Властивості кальційактивованих та АТФ-індукованих калієвих струмів мембрани міоцитів taenia caeci морської свинки - Автореферат

Основні функції кишечнику тісно повязані з його моторикою (сегментарне скорочення та перистальтичні хвилі), і забезпечується узгодженою роботою гладеньких мязів поздовжнього та кільцевого шару стінки кишки. Вважається, що пуринергічне гальмування опосередковане активацією метаботропних пуринорецепторів (P2Y) і центральною ланкою цього гальмування є підвищення рівня внутрішньоклітинного кальцію за рахунок вивільнення його з внутрішньоклітинного інозитолтрифосфатного (IP3) кальцієвого депо та наступною активацією кальційзалежних калієвих каналів малої провідності (SK) (Sanders et al. Питання про типи кальційзалежних калієвих каналів (КСА) в мембрані цих клітин та можливої їх участі у пуринергічному гальмуванні залишається відкритим. Тому значний науковий інтерес викликає виділення компонентів кальційзалежного калієвого струму (ІК(Ca)) із сумарного трансмембранного іонного струму, дослідження їх фармако-біофізичних характеристик, а також визначення їх внеску у процеси пуринергічного гальмування гладеньких мязів шлунково-кишкового тракту (ШКТ). За допомогою методу фіксації потенціалу в конфігурації “whole-cell patch-clamp” було проведено розділення на компоненти інтегральних калієвих струмів та вивчення їх біофізичних та фармакологічних характеристик.Для розділення та вивчення характеристик компонент ІК(Са), було використано неселективний блокатор К каналів - ТЕА, та відомий блокатор ВК каналів великої провідності - паксилін. На рисунку 2 показано вольтамперну характеристику (ВАХ) паксилінчутливого ІК(Са), що переноситься через ВК канали, отриманого шляхом відніманням значень струму при дії блокатора від контрольних значень. Паксилін, при додаванні його в концентрації 100 НМ до розчину ТЕА (1 ММ), не викликав додаткового зменшення вихідного струму (рис. В наступних дослідах для розділення вихідного струму на компоненти та вивчення його характеристик було використано селективний блокатор BK каналів - паксилін (100НМ) (Gungdi et al. Аплікація d-ТК, як блокатора SK каналів, призводила до пригнічення СВС малої амплітуди, в той час як частота появи СВС великої амплітуди майже не зменшувалась.За допомогою метода фіксації потенціалу було показано, що вихідний трансмембранний іонний струм ГМК taenia caeci морської свинки має три складові: потенціалзалежний струм «затриманого випрямлення» та два компоненти Са2 залежного К струму. Вихідний калієвий струм на 50% блокується неселективним блокатором ВК каналів ТЕА (1ММ), та на 40% - селективним блокатором ВК каналів паксиліном (100 НМ). СВС малої амплітуди чутливі до дії d-ТК, що свідчить про активацію SK каналів. Блокатор ІР3 рецепторів 2-АРВ (30 МКМ) пригнічує частоту СВС малої амплітуди та не впливає на СВС великої амплітуди. Активація пуринорецепторів шляхом прикладення АТФ (100 МКМ) супроводжується значним приростом частоти СВС малої амплітуди, що обумовлено активацією SK каналів чутливих до дії d-TK.

Рис. 1. Дія паксиліну на вихідний струм ГМК taenia caeci.

А - вихідні струми викликані деполяризацією від - 60 МВ до 50 МВ, в контролі - 1, при дії паксиліну (100НМ) - 2. Б - Зміна амплітуди вихідного струму в часі, контролі-1, при дії паксиліну (100НМ) - 2, відмивання паксиліну з камери - 3

Загальна характеристика Са2 залежних К струмів гладенькомязових клітин taenia caeci морської свинки. Для розділення та вивчення характеристик компонент ІК(Са), було використано неселективний блокатор К каналів - ТЕА, та відомий блокатор ВК каналів великої провідності - паксилін. В якості блокатора SK каналів було використано відомий нейромодулятор d-тубокурарин (d-ТК). Трансмембранні струми викликались за допомогою ступінчастих зміщень мембранного потенціалу від підтримуваного рівня - 60 МВ, що наближується до фізіологічного потенціалу спокою цих клітин. Типові значення вхідного опору клітин, що використовувались в наших експериментах, складали 1 - 2 ГОМ. В досліджуваних клітинах при ступінчатих деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу від підтримуваного потенціалу -60 МВ тривалістю 250 мс, виникав вихідний струм з порогом активації -30 МВ.

