ФС-2 (Moskvinetal., 1999).
Возможные функции карбоангидразы (карбоангидраз) в фотосистеме 2: 1. Участие карбоангидразы в метаболизме углерода по механизму, предложенному ранее для микроводорослей (Пронина и Семененко, 1984; PRONINAANDBORODIN, 1993; Пронина, 2000; Пронина с соавт., 2002).
2. Участие в преобразованиях H HCO3 = H2O CO2, которое может быть более важно для ФС-2, чем наличие СО2-концентрирующего насоса, как предполагалось в работе Парка с соавт. (Dai et al., 2001).
3. КА может обеспечивать накопление бикарбоната как компонента нативной ФС-2, или дегидрирование бикарбоната предотвращает опасное локальное увеличение концентрации протонов, особенно в условиях освещения высокой интенсивности (Villarejo et al., 2002;Moskvin et al., 2004). Было предположено, что для КА Cah3 из ФС-2 Chl. REINHARDTIIКАРБОАНГИДРАЗА может быть ответственна за снабжение ВОК бикарбонатом и/или за удаление излишка протонов, выделяемых в процессе выделения кислорода, особенно в условиях высокой интенсивности освещения, как это предложено (Villarejoetal., 2002; Rudenkoetal., 2007; Shutovaetal., 2008).
Несмотря на ассоциации КА-активности ФС-2, ее функции остаются не вполне ясными. В настоящее время не получен однозначный ответ на вопросы: нужна ли карбоангидразная активность для функционирования ФС-2 высших растений и что является источником этой активности .
2.2 Носители карбоангидразной активности в ФС-2 высших растений
Ранее предполагалось, что с мембранами ФС-2 ассоциировано два источника карбоангидразной активности, причем, один связан с периферическими белками (возможно с PSBO (Luetal., 2005; LUANDSTEMLER, 2007)) или с низкомолекулярными белками ФС-2 (Rudenkoetal.,2007; Ignatovaetal., 2011), а другим источником карбоангидразной активности является комплекс ФС-2, лишенный внешних водорастворимых белков (Daietal., 2001; Luetal., 2005; LUANDSTEMLER, 2007; MCCONNELLETAL., 2007) или «ядерный» комплекс (Khristinetal., 2004; Moskvinetal., 2004)
Позднее было установлено, что этот белок (PSBO) обладал КА-активностью только в присутствии Mn2 и оптимальная концентрация иона для проявления активности составляла 1 ММ (Шитов с соавт. 2009). Кроме того, было установлено, что белки PSBPИ PSBQ, как совместно, так и по отдельности обладали КА-активностью. Также было показано, что КА-активность внешних белков ВОК (PSBP, PSBOИ PSBQ) не подавлялась ингибиторами карбоангидраз и поэтому активность обозначили как карбоангидразоподобную (КП-активность). Совместная КП-активность фракции белков PSBPИ PSBQВОЗРОСЛА в 5 раз в присутствии 200 МКМ Mn2 (максимальный эффект Mn2 ) и полностью подавлялась в присутствии ионов Zn2 , Ca2 , Mg2 (Шитов с соавт.).
Было показано, что супернатант после CACL2-обработки препаратов ФС-2 из гороха (содержащий белки PSBO, PSBP и PSBQ) также обладал карбоангидразной активностью. Авторы этой работы связывали наличие карбоангидразной активности в супернатанте только с присутствием PSBO, так как, по их мнению, нативные белки PSBP и PSBQ,полученные методами генной инженерии не обладают карбоангидразной активностью, как не обладают ей предшественники этих белков (Lu et al., 2005). Было установлено, что белок PSBO в присутствии Mn2 обладает карбоангидразной активностью.
3. Роль ионов металлов в биохимических процессах высших растений
Ионы магния
Он входит в состав фотосинтетического пигмента - хлорофила и участвует в аккумуляции солнечной энергии в ходе фотосинтеза (Якушкина И.И., 2004). Также магний принимает участие в передвижении фосфора и в углеводном обмене, влияет на активность окислительно-восстановительных процессов.
