Описание основных гистохимических и иммунологических методов, применяемых в современной диагностике. Общая классификация методов гистохимии. Окраска нуклеиновых кислот хромовым краплаком галлоцианина (метод Эйнарсона). Реакции с ионами тяжелых металлов.
Аннотация к работе
В основе лежит соединение принципов и методов химического анализа с принципами и методами морфологического изучения клеток и тканей, используемыми в цитологии и гистологии. Непременным условием проведения гистохимических методов исследования особенно при выявлении ферментов и других веществ белковой природы, является сохранение структуры тканей и клеток в состоянии, близком тому, какое имеется в живом организме. Для обнаружения углеводных соединений широко используются методы, основанные на метахромазии - свойстве клеток и тканей окрашиваться в цвет, отличающийся от цвета красителя. Этот метод в качественном и количественном варианте широко использовался и используется для изучения плоидности клеток в норме и на фоне различных лекарственных и гормональных препаратов и оперативных вмешательств. Невзирая на утверждения, иногда приводимые в научной литературе, что методы с солями тяжелых металлов имеют только исторический интерес, можно считать, что методы Гомори и методы с азокрасителями являются классическими для выявления активности ряда ферментов с использованием окислительно-восстановительных индикаторов.[2]Так, количество моноцитов повышалось в 4 раза чаще у больных с опухолевым поражением костного мозга, чем у пациенток без метастазов. В анализах периферической крови не выявлено статистически достоверных различий в содержании эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, гемоглобина, уровне гематокрита и других показателей крови у больных с микрометастазами рака молочной железы в костный мозг и у пациенток без метастатического его поражения.В результате анализа литературы и ресурсов интернета мы выяснили, что гистохимические и иммуноцитологические методы имеют очень широкою область применения и по мере развития заболеваний их появляется все больше.
План
Содержание моноцитов и лимфоцитов в костном мозге при наличии микрометастазов повышено.
Введение
Основной задачей работы является выявление все основных гистохимических и иммунологических методов применяющихся в современной диагностике и выяснение их влияния на клетку.
Составной частью гистохимических методов исследования являются цитохимические методы, выявляющие химические вещества в клетках приготовленных мазков и отпечатков. В основе лежит соединение принципов и методов химического анализа с принципами и методами морфологического изучения клеток и тканей, используемыми в цитологии и гистологии. Благодаря этому обеспечиваются существенные преимущества в изучении морфофункциональной организации растительных и животных тканей, т.к. выявленное химическое вещество можно связать с определенной тканевой или клеточной структурой, т.е. установить его локализацию. Гистохимическим методам исследования находят широкое применение в гистологии, цитологии, эмбриологии, патологической анатомии, экспериментальной и клинической морфологии. С помощью разнообразных методов современной гистохимии можно судить об особенностях функционирования различных тканевых и клеточных структур, определять характер и темп обменных процессов в клетках и тканях, обнаруживать ранние проявления заболеваний.
Непременным условием проведения гистохимических методов исследования особенно при выявлении ферментов и других веществ белковой природы, является сохранение структуры тканей и клеток в состоянии, близком тому, какое имеется в живом организме. Это достигается получением срезов свежезамороженных тканей с помощью ножа глубокого охлаждения и криостата, а также использованием лиофильной сушки. Некоторые гистохимических методов исследования, например выявление углеводных соединений, можно проводить после специальной фиксации тканей и заливки в парафин.
Многие гистохимические методы исследования являются групповыми, т.е. служат для обнаружения соединений с одинаковыми или близкими свойствами. Другие гистохимические методы исследования строго специфичны и применяются для выявления определенных веществ. Для обнаружения углеводных соединений широко используются методы, основанные на метахромазии - свойстве клеток и тканей окрашиваться в цвет, отличающийся от цвета красителя. Метахромазия обусловлена полимеризацией молекул красителя под влиянием свободных отрицательных зарядов гликозаминогликанов (кислых мукополисахаридов), присутствующих в ткани.