Рис. 2. Властивості паксилінчутливого вихідного струму.

А - вольтамперні характеристики “чистого” паксилінчутливого вихідного струму (¦),вольтамперні характеристики вхідного кальцієвого струму (^). Б - нормалізована активація вихідного струму в контролі (?), та при прикладенні паксиліну (^).

Аплікація паксиліну за таких експериментальних умов викликала значне пригнічення вихідного струму, також знижувались його осциляції. На рис. 1 показана дія паксиліну (100 НМ) на трансмембранний іонний струм. На цьому ж рисунку подана динаміка дії паксиліну на амплітуду вихідного струму. Ефект паксиліну досягав максимуму протягом 2 - 3 хвилин від початку його аплікації. Постійна часу дії паксиліну складала 1,3 ± 0,3 хв (n=5). Відновлення амплітуди вихідного струму при відмиванні токсину відбувалось з постійною часу 0,9 ± 0,1 хв (n=5).

Рис. 3. Сумісна дія паксиліну та ТЕА на вихідні струми.

А - вихідні струми викликані деполяризацією від - 60 МВ до 40 МВ, в контролі - 1, при дії ТЕА ( 1 ММ ) - 2, при дії паксиліну (100 НМ ) на фоні ТЕА (1 ММ) - 3. Б - в контролі - 1, при дії паксиліну - 2, при дії ТЕА на фоні паксиліну - 3.

На рисунку 2 показано вольтамперну характеристику (ВАХ) паксилінчутливого ІК(Са), що переноситься через ВК канали, отриманого шляхом відніманням значень струму при дії блокатора від контрольних значень. На ВАХ паксилінчутливого ІК(Са) (рис. 2.А) спостерігається зміна крутизни “перегин” в районі максимуму активації ІСА, що дає змогу казати про залежність, цього струму від концентрації іонів Са2 в середині клітини. Крім того, канали, через які переноситься паксилінчутливий ІК(Са), проявляли потенціалзалежні властивості. Зі збільшенням рівня деполяризації спостерігалось збільшення його амплітуди, незважаючи на зменшення входу Са2 в клітини при потенціалах 20… 40 МВ. На рисунку 2.Б показано криві нормалізованої провідності вихідного струму. Половина максимальної активації V0,5 в контролі складала 32.6±1.2 МВ, а коефіцієнт крутизни становив 12±0.7 МВ. При дії паксиліну ці значення становили 19.1± 0.9 МВ та 15± 0.6 МВ відповідно (n=7).

ТЕА ? відомий неселективний блокатор калієвих каналів (Blatz et al. 1984, Benham et al. 1985). В концентрації 1 ММ ТЕА блокував вихідний струм, викликаний зміщенням мембранного потенціалу від підтримуваного рівня -60 МВ до 50 МВ, більш ніж на 50±6 % (n=6). Паксилін, при додаванні його в концентрації 100 НМ до розчину ТЕА (1 ММ), не викликав додаткового зменшення вихідного струму (рис. 3.А). В той же час, додаткова аплікація ТЕА (1ММ) (рис. 3.Б) в присутності паксиліну, призводить до подальшого пригнічення вихідного струму.

Раніше було показано (Повстян та ін. 2000), що IK(Ca), який переносяться через КСА великої провідності ефективно та однаково блокується наномолярними концентраціями харибдотоксину та ТЕА в концентрації 1 ММ. В той же час паксилін, високоспеціфічний блокатор КСА каналів великої провідності призводить до меншого блокування, ніж ТЕА, і, відповідно, харибдотоксин.