При недостаточности магния снижается содержание хлорофилла в зеленых частях растений Поскольку хлорофилл поглощает солнечную энергию и с ее помощью углекислый газ и вода превращаются в сложные органические вещества: сахара, крахмал и др., само существование зеленых растений невозможно без магния. (Полевой В.В., 1989)
Ионы марганца
Марганец, как и медь, играет важную роль в окислительно - восстановительных реакциях (он характеризуется высоким показателем окислительно-восстановительного потенциала), протекающих в растении. Он входит в состав ферментов, с помощью которых происходят данные процессы. Марганец непосредственно участвует в фотосинтезе, дыхании, в углеводном и белковом обменах. В растения марганец находится в разной степени окисления (Mn2 , Mn3 , Mn4 ), но поступает в растение в виде ионов Mn2 . Среднее содержание данного элемента в растениях 0,001 %.
Ионы марганца необходимы для нормального протекания фотосинтеза, так как входят в состав активного центра водоокисляющего комплекса ФС-2. Кроме того, марганец участвует в восстановлении С02, играет значимую роль в поддержании структуры хлоропластов. При недостатке марганца хлорофилл незамедлительно начинает разрушаться при освещениирастений. (Якушкина И.И., 2004)
Ионы кальция
Кальций поступает в растение в течение всей его жизни в виде катионов Са2 (Полевой В.В., 1989). Часть кальция находится в клеточном соке. Здесь он поддерживает определенное физиологическое равновесие ионов в клетке, главным образом нейтрализуя избыточно образующиеся органические кислоты; влияет на вязкость и проницаемость протоплазмы.(Малиновский В.И., 2004)
Помимо прочего кальций участвует в углеводном и белковом обмене растений, образовании и росте хлоропластов. От кальция в большей степени зависит построение нормальных клеточных оболочек. Кальций также как и марганец как входит в состав активного центра ВОК ФС-2.
Ионы цинка
Поступает в растение в виде ионов Zn2 . Среднее содержание цинка в растениях 0,002%. В растениях цинк не участвует в окислительно-восстановительных реакциях, поскольку не обладает переменной валентностью. Он входит в состав более 30 ферментов, в т. ч. фосфатазы, карбоангидразы, алкогольдегидрогеназы, РНК-полимеразы и др. Кроме того, цинк участвует в синтезе аминокислоты триптофана, являющеся предшественником ростовых веществ (ауксинов) в растении. (Полевой В.В., 1989). Фермент КА важен для многих этапов процесса фотосинтеза. Например, углекислый газ, поступая в клетку, растворяется в воде, образуя Н2СО3: СО2 Н2O HCO3 Н . Фермент карбоангидраза, катализируя высвобождение С02 из гидрата окиси углерода, способствует его быстрой фиксации в цикле Кальвина-Бенсона.. (Якушкина И.И., 2004)
Цинк благоприятен для процесса синтеза хлорофилла. Вызываемое недостатком цинка нарушение процессов синтеза хлорофилла приводит к появлению на листьях хлоротичных пятен светло-зеленого, желтого и даже почти белого цвета. Однако, избыток цинка токсичен для растения, связан недостатком меди, железа и редких случаях приводит к гибели растения. (Полевой В.В., 1989)
Ионы меди
Медь является переходным и тяжелым металлом, для которого доказано токсическое действие. При взаимодействии с НАДФН-оксидазой он вызывает образование Н2О2. В митохондриях и хлоропластах ионы тяжелых металлов могут являться акцептором при переносе электронов или неправильно направляют перенос электрона (в зависимости от окислительно-восстановительного статуса металла), что вызывает образование свободных радикалов. Кроме того, ионы тяжелых металлов могут быть причиной мутаций. (ARUNK. Shanker, 2008).
Ионы медь входят непосредственно в состав ряда ферментных систем. 75% ионов меди, содержащейся в листьях, сконцентрировано в хлоропластах. Также в хлоропластах находится маленький, водорастворимый, медьсодержащий белок синего цвета - пластоцианин(молекулярная масса около 10,5 КДА). В пластоцианине содержание меди составляет 0,57%. Медь обладает способностью к обратимому окислению и восстановлению (Cu2 е -> Cu ), пластоцианин участвует в переносе электронов от ФС-2 к ФС-1. При дефиците меди снижается активность ФС-1. (Якушкина И.И., 2004)
Исследования последних лет свидетельствуют, что ингибирующее действие ионов тяжелых металлов на фотосинтетические функции растений обусловлено их взаимодействием с компонентами ФС-2.