К высокоспецифичным относятся гистохимические методы выявления ферментов. В их основу положено воздействие фермента на специфический субстрат в присутствии другого вещества, называемого захватывающим агентом (акцептором). Соединяясь с первичным продуктом ферментативной реакции, акцептор образует нерастворимый, обычно окрашенный, осадок - конечный продукт реакции, который маркирует место действия фермента. В качестве акцепторов применяют ионы металлов, соли диазония и другие соединения. Ионы металлов обладают высокой электронной плотностью, поэтому могут быть обнаружены при электронно-микроскопическом исследовании. Это свойство используется в электронной гистохимии.[1]
Общая классификация методов гистохимии
Можно рассмотреть следующую классификацию гистохимических реакций и гистохимических технологий, в которых используются красители, аналитические химические реакции, методы иммунологии и молекулярной биологии, адаптированные к гистохимическому анализу, и прямое использование физико-оптических методов и методов радиоавтографического анализа тканевых срезов: I. Гистохимические реакции с использованием красителей и химических реакций: а) Прямое взаимодействие красителей с внутриклеточными и внутритканевыми химическими соединениями: - Использование красителей поглощающих свет в видимой области спектра;
- Флуоресцентные красители;
б) Реакции с переходом лейкоформы красителя в хромоформную форму при взаимодействии с анализируемым соединением;
в) Реакции, в результате которых непосредственно в срезах ткани образуются красители в местах локализации исследуемых субстратов;
г) Комплексообразование субстратов с ионами тяжелых металлов и последующее осаждение их в виде окрашенных солей;
д) Реакции с использованием окислительно-восстановительных индикаторов;
е) Реакции химических соединений с эндогенными субстратами, в ходе которых образуются продукты, доступные для визуального микроскопического анализа и микроспектрального количественного изучения.
II. Комплексные гистохимические технологии: а) Использование иммунологических реакций в цито - и гистохимии (иммуноцитохимия и иммуногистохимия);
б) Использование методов молекулярной биологии в гистохимии (метод гибридизации МРНК);
в) Использование реагентов, меченных радиоактивными изотопами (гисторадиоавтография).
III. Физические методы в гистохимии: а) Ультрафиолетовая микроскопия;
б) Интерференционная и поляризационная микроскопия;
в) Микроспектрофотометрия.
IV. Методы динамической гистохимии: а) Методы суправитальной гистохимии;
Гистохимических методов очень много и все они имеют различное направление.
Гистохимические реакции
Поскольку описание всех гистохимических методов не является целью работы мы опишем только некоторые наиболее распространенные и широко используемые в различных диагностических методиках.
Красители, поглощающие свет в видимой области спектра.
Окраска общих белков амидочерным 10В
Краситель амидочерный 10В применяется для окраски белковых полос при электрофоретическом разделении белков. Краситель имеет сложную структуру и относится к диазокрасителям. Механизм реакции амидо-черного 10В с белками до конца не исследован. Считается, что при взаимодействии красителя с белками возможно образование ионной химической связи и физической адсорбции. Применяется для выявления общего белка в сыворотке крови, а также для обнаружения мочевины в крови.
Теоретическое обоснование метода дано Л.Эйнарсоном в 1951 году.
Галлоцианин - оксазиновый краситель. Солянокислый галлоцианин имеет следующую структуру: Галлоцианин хорошо растворим в воде и при кипячении с хромокалиевымиквасцами образуется хромовый краплак галлоцианина.
Хромовый крапплак галлоцианина взаимодействует с остатками фосфорной кислоты молекулы ДНК. Считается, что каждая фосфатная группа нуклеотида связывается содной молекулой красителя, в связи с этим метод с галлоцианином может использоваться для количественного цитофотометрического анализа. Применяется для диагностике нарушений слухового анализатора.
Окраска ДНК и РНК смесью метиловый зеленый - пиронин
Метиловый зеленый является арилметановым красителем: Пиронин входит в группу ксантеновых красителей. Первые работы по выявлению нуклеиновых кислот, при помощи смеси двух красителей: пиронина G и метилового зеленого, были проведены А.Паппенгеймом в конце XIX века.
В 1942 году Ж.Браше разработал специальный метод с использованием этих красителей для выявления нуклеиновых кислот и активно использовал его для гистохимического изучения клеток животных. В этих ранних работах метод использовался как эмпирический и механизм взаимодействия красителей с нуклеиновыми кислотами был неизвестен.
Считалось, что метиловый зеленый связывается с сильно полимеризованной нуклеиновой кислотой - ДНК, в то время как пиронин с менее полимеризованной нуклеиновой кислотой - РНК. Такое предположение основывалось на том наблюдении, что при деполимеризации, ДНК начинает окрашиваться пиронином. Метиловый зеленый относится к основным красителям трифенилметанового ряда и имеет две заряженные метилированные аминогруппы, которые являются реакционно-активными.
Детальные исследования В.Г.Конарева (1966) показали, что именно эта группа красителя взаимодействует с ДНК с образованием комплекса следующего вида. Максимумы поглощения красителя лежат в области 548,3 и 509,6 нм и при взаимодействии красителя с РНК образуется комплекс красного цвета. На основе флуориметрических и спектральных данных В.Г.Конарев делает вывод, что пиронин вступает во взаимодействие со свободной или слабо связанной с белками РНК, образуя окрашенное комплексное соединение. Используется для выявления лизосомных и катионных белков, а также нуклеиновых кислот.