Рис. 4. Динаміка дії d-TK на вихідні іонні струми ГМК taenia caeci.

А - Струми викликані ступінчастим зміщенням мембранного потенціалувід -60 до 40 МВ, в контролі - 1, та після додавання d-ТК (50 МКМ) - 2. Б - Зміна амплітуди вихідного струму з часом при дії d-TK (50 МКМ), та при відмиванні d-TK з робочої камери.

В якості блокатора SK каналів було застосовано d-ТК, що є відомим модулятором нікотинових холінорецепторів (Wenningmann et al. 2001) та широко застосовується як в дослідницьких цілях, так і в медицині. Але відомі інші дані про його додаткові властивості, як блокатора КСА каналів (Vacher et al. 1998, Ishii et al. 1997). В звязку з тим, що на ГМК кишечнику не встановлено наявність нікотинових холінорецепторів, це дало підстави використати та вивчити вплив d-ТК на іонні струми, що протікають через мембрану міоцитів. Аплікація d-ТК (500НМ-1ММ) пригнічувала вихідний трансмембранний струм, викликаний ступінчастим зміщенням мембранного потенціалу від підтримуваного рівня ? 60 МВ, у концентраційно-залежний спосіб. З побудованої кривої доза-ефект, було встановлено, що концентрація половинного ефекту становить ІС50 = 38±5 МКМ (n=7).

На рисунку 4. подано динаміку дії d-ТК на амплітуду вихідного струму з часом. Часова розгортка дії d-ТК (50 МКМ) показала, що повний ефект блокування досягав максимуму через 2,5 - 3,5 хвилини після початку прикладання блокатора. Постійна часу дії d-ТК складала 1 ± 0,2 хв (n=5). Відновлення амплітуди вихідного струму при відмиванні токсину 1,2 ± 0,2 хв (n=5).

Усереднені (n=9) ВАХ дії d-ТК на трансмембранний іонний струм наведено на рис 5. Як видно з рисунка, вклад d-TK чутливого струму в загальний вихідний струм на максимумі та в кінці деполяризуючого імпульсу, тривалістю 500 мс, був приблизно однаковим. Виходячи з динаміки кривої ВАХ можна зробити висновок, що канали, через які переноситься d-ТКЧУТЛИВИЙ струм, не проявляють потенціалзалежних властивостей.

Рис. 5. Усередненні ВАХ вихідного струму при дії d-тубокурарину.

Усереднені ВАХ вихідного струму (отриманим на 12-ти клітинах), знятих на максимумі - А, та на при кінці деполяризуючого імпульсу -Б. ¦ - контроль, ? - на фоні дії d-тубокурарину, ^ - “чистий” ІК(Са) чутливий до d-тубокурарину

Поряд з цим на ВАХ досить добре простежується максимум в районі 40 МВ, що не співпадає з максимумом ICA , котрий знаходиться в діапазоні потенціалів біля 10 МВ (рис 2).

Рис. 6. Дія d-ТК та паксиліну на вихідний іонний струм.

А -в контролі - 1,при дії паксиліну (100НМ) - 2, при наступні аплікації d-ТК (50МКМ) на фоні паксиліну (100НМ) - 3. Б - в контролі - 1, при дії d-тубокурарину (50МКМ) -2, при одночасовій аплікації d-ТК (50МКМ) та паксиліну (100НМ) - 3.

Подібні ефект було отримано на вісцеральних гладенькомязових клітинах (Yamamoto et al. 1989, Zholos et al. 1992), що було, на думку авторів, повязано з кальційзалежними механізмами вивільнення кальцію з внутрішньоклітинного кальцієвого депо.