4. Объекты и методы исследований
4.1 Выделение тилакоидов по методу Berthold, Babcock, Yocum, 1981 с модификациями Ford, Evans, 1983 (на основе оригинальной статьи)
Листья растения обрываются от черешков и промываются дистиллированной водой. Далее они помещаются в гомогенизатор и заливаютсях средой, состоящей из раствора 0,4 М сахарозы (обеспечивающей изотоничность по отношению к внутреннему содержимому хлоропластов), Tris-HCL (PH 7.8) - обеспечивает постоянство PH при выделении, ЭДТА образует комплексы с ионами металлов, аскорбат натрия - восстановитель, нейтрализует эндогенные клеточные оксиданты. Гомогенат фильтруют и центрифугируют (1000-2000 оборотов в минуту на центрифуге К-70 в течении 3-4 минуты) для удаления разрушенных клеточных элементов и волокон фильтра.
Супернатант центрифугируют при 5500-6000 оборотов в минуту на центрифуге К-70 в течении 20 минут. На этом этапе в осадке получают интактные хлоропласты. Супернатант отбрасывают. Далее оболочку хлоропластов надо разорвать, поместив их в гипотоническую среду. Вода в этом случае будет поступать внутрь хлоропласта и разорвет его оболочку. Осадок хлоропластов ресуспендируют в гипотонической среде : 2 MMMES
(PH 6.3), 15 MMNACL, 5 MMMGCL2.
Центрифугируют раствор при 5500-6000 оборотов в минуту на центрифуге К-70 в течении 20 минут. В осадке получают разрушенные хлоропласты. Супернатант отбрасывают. Ресуспендируем осадок кисточкой и затем в стеклянном гомогенизаторе в среде: 20 MM MES-NAOH (PH 6,3), 15 MMNACL, 5 MMMGCL2 ,0,33 M сахароза.
Доводим объем раствора тилакоидов до концентрации хлорофилла 2 мг/мл. Определяем концентрацию хлорофилла и функциональную активность ФС-2 в полученных тилакоидах.
4.2 Выделение частиц ФС-2 из тилакоидов по методу schiller и dau (2005 г)
Осаждают тилакоиды из раствора на центрифуге (6000g, 20 мин) и ресуспендируют в среде с бетаином (25 ММ HEPES (PH 6,0), 15 ММ NACL, 10 ММ MGCL2, 1 М глицин-бетаина) до концентрации ~ 2,2 мг/мл. Оставляют раствор тилакоидов в холодильнике в темноте на 1 ч.
Добавляют к суспензии тилакоидов (2 мг хл/мл) Тритон Х-100 к хлорофиллу 20:1(20мг Тритон Х-100/1 мг хлорофилла). Для того, чтобы не происходило образование локально высокой концентрации тритона, добавление раствора Тритона Х-100 производят по капле по стенке сосуда при перемешивании суспензии на магнитной мешалке.
Инкубируют раствор при 0 °С в темноте на мешалке в течении 20 мин. Центрифугируют раствор на высокоскоростной центрифуге при 47900 g в течении 22 мин. Супернатант, содержащий ФС-1 отбрасывают, а осадок ресуспендируют в среде с бетаином и повторяем центрифугирование при 47900 g в течении 15 мин. Такой цикл проводят 4 раза. На этом этапе происходит отмывание препаратов ФС-2 от Тритона Х-100.
4.3 Измерениеконцентрациихлорофилла
Общее содержание хлорофиллов "a" и "b" определяли по методу (Arnon, 1949). К 0,05 мл исходной суспензии добавляли 0,95 мл воды и 4 мл 80%-ного ацетона, измеряли оптическую плотность вытяжки при 652 нм и рассчитывали содержание хлорофилла в исходном образце по формуле Схл(мг/мл) = (28,9 . А652. L . K)/1000, где А - оптическая плотность образца при 652 нм, L - длина оптического пути, K - коэффициент разбавления суспензии.