Окраска липидов жирорастворимыми красителями
Одним из гистохимических методов обнаружения липидов в клетках и тканях является их окраска при помощи специальных красителей ("жировые красители"). Главная особенность этих красителей заключается в их жирорастворимости, в связи с чем, окрашивание липидов представляет собой обычный процесс растворения красителя в липидсодержащих структурах клеток и тканей.
Таким образом, процесс окрашивания липидов носит чисто физический, а не химический характер. В связи с этим, избирательное окрашивание отдельных липидов разного химического состава при помощи таких красителей невозможно. Для этой цели можно использовать методы экстракции отдельных групп липидов разными системами растворителей перед проведением гистохимической реакции.
Суданы
Для «физического» окрашивания липидов широко используется группа красителей известных под названием "Суданы" (Судан черный В, Судан III, Судан IV и др.). Это азо - или диазокрасители, имеющие следующие химические структуры, указанные красители не растворимы в воде, но растворимы в органических растворителях.
Для проведения гистохимического окрашивания обычно используются в качестве растворителей спирты, смесь Герксхаймера (равные части 70% этанола и ацетона) и др. Выбор растворителя Суданов имеет очень большое значение, т.к. растворитель не должен экстрагировать клеточные липиды. Экстракция липидов полностью предотвращается при использовании коллоидных растворов, например, раствора Джексона (C.Jackson) - этанол-фенол-уксусная кислота или Говена (A.D.T.Govan) - уксусная кислота-желатина. Используется для оценки секреторной функции кишечного эпителия.
Флуоресцентные красители
Акридиновый оранжевый
Детальное описание использования флуоресцентного красителя акридинового оранжевого для изучения нуклеиновых кислот также, как принципы, методы и приборная реализация флуоресцентного спектрального анализа клеток, дано в монографиях А.В.Зеленина (1967) и В.Н.Карнаухова(1978).
Необходимо отметить, что флуоресцентная микроскопия в настоящее время нашла широкое и разнообразное применение в гистохимии. Метод с акридиновым оранжевым относится к типичной группе классических методов, в которых используются специальные красители - флуорохромы. Характерной особенностью акридинового оранжевого является его способность существовать в растворе как в мономерной, так и в димерной форме с соответствующими максимумами флуоресценции в области 530 нм и 640 нм.
Соотношение содержания этих форм акридинового оранжевого в растворе зависит от концентрации красителя. Акридиновый оранжевый и другие флуорохромы акридинового ряда являются производными акридина. Известны английский и немецкий варианты номенклатуры акридиновых красителей, зависящие от порядка нумерации углеродных атомов в молекуле флуорохромов.
В ряду акридиновых флуорохромов наибольший интерес представляют акридиновый оранжевый, акридиновый желтый, профлавин, корифосфин, аурофосфин В, аурофосфин, акрифловин, эухризин 2GNX и др. Реакция с Шиффнадуксусной (надмуравьиной) кислотой Реактив Шиффа используется для изучения липидов в тканях. Вначале проводится окисление двойных ненасыщенных связей жирных кислот до альдегидов и выявление последних при помощи фуксинсернистой кислоты.
Для окисления двойных ненасыщенных связей липидов используется надмуравьиная или надуксусная кислота. На эту реакцию было обращено внимание после того, как Дж.Верн в 1929 году показал, что при мягком окислении жировых веществ, содержащих ненасыщенные связи, например, при окислении лецитина, образуются группы, дающие все реакции на альдегиды.
Таким образом, применение реактива Шиффа для выявления различных соединений в клетках и тканях является классическим примером использования в гистохимии достижений аналитической химии органических соединений. Необходимо отметить, что реакция Фельгена является одной из самых распространенных цитохимических реакций, используемых в цитофотометрических исследованиях.
Этот метод в качественном и количественном варианте широко использовался и используется для изучения плоидности клеток в норме и на фоне различных лекарственных и гормональных препаратов и оперативных вмешательств. Был установлен закон постоянства среднего содержания ДНК в хромосомном наборе данного вида животных и растений, а также установлено, что синтез ДНК происходит только во время интерфазы.
Микроспектрофотометрические измерения интенсивности окраски по Фельгену для количественного анализа содержания ДНК в фиксированных ядрах были начаты в 1947 году А.Поллистером и его сотрудниками.
Совершенно очевидно, что для проведения количественного цитоспектрофотометрического анализа с использованием реакции Фельгена, как впрочем при любом другом гистохимическом методе,имеющем количественный вариант, необходима строгая стандартизация всех процедур и постановка специальных контрольных опытов.