В наступних дослідах для розділення вихідного струму на компоненти та вивчення його характеристик було використано селективний блокатор BK каналів - паксилін (100НМ) (Gungdi et al. 1999). Додавання до зовнішнього розчину паксиліну викликало значне пригнічення вихідного струму (рис 6.А), та суттєво зменшувались осциляції. Додаткове додавання d-TK на фоні паксиліну викликало додатково незначне пригнічення вихідного струму. На рис 6. Б наведено дію d-ТК на вихідний струм. Як і в попередньому разі, d-ТК заблокував незначну частину вихідного струму, до того ж осциляції струму та його кінетика майже не змінилась. Додавання паксиліну до розчину в присутності d-ТК, призводило до значного пригнічення вихідного струму, при цьому значно зменшувались осциляції струму та його кінетика. Отриманні дані дозволяють зробити припущення, що паксилін та d-ТК діють на різні типи каналів незалежно один від одного. До того ж слід відмітити, що вклад паксилінчутливих каналів до загального вихідного струму значно більший, ніж вклад d-тубокураринчутливих каналів.

Властивості спонтанних вихідних струмів гладенькомязових клітин. Друга частина роботи була присвячена вивченню характеристик спонтанних вихідних струмів (СВС), та впливу на них блокаторів калієвих каналів. В багатьох клітинах при деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу виникали СВС, реєстрація яких проводилась протягом 100 с. СВС починали зявлятись при потенціалах більш позитивних ніж ? 60 МВ (рис. 7).

Рис. 7. Реєстрація спонтанни вихідних струмів (СВС).

СВС були записані при відповідних наведеним тестових потенціалах від - 50 до - 10 МВ.

Як видно з рисунка, зі збільшенням мембранного потенціалу зростали амплітуда та частота зареєстрованих СВС.

СВС різної амплітуди можуть утворюватись за рахунок багаторазового локального звільнення Са2 з внутрішньоклітинного депо, а також неоднорідності популяції кальційактивованих калієвих каналів. Як встановлено, в утворенні СВС приймають участь як ВК канали, так і SK канали. Окрім цього, в деяких роботах (Kong et al. 2000) припускають, що СВС малої амплітуди в більшості формуються за рахунок активації SK, в той час як СВС великої амплітуди ? за рахунок активації ВК.

Рис. 8. СВС та їх пригнічення під впливом d-ТК та ТЕА.

А:а - СВС малої та великої амплітуди при потенціалі фіксації - 30 МВ в контролі, б -дія d-ТК (50МКМ), в - наступне додавання ТЕА (1ММ). Б - амплітудна гістограма, що відображає пригнічуючи дію d-тубокурарину та ТЕА на частоту СВС великої та малої амплітуди, за 100 секунд реєстрації.

Дія блокаторів КСА каналів, d-ТК та ТЕА, на СВС (підтримуваний потенціал - 30 МВ) наведено на рис. 8. Аплікація d-ТК, як блокатора SK каналів, призводила до пригнічення СВС малої амплітуди, в той час як частота появи СВС великої амплітуди майже не зменшувалась. Додавання ТЕА (1ММ) як блокатора ВК каналів, на фоні дії d-ТК призводило до пригнічення не тільки СВС великої амплітуди, але і залишкових СВС малої амплітуди. На рисунку 8.Б подано амплітудну гістограму блокуючої дії d-ТК та ТЕА на СВС мембрани ГМК. Ймовірно, що СВС великої амплітуди мають в своєму складі d-ТК чутливий компонент, що переноситься через SK канали. В той же час в формуванні СВС малої амплітуди приймає участь ТЕАЧУТЛИВИЙ компонент.

Ці дослідження показали, що СВС в ГМК taenia caeci морської свинки є результатом відкривання ВК каналів, чутливих до дії паксиліну та ТЕА, та SK каналів, чутливих до дії d-TK.

Властивості спонтанних вихідних струмів, викликаних пуринергічною активацією ГМК кишечнику морської свинки. Активація пуринорецепторів мембрани інтестинальних ГМК аплікацією АТФ, доданого до зовнішнього розчину, активує КСА канали. Ми вивчали ефекти наведеного агоніста на струм при підтримуваному потенціалі ? 40 МВ.

Рис. 9. Вплив АТФ на СВС. Клітини утримувалися при потенціалі -40 МВ. А: а - контроль СВС, б - після додавання АТФ (100 МКМ). Б: Загальна гістограма відображає кількість СВС протягом 100 сек. Запису протоколу.