4.4 Измерение скорости фотосинтетического выделения кислорода
Скорость фотосинтетического выделения О2 измеряли амперометрическим методом с помощью электрода типа Кларка («Hansatech» Великобритания) в среде, содержавшей: 25 ММ MES-NAOH (PH 6,5), 10 ММ NACL, 0.3 М сахарозу. Препараты освещали светом интенсивностью 1000 мкмолей фотонов/(м2·с1) (??590 нм). Концентрация хлорофилла в ячейке во время измерений составляла 10 мкг/мл. Все измерения выполнялись при 25°С в присутствии 0,3 ММ 2,6-дихлоро-р-бензохинона и 1 ММ феррицианида калия (K3[Fe(CN)6]) как акцепторов электронов.
4.5 Измерение фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла
Измерениякинетики фотоиндуцированных изменений выхода флуоресценции хлорофилла (DФ) с l>660 нм (связанных с фотовосстановлением первичного акцептора электрона ФС-2, пластохинона QA) проводили с помощью прибора XE-PAMFLUOROMETER фирмы «WALZ» (Германия) в 10 мм кювете при 20ОС. Действующий свет, который получали пропусканием белого света через фильтр BG-39 («Schott», Германия), подавался через световод на кварцевую кювету, помещенную в специальную камеру ED-101US/M (Wals, Германия);Измерения осуществляли в среде, содержащей: 50 ММ MES (РН 6,5), 10 ММ NACL. Концентрация частиц ФС-2 по хлорофиллу составляла 10мкг/мл.
4.6 Получениеи очистка БЕЛКОВPSBP и PSBQ
Для экстракции гидрофильных белков PSBQ (18 КДА) и PSBP (24 КДА) субмембранные препараты ФС-2 (конечная концентрация по хлорофиллу 0,5 мг/мл) обрабатывали 1 М NACL в течение 30 минут при 4?C и комнатном освещении (MIYAOANDMURATA, 1983). Раствор белков, полученный после обработки обессаливали с помощью диализа против 20 ММ Tris-HCL-буфера, (РН 7,5), содержащего 10 ММ NACL и 2 ММ ЭДТА.
Разделение смеси белков PSBQ и PSBP проводили с помощью ионообменной хроматографии с использованием системы ACTAFPLC на колонке MONOQ («AMERSHAMBIOSCIENCES», Швеция) (Calderoneetal., 2003). Белок PSBQ элюировали с колонки в течение 15 минут. Белок PSBP элюировали в градиенте NACL от 0 до 500 ММ (время элюции 30 минут, выход белка наблюдался при 170 ММ NACL).
4.7 Приготовление диализных трубок
1. Отрезать трубку необходимой длинны
2. Смочить и вымачивать 30 минут в большом избытке 10 ММ бикарбоната натрия
3. Вымачивать трубки 30 минут в большом избытке 10 ММ ЭДТА
4. Несколько раз сполоснуть дистиллированной водой
Хранить в 30% ETOH при ЧОС. (http://molbiol.edu.ru/protocol/08_04.html)
4.8 Электрофорез
Способ разделения смеси белков на фракции или индивидуальные белки. Наиболее распространенным вариантом электрофоретического анализа белков, является электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ) по Лэммли. (Остерман, 1981).
Анализ растворов отдельных белков после их очистки с помощью ионообменной хроматографии и трихлоруксусной кислоты проводили с помощью электрофореза в денатурирующих условиях в 12,5%-ном (м/о) ПААГ. (Laemmli, 1970) Образцы растворяли в 50 ММ Tris-HCL-буфере (РН 6,8), содержащем 8 М мочевину, 5% меркаптоэтанола, 3% додецилсульфата натрия, 10% сахарозы, 0,005%-ный бромфенолового синего, и нагревали в течение 1 минуты при 99ОС. После электрофореза полипептиды в геле фиксировали и окрашивали по методике, описанной ранее (D. Kang, 2002), с использованием кумасси G-250.