Реакции с ионами тяжелых металлов
Этот тип гистохимических реакций можно рассмотреть на примере группы методов Гомори (G.Gomori) для выявления фосфатаз. В качествесубстратов для выявления щелочной фосфомоноэстеразы используются глицерофосфаты (бета- или смесь альфа- и бета-глицерофосфатов), которые гидролизуются с высвобождением фосфорной кислоты или ее соли, содержащиеся в инкубационной среде хлорид кальция и хлористый кобальт взаимодействуют с фосфорной кислотой, с образованием на конечной стадии нерастворимого гидрофосфата кобальта.
Однако, гидрофосфат кобальта бесцветен, но при его взаимодействии с сульфидом аммония происходит осаждение нерастворимого сульфида кобальта черного цвета, который является конечным продуктом каскада приведенных реакций и место его локализации выявляет распределение щелочной фосфомоноэстеразной активности.
В случае кислой фосфомоноэстеразы, реакцию необходимо проводить в кислой буферной среде, и вместо солей кальция (растворимых в кислых условиях), использовать азотнокислый свинец. Остальные этапы методики аналогичны реакции Гомори для выявления щелочной фосфомоноэстеразы. Локализация активности кислой фосфомоноэстеразы определяется благодаря черно-коричневому осадку сульфида свинца в тканях.
В качестве еще одного примера реакции с осаждением солей тяжелых металлов можно привести реакцию Пирса и Рейса для выявления специфической 5-нуклеотидазы с субстратом аденозинмонофосфатом и последующим осаждением кислого фосфорнокислого свинца сульфидом аммония, как описано выше.
Разработано много модификаций методов с использованием ионов тяжелых металлов и их осаждением в виде сульфидов, детально изучены отдельные этапы гистохимической процедуры, накоплен опыт использования этой группы гистохимических реакций в области светооптической и электронно-микроскопической гистохимии, определены границы и условия использования указанных методов для количественных измерений. Невзирая на утверждения, иногда приводимые в научной литературе, что методы с солями тяжелых металлов имеют только исторический интерес, можно считать, что методы Гомори и методы с азокрасителями являются классическими для выявления активности ряда ферментов с использованием окислительно-восстановительных индикаторов.[2]
Влияние гистохимических реакций на клетку
Существует целый ряд специфических красочных приемов, прямо выявляющих те или иные вещества. Это собственно гистохимические (цитохимические) реакции. Основные требования, предъявляемые к такого рода реакциям, следующие: специфичность связывания красителя, неизменность локализации вещества.
Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот используется также при окраске их флуорохромами. Например, если выделенную ядрышковую ДНК, ответственную за синтез рибосомных РНК, предварительно связать с каким-либо флуорохромом, то после проведения ренатурации ДНК на препаратах с этой флуоресциирующей рибосомной ДНК, можно видеть, что флуоресценция будет наблюдаться только в ядрышках интерфазных клеток или только в зонах ядрышковых организаторов митотических хромосом. Таким образом можно в клетках локализовать любые последовательности ДНК и даже расположение в ядрах отдельных хромосом. Этот прием называется FISH-метод.[3]
Для выяснения локализации мест синтеза биополимеров, для определения путей переноса веществ в клетке, для наблюдения за миграцией или свойствами отельных клеток широко используют метод радиографии - регистрации веществ, меченных изотопами. Принцип этого метода очень прост, он повторяет метод Беккереля, открывшего радиоактивный распад. При радиоавтографическом исследовании клеткам в среду вводится предшественник одного из макромолекулярных соединений (например, аминокислота или нуклеотид), один из атомов которого замещен радиоактивным изотопом. Например, вместо 12С введен атом 14С, вместо водорода - тритий 3Н и др. В процессе синтеза в биополимер включится и меченая молекула предшественника. Регистрировать ее место в клетке можно с помощью фотоэмульсии. Если клетки в пласте или на срезе покрыть фотоэмульсией, то через некоторое время в результате распада изотопа - частицы, разлетающиеся хаотично в разных направлениях, попадут в зону чувствительного фотослоя и активируют в нем зерна бромистого серебра. Чем больше будет время экспозиции, т.е. контакта такой меченой клетки с фотоэмульсией, тем больше зерен AGBR будет засвечено. После экспозиции надо проявить препарат, при этом происходит восстановление серебра только в засвеченных гранулах, при фиксации препарата незасвеченные гранулы AGBR растворяются. В результате из массы гранул, которые покрывали объект, останутся только те, которые были активированы b-излучением. Просматривая в микроскоп такие препараты, поверх которых нанесен слой фотоэмульсии, исследователь находит места локализации зерен серебра, которые располагаются напротив мест, где содержится меченое вещество.