За таких умов АТФ в концентрації 100 МКМ істотно підвищував частоту появи СВС, а особливо компоненти малої амплітуди. Приріст СВС малої амплітуди на максимумі складав 60% ±5% (n=4) (рис. 9).

Рис. 10. Вплив АТФ на СВС в присутності блокатора ІР3 рецепторів 2-АРВ. Підтримуваний потенціал складав -40 МВ; А: а - аплікація АТФ без 2-АРВ, б -. Преінкубації 10 хв в 2-АРВ (30 МКМ), в - наступна аплікація АТФ (100 МКМ) на фоні 2-АРВ.;Б: гістограма що відображає частоту СВС при аплікації АТФ (100 МКМ) фоні блокування ІР3 рецептрорів

У більшості ГМК локальне спонтанне вивільнення кальцію (спарки) обумовлено активністю ріанодинових депо, оскільки аплікація ріанодину викликає блокування спонтанного та підсиленого агоністами вивільнення іонів Са2 (Guerrero-Hernandez et al. 2002). З іншого боку показано, що виділення кальцію з інозитолтрифосфат (ІР3) - керованого депо є як джерелом активності Са2 “puffs” в гладеньких мязах, так і регенеративної взаємодії між виділенням кальцію з ІР3 рецепторів та ріанодинових рецепторів (Boittin et al., 2000). Зазвичай, підсилення продукції ІР3 та наступне виділення Са2 є характерною рисою для відповіді на аплікацію гальмуючих агоністів в гладеньких мязах. У випадку гладеньких мязів ШКТ, цей механізм може пояснити пригнічувальну дію АТФ, який вважається гальмівним нейротрансміттером, виділеним з ентеро-мотонейронів (Shuba et al. 2003).

Преінкубація клітин в розчині, що містив 30 МКМ 2-АРВ, блокатора ІР3 рецепторів, протягом 10 хвилин показала, що прикладення АТФ (100 МКМ) не призводить до суттєвих змін у частоті появи викликаних СВС, як малої так і великої амплітуди (рис. 10). Окрім цього, інкубація в розчині 2-АРВ призводить до незначного зменшення частоти СВС малої амплітуди (дані не наведено), що може свідчити про залежність цієї частини СВС від кальцію, що звільняється з ІР3 чутливого депо. До того ж можна припустити, що активація

Рис. 11. Вплив АТФ на СВС в присутності блокатора PLC U73122. Підтримуваний потенціал складав -40 МВ.: А. а - Преінкубації 10 хв в U73122 (5 МКМ), в - наступна аплікація АТФ (100 МКМ) на фоні U73122.; Б. гістограма що відображає частоту СВС при аплікації АТФ (100 МКМ) фоні блокування PLC

ІР3 залежного депо виступає пусковим механізмом в ефекті активації гальмування, викликаного АТФ.

Рис. 12. Вплив d- тубокурарину та ТЕА на СВС активованих АТФ.

А: а - СВС активовані прикладенням АТФ (100 МКМ), б - аплікація d-тубокурарину, в - додаткова аплікація ТЕА (1 ММ).Б: загальна гістограма, що відображає кількість СВС протягом 100 сек. запису протоколу.

Для блокування ІР3 шляху застосовували блокатор фосфоліпази С (U73122). За таких умов не відбувалось збільшення частоти СВС при аплікації АТФ. (Рис. 11). Відсутність збільшення частоти СВС у відповідь на аплікацію АТФ на фоні U73122 до зовнішнього розчину свідчить, що ІР3 залежне збільшення вивільнення кальцію ? основний механізм P2Y рецептор-модульованої стимуляції вихідного струму та гіперполяризації. Вивільнення кальцію асоційоване з активацією SK та BK каналів міоцитів taenia caeci.