В качестве маркеров использовали смесь белковых стандартов («Sigma», США).
1) Окраска SDS - PAGE по методу D. Kang с соавт. (2002 г.) с помощью кумасси - G - 250.
Окраска ведется в течении двух часов в свежеприготовленном растворе.
1.1.) Фиксация белков в геле - 30 минут
Фиксирующий раствор : 30% этилового спирта
2% H3PO4
На 336 мл раствора: 122, 414 мл - 96% этанол
210, 520 мл - Н2О дист.
3 мл - 85% H3PO4
1.2.) Окраска - два часа ( на качалке или оставить на ночь без перемешивания)
Раствор для окраски: 0, 02% кумасси G - 250
2% H3PO4
5% Al2(SO4)3
10% эанол
Растворы рассчитаны на 250 мл конечного объема
Готовят два раствора -
1.2.1.) Кумасси в спирте (раствор А)
25 мл этилового спирта
0,05 г кумасси G - 250
1.2.2.) Соль и кислота в воде (раствор Б)
3, 48 мл - H3PO4 85%
24, 34 г - Al2(SO4)3 * 18 H2O
H2Одо 225 мл
Раствор профильтровать. После фиксации гель инкубируют некоторое время в растворе Б, а затем добавляют раствор А и перемешивают.
На окрашивание (одного или двух гелей) необходимо взять 45 мл раствора Б и 5 мл раствора А.
2.) Расчеты для электрофореза (табл. 1)
Табл. 1. SDS электрофорез в ПААГ по Laemmli
Буфер для геля (х5), ml 30% АА, ml H2O дист., ml Мочевина, g 10% АПС, mcl TEMED, mcl
3. Раствор Кумасси (кумасси G-250 растворить в спирте, добавить к полученному раствору 85% фосфорную кислоту, довести водой полученный раствор. Профильтровать через фильтровальную бумагу. Хранить при ЧОС.
Кумасси G-250 10 мг
Этанол 95% 5мл
H2PO4 85% 10 мл
H2Odd до 100 мл
4.10 Измерение карбоангидрзной активности
КА-активность измерялась электрометрическим методом Вильбура и Андерсона (WILBURANDANDERSON, 1948) по скорости изменения РН во время гидратации углекислого газа с использованием электрода METTLERTOLEDOINLAB 413 и «РН-метра-иономера CPX-2» (ИБП РАН, Пущино) с выводом сигнала на компьютер. Измерения проводились при 1,5-2ОС в среде следующего состава: 25 ММ веронал (РН 8,6), 50 ММ KCL, 15 ММ MGCL2. К 1,29 мл вероналового буфера добавляли сначала образец 0,21 мл (добавка образца приводила к уменьшению РН на 0,1-0,15 ед.), а затем 0,75 мл воды, насыщенной углекислым газом при 0ОС в течение 1 часа. С помощью специальной компьютерной программы PXMETER регистрировали изменения РН, а затем рассчитывали время уменьшения РН с 8,5 до 8,0. Для выражения значения КА-активности белков использовали единицы Вильбур-Андерсона, рассчитанные на 1 мг белка (ед. W-А/мг белка). Расчеты проводили по формуле: (t0 - t)/(t·m), где t0 и t - время изменения РН с 8,5 до 8,0 соответственно для спонтанной реакции (без добавок) и реакции в присутствии образца, m - количество белка в миллиграммах, внесенных в реакционную смесь. Измерения проводили по 3-4 раза в нескольких биологических повторностях. (Шитов с соавт.,2009)
5. Результаты и обсуждение
5.1 Получение и характеристика препаратов ФС-2
Для изучения карбоангидразоподобной активности белков PSBPИ PSBQСНАЧАЛА необходимо выделить функционально активные препараты ФС-2. Их функциональная активность является мерой целостности этого пигмент-белкового комплекса. Чем выше фотосинтетическая активность полученных ФС-2, тем более полный выход белков PSBP и PSBQ можно получить. Поэтому первым этапом работы было выделение препаратов ФС-2 и определение концентрации хлорофилла в них.