Этот метод имеет ограничения: точность его будет зависеть от величины зерна AGBR и от энергии частицы. Чем больше величина зерна, тем с меньшей точностью можно узнать место расположения изотопа. И чем выше энергия частицы и длиннее ее пробег, тем дальше от места распада будет происходить активация зерен AGBR . Поэтому для метода радиоавтографии используют особые мелкозернистые фотоэмульсии (0,2-0,3 мкм) и изотопы с малой энергией b-частиц, главным образом изотоп водорода, тритий (3Н). Тритием могут быть мечены любые предшественники биологических макромолекул: нуклеотиды, аминокислоты, сахара, жирные кислоты. Используются также для радиоавтографических исследованных меченые гормоны, антибиотики, ингибиторы и др. Радиоавтографически нельзя изучать растворимые в воде соединения, так как в процессе обработки клеток водными растворами (фиксация, проявление и т.д.) они могут потеряться. Другим ограничением метода является достаточно высокая концентрация данных веществ, так как при низкой концентрации радиоактивного вещества время экспозиции увеличивается, при этом растет опасность появления фона засвеченных гранул AGBR за счет космического излучения.
Метод радиоавтографии - один из основных методов, позволяющих изучать динамику синтетических процессов, сравнить их интенсивность в разных клетках на одном и том же препарате. Так, например, с помощью этого метода при использовании меченых предшественников РНК было показано, что вся РНК синтезируется только в интерфазном ядре, а наличие цитоплазматической РНК является результатом миграции синтезированных молекул из ядра.
Метод радиоавтографии используется также для определения расположения определенных типов нуклеиновых кислот или отдельных нуклеотидных последовательностей в составе клеточных ядер или хромосом - метод молекулярной гибридизации. Для этого раствор с меченной нуклеиновой кислотой (например с рибосомной РНК) или с ее фрагментом (например, с сателитной ДНК) наносят на препарат, предварительно обработанный так, чтобы денатурировать ДНК (разорвать водородные связи в нативной ДНК) в составе хромосом или ядер, что достигается щелочной или температурной обработкой образца,. В процессе ренатурации ДНК происходит образование молекулярного гибрида между меченой нуклеиновой кислотой из раствора и комплементарным ему участком ДНК в препарате. Место такой гибридизации определяется радиоавтографически. Этот метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот позволяет с большой точностью локализовать на хромосоме места с данной нуклеотидной последовательностью или даже расположение определенных генов.
Для выявления специфически белков применяют иммунохимические реакции с использованием флуоресцирующих антител. Этот метод иммунофлуоресценции обладает очень большой специфичностью и чувствительностью. Его можно использовать для выявления не только белков, но и отдельных последовательностей нуклеотидов в ДНК или для определения мест локализации РНК-ДНК гибридных молекул. Для этого сначала на белок (например, тубулин) получают специфические сыворотки, содержащие антитела. Очищенные антитела химически соединяют с флуорохромами. Такие препараты наливают на объекты и с помощью люминесцентного микроскопа по свечению флуорохрома находят места локализации искомых белков в клетке. Однако для того, чтобы меченные флуорохромами антитела проникли в клетку, необходимо плазматическую мембрану сделать проницаемой. Обычно это достигается фиксацией клеток и частичной экстракцией липидов из мембран. Для изучения с помощью этого метода цитоскелетных белков прибегают к растворению клеточных мембран различными детергентами.
Роль гистохимических методов при диагностике и изучении различных заболеваний
Гистоморфологические и гистохимические методы исследования сыграли огромную роль в изучении нейродерматозов. Они способствовали уточнению вопросов диагностики и патогенеза этих страданий, выяснению особенностей изменений отдельных структур кожи, характерных для того или иного вида дерматоза. Детальное изучение соединительнотканных элементов дермы проводилось при окрасках азаном или пикрофуксином (для изучения коллагеновых волокон) и по Вейгерту (для изучения эластических волокон). Нервные структуры выявлялись методом Maillet - импрегнацией 2% раствором осмия, который являлся одновременно и фиксатором.
Важными показателями состояния белково-синтетических процессов в коже являются нуклеиновые кислоты - РНК и ДНК. Известно, что РНК активно участвует в синтезе белка и так же, как и ДНК, имеет громадное значение в процессах размножения живой клетки. ДНК, влияя на синтез рибонуклеиновых кислот, в значительной степени определяет наследственные признаки живого организма и является одним из основных материалов хромосом. РНК синтезируется главным образом в ядре клетки, а ядрышки представляют собой фактически крупные массы рибонуклеиновой кислоты. Проникая в цитоплазму из ядра, РНК в значительной степени обусловливает ее базофилию.