На рис. 12 подано вплив блокаторів КСА каналів на викликані агоністіндукованою активацією СВС. Потенціал фіксації становив - 40 МВ. Як видно d-ТК, як антагоніст SK каналів, в концентрації 50 МКМ послаблював СВС малої амплітуди (Рис. 12). СВС записано протягом 100 сек. реєстрації (n= 5). СВС великої амплітуди були також дещо пригнічені застосуванням d-ТК. Це вказує на наявність в складі викликаних СВС великої амплітуди компоненти струму d-ТКЧУТЛИВИХ каналів. Результати свідчать, що СВС у ГМК taenia caeci морської свинки, є результатом відкривань BK каналів та d-ТКЧУТЛИВИХ каналів. Аплікація ТЕА (1 ММ), як неселективного блокатора ВК каналів, на фоні дії d-ТК блокувала не лише СВС великої амплітуди, але і залишкові СВС малої амплітуди. На рис. 12 Б. наведено амплітудну гістограму блокуючої дії d-ТК та ТЕА на СВС, індуковані аплікацією АТФ. Пригнічення SK каналів може призводити до редукції СВС великої амплітуди та сприйняття останніх в якості СВС малої амплітуди після застосування d-ТК.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

В результаті проведених досліджень по розділенню сумарного трансмембранного іонного струму ГМК поздовжнього мяза сліпої кишки (taenia саесі) морської свинки на компоненти, дослідженню їх фармако-біофізичних характеристик було показано, що при ступінчастій деполяризації мембрани в переносі вихідного струму приймають участь потенціалкеровані К канали затриманого випрямлення та два типи КСА каналів, що узгоджується з літературними даними (Жолос та ін. 1986, Yamamoto et al 1989). Показано наявність паксилінчутливого IK(Ca), що переноситься через ВК, та паксиліннечутливого компоненту. Раніше було показано (Повстян та ін. 2000), що IK(Ca), які переносяться через КСА великої провідності, ефективно блокуються наномолярними концентраціями харибдотоксину та ТЕА в концентрації 1 ММ. В той же час паксилін, високоспеціфічний блокатор КСА каналів великої провідності не призводив до блокування вихідних струмів, як це було показано для харибдотоксина та ТЕА. На фоні дії паксиліну (100 НМ) ТЕА в концентрації 1 ММ проявляв подальше пригнічення вихідних К струмів. ВАХ паксиліннечутливого компоненту виявила, що цей струм проявляє потенціалзалежні властивості, тобто зі збільшенням рівня деполяризації відбувається збільшення його амплітуди. Поряд з цим вольтамперна характеристика має перегин в області максимуму кальцієвого струму, що може свідчити про залежність цього струму від внутрішньоклітинної концентрації кальцію. Це вказує на наявність паксиліннечутливого компоненту К струмів, який блокується менш селективними блокаторами, такими як ТЕА та харибдотоксин, останній має блокуючий вплив, як на ВК канали (Knaus et al. 1994, Orio et al. 2002), так і на КСА проміжної провідності (ІК) (Bychkov et al. 2002, Edwards et al. 1998; 2000). Зясування природи цього компоненту К струму вимагає застосування більш селективних блокаторів К каналів.

Другий вагомий компонент КСА струму переноситься через КСА канали малої провідності, для яких селективним блокатором виступає апамін (Shuba et al. 1981, Shuba et al. 2000, Burnham et al. 2002). Але, як було показано (Повстян та ін. 2000), апамін має побічну дію у вигляді активації каналів, що переносять неселективний катіонний струм. Для усунення невизначеності дії апаміну, в наших дослідах в якості блокатора SK каналів було застосовано d-TK, що є відомим модулятором нікотинових холінорецепторів та широко застосовується, як в дослідницьких цілях, так і в медицині (Wenningmann et al. 2001). Але окрім впливу на нікотинові холінорецептори існують дані про його додаткові властивості, як блокатора КСА каналів (Wang et al. 1999, Barfod et al. 2001). В звязку з тим, що на ГМК кишечнику не встановлено наявність нікотинових холінорецепторів, це дало підстави використати та вивчити вплив d-ТК на іонні струми, що протікають через мембрану ГМК taenia ceaci морської свинки.