Определение концентрации хлорофилла. BBY-препараты ФС-2 были получены по методу (ROBINSONANDYOKUM, 1980; Bertholdetal., 1981; FORDANDEVANS, 1983). Определение концентрация хлорофилла в выделенных препаратах проводили при помощи спектрофотометрического метода, описанного в «Объектах и методах исследований».
На спектрофотометре (SHIMADZUUV-1800)измеряется оптическая плотность (А) раствора при определенной длине волны 654 нм(данные приведены в табл.2).
Из значений таблицы 3 вычислили среднее значение концентрации хлорофилла 2,628 мг/мл, которое затем использовали при определении количеств препаратов, необходимых для измерения фотосинтетической активности и вычислении объемов сред для обработки препаратов ФС-2 с целью получения фракции белков PSBP и PSBQ.
Измерение скорости выделения кислорода. Скорость выделения кислорода является наиболее достоверным показателем функциональной активности ФС-2. Измерение проводили при РН 6.5. Концентрациюхлорофилла доводили до 10 мкг/мл. Скорость фотосинтетического выделения кислорода была рассчитана исходя из данныхграфика(рис.6).
Вычисление скорости выделения О2 за 1 час по формуле: V(О2) = ?U*K*60мин/СХЛ, где ?U- значение изменения вольтажа за 1 минуту, K- калибровочный коэффициент(МКМО2/мл*мин*В), СХЛ- концентрация хлорофилла(мг/мл). Значение калибровочного коэффициентавычисляется по специальному калибровочному графику (рис.7). Его значение равно665, 79 МКМО2/ мл*мин*В. За тем по графику (рис.6) нашли изменение напряжения (В) за 1 минуту после включения света (начальная скорость на прямолинейном участке).
Скорость выделения кислорода составила 344,7 ± 12 МКМО2/ ч *мг/мл
Рис. 6. График фотосинтетического выделения кислорода ФС-2. Стрелкой вверх показан момент включения свет
Вывод
В настоящее время наличие карбоангидразной активности в ФС-2 высших растений (горох, шпинат, пшеница, кукуруза) показано многими исследователями и не должно вызывать сомнений. Но пока неясно, какова природа носителя карбоангидразной активности в ФС-2. Им может быть один (или несколько) из известных белков ФС-2, обладающий неизвестной ранее функцией (карбоангидразной активностью), или неизвестный белок.Принимая во внимание значимость карбоангидразной активности для функционирования донорной стороны ФС-2, особое внимание было уделено исследованию карбоангидразной активности внешних водорастворимых белков водоокисляющего комплекса. В данной работе впервые был проведен анализ действия ионов двухвалентных металлов на карбоангидразоподобную активность белков РSBРИ РSBQПО отдельности.
Было выяснено, что белок PSBPНЕ обладал КП-активностью пока к нему не добавляли ионы двухвалентных металлов. Особенно эффективным активатором КП-активности оказался ион Mg2 , несколько менее эффективными - ионы Ca, Cu, Mn. Вопрос о специфичности ионов металлов в активации КП-активности PSBP пока остается открытым.
Было показано, что очищенный от ионов металлов белок PSBQОБЛАДАЛ КП-активностью, которая сильно возрастала в присутствии ионов Zn2 , в присутствии ионов Саи Mn КП-активность увеличивалась с в два раза меньшей эффективностью. Также было выявлено, что Zn и Ca по-разному влияют на увеличение КП-активности, что может свидетельствовать о разной природе взаимодействий ионов этих металлов с белком PSBQ. Природу этих взаимодействий необходимо более тщательно исследовать, поскольку это важно для понимания закономерностей функционирования фотосистемы 2. В силу актуальности этой тематики, эта работа требует продолжения.