В 1942 г. Brachet предложил методику ферментативного анализа тканевых структур рибонуклеазой.
Эта методика позволила точно определить локализацию рибонуклеопротеидов и отдифференцировать базофилию, обусловленную именно РНК. Гранулы РНК при методе Браше окрашиваются пиронином в красный цвет.
Изучение ДНК осуществляется с помощью реакции Фельгена, который в 1924 г. предложил расщепление пуринодезокеипентозных связей ДНК методом кислотного гидролиза при температуре 60°. Зерна ДНК окрашиваются в пурпурный цвет.
В клетках нормального эпидермиса обычно определяется умеренное содержание РНК и ДНК. Однако оно подвержено колебаниям и зависит главным образом от митотического цикла. Так, Р. Г. Цанев, А. Л. Шабадаш пришли к заключению, что митоз в нормальном эпидермисе человека и животных (крыс и мышей) сопровождается уменьшением РНК. В то же время в процессе митоза постепенно нарастает ДНК.
Размножение клеток, метаболические процессы требуют постоянной энергии, источником которой в живом организме является гликоген - основной резерв углеводов.
Для выявления гликогена и нейтральных мукополисахаридов (МПС) применяется реакция Мак Мануса, предложенная автором в 1946 г. и основанная на использовании йодной кислоты и реактива Шиффа. Эта реакция известна также под названием ШИК-реакция и ПАС-реакция. Гликоген окрашивается в темно-красный цвет, а нейтральные МПС - в светло-розовый, обусловленный глюкопротеинами.
Также в связи с увеличением заболевание гинекологического профиля появляется все больше гистохимических диагностических методик.[4]
Поражения вирусом папилломы человека (ВПЧ) представляют большой научный интерес для специалистов различного профиля: дерматовенерологов, гинекологов, урологов, онкологов, так как многие из свыше 60 выделенных в настоящее время типов ВПЧ вызывают опухолевые поражения на коже и слизистых оболочках, в том числе и злокачественные. Статистика показала, что 20% различных форм рака у женщин и 10% у мужчин возникают в связи с предшествующим заражением папилломавирусом.
Однако несмотря на интенсивное изучение воздействия ВПЧ на ткани организма человека, в основном зарубежными исследователями , достаточной ясности в плане клинико-морфологической диагностики нет. В ходе этого исследования было изучено биоптаты генитальных вирусных папиллом у 21 больного в возрасте от 17 до 43 лет. Парафиновые срезы биоптатов окрашивали гематоксилином и эозином, толуидиновым синим с обработкой контрольных срезов гиалуронидазой с целью выявления гликозаминогликанов, по Браше с обработкой контрольных срезов рибонуклеазой для выявления РНК, по Фейльгену с целью выявления ДНК, по Хочкиссу для обнаружения гликогена и нейтральных мукополисахаридов (МПС) с обработкой контрольных срезов диастазой.[5]
В этом разделе было приведено несколько примеров использования гистохимимческих реакций.Они имеют еще очень большую область применения и с развитием заболеваний их появляется все больше.
Иммунноцитологические реакции гистохимический иммунологический нуклеиновая кислота
Гистологический и цитохимически методы исследования выявляют злокачественные клетки в костном мозге при их достаточно большом количестве, вследствие чего обнаружение метастазов становится возможным лишь на поздних стадиях онкологических заболеваний. При гистологическом исследовании возможно выявление 1 опухолевой клетки среди 100 миелокариоцитов Реальное представление о степени распространенности процесса дают результаты иммуноморфологического исследования. Используя иммуноцитологический метод с применением моноклональных антител к антигенам, экспрессируемым клетками эпителиальных опухолей и нехарактерным для гемопоэтической ткани, можно обнаружить 1 опухолевую клетку среди 1 млн миелокариоцитов. На клетках почти в 100% случаев экспрессированы эпителиальный мембранный антиген (ЕМА), цитокератины (СК), туморассоциированный гликопротеин (TAG-12), антиген мембран жировых глобул женского молока (HMFG-1), панэпителиальный антиген (EGP-34), реже - раковоэмбриональный антиген (РЭА) и ряд других.