Роль обнаруженных носителейкарбоангидразной активности, находящихся в люменальной части ФС-2, в непосредственной близости к ВОК, может быть важна для фотосинтетического окисления воды, подобно функциональной активности карбоангидразы cah3, обнаруженной ранее в составе «ядерного» комплекса ФС-2 клеток C. reinhardtii и необходимой (наряду с анионом бикарбоната) для формирования, стабилизации и функционирования Mn2 -содержащего водоокисляющего комплекса (Villarejoetal., 2002;Shutovaetal., 2008).1. Фрагменты тилакоидных мембран хлоропластов, обогащенных фотосистемой 2, выделенные из листьев гороха, обладали хорошей фотохимической активностью и по своему белковому составу соответствовали препаратам фотосистемы 2, описанным ранее в научной литературе.
2. Выбранные нами методы и подходы позволили выделить изолированные фракции белков PSBPИ PSBQC сохранением их КП-активности.
3.Выявлено, что изолированный и очищенный от металлов белок PSBP не обладал карбоангидразоподобной активностью. Эта активность проявлялась только в присутствии ионов двухвалентных металлов, таких как Mn2 , Ca2 , Mg2 , Cu2 . Ионы Zn2 не вызывали увеличения КП-активности.
4. Белок РSBQОБЛАДАЛ КП-активностью без добавления ионов двухвалентных металлов. Однако, его активность значительно возрастала в присутствии ионов Zn2 , Ca2 и Mn2 .Было выяснено, что ионы Zn2 и Ca2 по-разному воздействуют на карбоангидразоподобную активность белка PSBQ.
Список литературы
1. Antal T. K., Venediktov P. S., Konev Yu. N., Matorin D. N., Hapter R., and Rubin A. B. (1998) Assessment of Vertical Profiles of Phytoplankton Photosynthetic Activity by the Fluorescence Method
2. Arnon D.I. (1949) Copper Enzymes in Isolated Chloroplasts.Polyphenoloxidase in Beta vulgaris.Plant Physiology 24, 1-15.
3. Arun K. Shanker (2008) Trace elements: Nutritional benefits, environmental contamination and health; 21 Modeofaction and toxicity of trace elements,Edited by M.N.V. Prasad
4. Barber J. (2002)P680: what is it and where is it?, Bioelectrochemistry. Jan;55(1-2):135-8.
5. Barber J., Chapman D.J. and Telfer A. (1987) Characterization of a PSII reaction center isolated from the chloroplasts of Pisum sativum. FEBS Lett. v.220, p.67-73.
6. Basics G. H. Krause E. Weis (1991) Chlorophyll fluorescence and photosynthesis
7. Bradford M. M. (1976) A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding
8. Dai X., Yu Y., Zhang R., Yu X., He P. and Xu C. (2001) Relationship among Photosystem II carbonic anhydrase, extrinsic polypeptides and manganese cluster. Chinese Science Bulletin46, 406-408.
9. Guskov A., Kern J., Gabdulkhakov A., Broser M., Zouni A., Saenger W. (2009) Cyanobacterial photosystem II at 2.9 A resolution: role of quinones, lipids, channels and chloride. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 334-342.
10. Kang D., Gho Y.S., Suh M. and Kang C. (2002) Highly Sensitive and Fast Protein Detection with Coomassie Brilliant Blue in Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis.Bulletin of the Korean Chemical Society23, 1511-1512.
11. Khristin M.S., Ignatova L.K., Rudenko N.N., Ivanov B.N. and Klimov V.V. (2004) Photosystem II associated carbonic anhydrase activity in higher plants is situated in core complex. FEBS Letters577, 305-308.
12. Klimov V.V., Allakhverdiev S.I., Shuvalov V.A. and Krasnovsky A.A. (1982) Effect of extraction and re-addition of manganese on light reactions of photosystem-II preparations.FEBS Letters148, 307-312.
13. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature227, 680-685.
14. Lu Y.K. and Stemler A.J. (2007) Differing responses of the two forms of photosystem II carbonic anhydrase to chloride, cations, and PH.Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1767, 633-638.
15. Lu Y.K., Theg S.M. and Stemler A.J. (2005) Carbonic anhydrase activity of the photosystem II OEC33 protein from pea.Plant and Cell Physiology 46, 1944-1953.
16. MCCONNELL I.L., Badger M.R., Wydrzynski T. and Hillier W. (2007) A quantitative assessment of the carbonic anhydrase activity in photosystem II.Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics 1767, 639-647.