Развитие иммуноцитологии привело к появлению моноклональных антител антигенам,к данным антигенам и открыло новые диагностические возможности для выявления единичных опухолевых клеток в лимфатических узлах, костном мозге, периферической крови. Полученные моноклональных антител к антигенам, обладают разной чувствительностью и специфичностью. Известно, что муциноподобный раковый антиген (МСА) экспрессируется клетками гемопоэза, М перекрестно реагируют с лимфоидными клетками костного мозга. Современным стандартом для обнаружения микрометастазов РМЖ в костный мозг являются антитела к цитокератинам. МКА САМ 5.2 взаимодействуют с цитокератинами 7 и 8, а моноклональных антител к антигенам, к панцитокератинам KL-1 распознают цитокератины 2, 6, 8, 10, 11, 18, 19 и в меньшей степени - 5, 14, 15.
Таким образом, представлялось актуальным изучить степень диссеминации рака внутренних органов на основании выявления микрометастазов в костный мозг, оценить эффективность различных методов диагностики метастатического поражения костного мозга, определить различия между макро- и микрометастазами, сопоставить результаты иммуноцитологического метода с другими показателями распространенности процесса, проанализировать изменения в системе кроветворения при метастатическом поражении костного мозга.
В 2005 году в хирургическом отделении опухолей молочных желез РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН было проведено исследование в применением иммуноморфологических реакций. Материалом для исследования послужили данные клинического, морфологического и иммуноцитологического обследования 53 больных раком молочных желез (в I- IV стадии). В исследуемую группу вошли женщины в возрасте от 27 до 72 лет.
У большинства больных была IIIB стадия (28,3%), на 2-м месте по частоте были больные с ІІА стадией (22,6%). IIB стадия установлена в 18,9% случаев, IV стадия - в 15,1%, I стадия - в 9,4%. Наименьшее число больных было в ІІІА стадии (5,7%).В репродуктивном возрасте находились 23 (43,4%) пациентки, в состоянии перименопаузы - 8 (15,1%), в менопаузе - 22 (41,5%).Наиболее частым гистологическим вариантом был инфильтративный протоковый рак (39,6%). Отмечена достаточно высокая частота инфильтративного долькового рака (32,1 %). Остальные гистологические формы (смешанный, тубулярный, медуллярный, слизистый и папиллярный рак) встречались реже. Клетки костного мозга получали при пункции, которая выполнялась всем 53 больным до начала лечения (хирургического, неоадъювантного, консервативного).
Пункцию осуществляли в области грудины (стернальная пункция). В отдельных случаях проводили одномоментную пункцию грудины и гребня подвздошнойкости.
Исследование костного мозга выполняли как стандартным цитологическим методом, так и иммуноцитологическим: реакция иммунофлюоресценции с применением МКА к цитокератинам САМ 5.2 и KL-1.Положительной считали реакцию при наличии 1 метастатической клетки среди 1 млн миелокариоцитов. При использовании МКА к цитокератинам метастатические клетки легко обнаруживаются среди миелокариоцитов по наличию яркого специфического цитоплазматического флюоресцентного свечения. Подсчет клеток миелограммы и их анализ выполнен в клинической лаборатории.
Метастазы, выявляемые при цитологическом исследовании костного мозга, обозначались как макрометастазы. Термин «микрометастазы» использовался нами применительно к метастазам, определяемым иммуноцитологическим методом. Безусловно, это лишь одна из разновидностей микрометастазов в широком смысле этого слова. Изначально термином «микрометастазы» обозначали кластер опухолевых клеток диаметром менее 2 мм, однако при иммуноцитологическом исследовании с применением моноклональных антител к антигенам,удается определить отдельные, «оккультные» раковые клетки, а не только их кластеры. При стандартном цитологическом исследовании метастазы в костный мозг были обнаружены у 2 из 53 (3,77%) больных. У одной из них IV клиническая стадия была установлена до обнаружения метастатических клеток в костном мозге T4N2M1 - конгломерат лимфатических узлов в подмышечной области, метастазы в лимфатические узлы эпигастральной области, парааортальные лимфатические узлы, печень).
У другой пациентки исходная стадия заболевания была расценена как Т2N0M0 (IIA), после цитологического обнаружения метастазов в костный мозг стадия изменена на IV.
Использование МКА САМ 5.2 и KL-1 позволило во всех случаях подтвердить наличие цитологически выявленных метастазов в костном мозге и существенно повысить частоту их обнаружения при иммуноморфологическом исследовании. Так с применением иммуноцитологического метода диагностики метастазы в костный мозг были выявлены у 24 (45,3%) больных. Важно, что в нашем исследовании количество опухолевых клеток, определяемых иммуноцитологически, было очень низким: от 1 до 12 среди 1 млн миелокариоцитов. Лишь у 2 из 28 больных иммуноцитологически было обнаружено 20 опухолевых клеток и у 1 больной - 45 клеток в 1 млн миелокариоцитов. Возможность выявления единичных опухолевых клеток является главной причиной большей чувствительности иммуноцитологии (по сравнению с цитологическим исследованием) и ее основным преимуществом. Частота иммуноцитологического обнаружения микрометастазов в костный мозг возрастала от I к IV стадии РМЖ (от 40 до 62,5%).
При стандартном цитологическом исследовании метастазы в костный мозг были обнаружены у 2 из 53 (3,77%) больных. У одной из них IV клиническая стадия была установлена до обнаружения метастатических клеток в костном мозге T4N2M1 - конгломерат лимфатических узлов в подмышечной области, метастазы в лимфатические узлы эпигастральной области, парааортальные лимфатические узлы, печень).
У другой пациентки исходная стадия заболевания была расценена как Т2N0M0 (IIA), после цитологического обнаружения метастазов в костный мозг стадия изменена на IV.
Использование МКА САМ 5.2 и KL-1 позволило во всех случаях подтвердить наличие цитологически выявленных метастазов в костном мозге и существенно повысить частоту их обнаружения при иммуноморфологическом исследовании. Так с применением иммуноцитологического метода диагностики метастазы в костный мозг были выявлены у 24 (45,3%) больных. Важно, что в нашем исследовании количество опухолевых клеток, определяемых иммуноцитологически, было очень низким: от 1 до 12 среди 1 млн миелокариоцитов. Лишь у 2 из 28 больных иммуноцитологически было обнаружено 20 опухолевых клеток и у 1 больной - 45 клеток в 1 млн миелокариоцитов. Возможность выявления единичных опухолевых клеток является главной причиной большей чувствительности иммуноцитологии (по сравнению с цитологическим исследованием) и ее основным преимуществом. Частота иммуноцитологического обнаружения микрометастазов в костный мозг возрастала от I к IV стадии рака молочной железы (от 40 до 62,5%).
Было изучено состояние кроветворения у больных с макрометастазами, микрометастазами и без опухолевого поражения костного мозга. У 2 пациенток с макрометастазами рака молочной железы в костном мозге, подтвержденными цитологическим и иммуноцитологическим методами, наблюдалась выраженная реакция системы кроветворения в виде гипоплазии костного мозга.
Содержание миелокариоцитов и мегакариоцитов в костном мозге обеих пациенток было понижено. У одной из них гранулоцитарный и эритроидный ростки были относительно сохранны, однако среди клеток красного ряда преобладали оксифильные формы (24%; норма - 0,8-5,6%). У другой пациентки эритроидный росток был представлен единичными клетками (4,9%; норма - 14,5-26,5%), резко увеличено отношение лейкоцитов и эритробластов (15,0; норма - 2,1-4,5), понижен индекс созревания нейтрофилов, повышено количество моноцитов и лимфоцитов.В группе больных с микрометастазами в 2 раза чаще отмечено снижение клеточности костного мозга (53,6%), чем у пациенток без метастатического поражения костного мозга (28%; р<0,05).
Косвенными признаками присутствия опухолевых клеток в костном мозге можно считать скопления 3-5 плазматических клеток и обнаружение крупных клеток с гиперхромным ядром и множественными нуклеолами, отличающихся от нормальных клеток костного мозга.Скопления плазматических клеток не типичны для нормальной миелограммы. У 100% больных, в пунктах которых регистрируются такие скопления, иммуноцитологически выявлены микрометастазы в костный мозг. Таким образом, обнаружена достоверная связь между наличием в костном мозге скоплений плазматических клеток и обнаружением микрометастазов (р=0,001).
Вывод
В результате анализа литературы и ресурсов интернета мы выяснили, что гистохимические и иммуноцитологические методы имеют очень широкою область применения и по мере развития заболеваний их появляется все больше. Т.к. они являются универсальными реакциями для выявления все основных компонентов клетки и определения изменений в ней. Также иммуноцитологические методы являются методами ранней диагностики рака внутренних органов. Что делает их роль в лечении этого заболевания одной из первостепенных.
Список литературы
1..
2.Северин Е.С. Основы биохимии
3.А. Поликар, М. Бесси Элементы патологии клетки.
4. Гистохимия, пер. с англ., М., 1962; Принципы и методы гистоцитохимического анализа в патологии, под ред. А.П. Авцына
5.http://meduniver.com/Medical/gistologia
6. О.В. Крохина, В.П. Летягин, Н.Н. Тупицын, В.Н. Блиндарь, А.Д. Зикиряходжаев, ГУРОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН журнал «Маммология», №1, 2005