17. Moroney J.V., Ma Y., Frey W.D., Fusilier K.A., Pham T.T., Simms T.A., DIMARIO R.J., Yang J.and Mukherjee B. (2011) The carbonic anhydrase isoforms of Chlamydomonas reinhardtii: intracellular location, expression, and physiological roles. Photosynthesis Research109, 133-149.
18. Moskvin O.V., Razguljayeva A.Y., Shutova T.V., Khristin M.S., Ivanov B.N. and Klimov V.V. (1999) Carbonic anhydrase activity of different Photosystem II preparations. In: Garab G. (ed.) Photosynthesis: Mechanism and Effects, Vol. 2, pp. 1201-1204. Kluver Academic Publishers, Dordrecht.
19. Renger G. (1992) Energy transfer and trapping in photosystem II. -In: Topics in photosynthesis, the photosystems: structure, functions and molecular biology. (ed.: Barber J.), Elsevier, Amsterdam, 45-99.
20. Muh F., Glockner C., Hellmich J., Zouni A., (2012) Light-induced quinone reduction in photosystem II. Biochimica et Biophysica Acta 1817, 44-65.
21. Rudenko N.N., Ignatova L.K. and Ivanov B.N. (2007) Multiple sources of carbonic anhydrase activity in pea thylakoids: soluble and membrane-bound forms. Photosynthesis Research 91, 81-89.
22. Shutova T., Nikitina J., Deikus G., Andersson B., Klimov V. and Samuelsson G. (2005) Structural dynamics of the manganese-stabilizing protein-effect of PH, calcium, and manganese. Biochemistry44, 15182-15192.
23. Stemler A. (1986) Carbonic anhydrase associated with thylakoids and Photosystem II particles from maize. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics850, 97-107.
24. Villarejo A., Shutova T., Moskvin O., Forssen M., Klimov V.V. and Samuelsson G. (2002) A photosystem II-associated carbonic anhydrase regulates the efficiency of photosynthetic oxygen evolution. EMBO Journal21, 1930-1938.
25. Wilbur K.M. and Anderson N.G. (1948) Electrometric and colorimetric determination of carbonic anhydrase.The Journal of Biological Chemistry176, 147-154.
26. Гольцев В.Н., Каладжи М.Х., Кузманова М.А., Аллахвердиев С.И.(2014). Переменная и замедленная флуоресценция хлорофилла a - теоретические основы и практическое приложение в исследовании растений . Ижеск-Москва: Институт компьютерных исследований.
27. Казимирко Ю. В. Разработка флуорометрических методов оценки состояния фотосинтетического аппарата для биоиндикации среды: диссертация ... кандидата биологических наук : 03.00.02, 03.00.16. - Москва, 2006. - 117 с.
28. Ланкин А.В., Креславский В.Д., Худякова А.Ю., Жармухамедов С.К., Аллахвердиев С.И. (2014) Влияние нафталина на фотохимическую активность фотосистемы 2
29. Лукаткин А. С., Ревин В. В., Башмаков Д. И., Кренделева Т. Е., Антал Т. К., Рубин А. Б. (2009), Экологическая оценка состояния древесных растений г. Саранска по флуоресценции хлорофилла
30. Малиновский В. И. (2004) Физиология растений, Владивосток: ДВГУ
31. Остерман, Л. (1981). Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. Москва: Наука.
32. Полевой В. В. (1989) Физиология растений, Москва: Высшая школа
33. Холл Д., Рао К. (1983) Фотосинтез, Москва: Мир
34. Шитов, А. В. Исследование карбоангидразной активности фотосистемы 2 гороха:диссертация ... кандидата биологических наук:03. 01. 04- Пущино, 2013. - 116 с.
35. Якушкина И. И. (2004). Физиология растений, Москва: Владос
36. Яныкин, Д. В. Фотопоглощение молекулярного кислорода на донорной стороне фотосистемы 2 в субхлоропластных мембранных препаратах с разрушенным водоокисляющим комплексом: диссертация ... кандидата биологических наук:03. 01. 04- Пущино, 2013. - 133с.