Ефект блокування IK(Ca) аплікацією d-ТК досягав максимума через 2,5 - 3,5 хвилини після початку прикладення блокатора. IK(Ca), що переноситься через SK канали, не проявляв на відміну від паксилінчутливого струму, часозалежної інактивації та потенціалзалежних властивостей. Крива ВАХ цього струму мала максимум в діапазоні 30, 50 МВ, що не співпадає з максимумом кальцієвого струму котрий знаходиться в діапазоні потенціалів біля 10 МВ. Подібні ефекти було описано на вісцеральних гладенькомязових клітинах (Yamamoto et al. 1989, Zholos et al. 1992), та були повязані з кальційзалежними механізмами вивільнення кальцію з внутрішньоклітинного кальцієвого депо. Поряд з цим дослідження, проведені по вивченню впливу d-ТК на вхідні Са2 струми показали, що d-ТК не впливає на потенціалзалежні Са2 канали L - типу, котрі були виявлені на мембрані ГМК (Yamamoto et al. 1989, Жолос та ін. 1986, Зима та ін. 1994), що збігається з літературними даними (Wang et al. 1999).

Окрім наведених відмінностей встановлено, що ВК та SK канали сильно відрізняються по чутливості до ТЕА, неселективного блокатора К каналів. Як було сказано вище, ВК канали блокуються при додаванні до зовнішнього розчину ТЕА в низьких концентраціях, що в наших дослідах складало 1 ММ. В той же час SK канали, що з успіхом блокувались низькими концентраціями d-ТК (50 МКМ), виявились нечутливими до аплікації ТЕА навіть в концентраціях 4 - 5 ММ, що узгоджується з літературними даними (Latorre et al. 1983, Blatz et al. 1984, Benham et al. 1985). Більше того, було показано (Blatz et al. 1986), що ТЕА не виявляє блокуючої дії на SK канали навіть в великих концентраціях (20- 25 ММ).

Одною з найважливіших характеристик IK(Ca), що переноситься як через ВК канали так і SK канали, є чутливість цих каналів до зміни [Са2 ]i. З літературних джерел відомо (Becker et al. 1989, Ganitkevich et al. 1991), що при фізіологічних умовах [Са2 ]i в ГМК знаходиться в діапазоні 100 - 120 НМ. При деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу до 0 МВ [Са2 ]i різко зростає, досягаючи рівня 1000 НМ, після чого спадає до стаціонарного рівня 200 - 300 НМ, на якому продовжує триматися протягом декількох секунд до припинення деполяризації. Аналогічні дані були отриманні в дослідах на тонкому кишечнику мишей (Vogalis et al. 1997). В цій роботі було визначено порогову [Са2 ]i необхідну для активації К каналів, що становила 85 НМ. В той же час для активації ВК каналів необхідна значно вища [Са2 ]i, ніж для SK каналів. Проведені досліди з використанням іонів Со2 в зовнішньому розчині також підтверджують дані, що для активації ВК каналів необхідне значне підвищення [Са2 ]i за рахунок надходження іонів Са2 ззовні клітини, та/або вивільнення їх з внутрішньоклітинного депо.

Відносний вклад кожного з компонентів в сумарний вихідний струм варіював у різних клітин, але в більшості випадків величина їх залишалась в певних межах. Було встановлено, що близько 90% вихідного трансмембранного струму переноситься через потенціалкеровані К канали “затриманого випрямлення” та ТЕАЧУТЛИВІ ВК канали. В свою чергу, більш детальний вклад кожного компоненту до загального струму варіював наступних межах: 30 - 45% для Са2 незалежного К струму “затриманого випрямлення”, 40 - 50% для паксилінчутливого IK(Ca), що переноситься через ВК канали, 5 - 15% для ТЕАЧУТЛИВОГО IK та 5 - 15% для d-ТКЧУТЛИВОГО IK(Ca), що переноситься через SK канали. Потрібно наголосити, що результати про процентний вклад кожного з вищеназваних компонент до загального вихідного струму, отримані за допомогою фармакологічного розділення, співпадали з результатами отриманими за допомогою віднімання окремих компонент вихідного струму.

Отриманні нами дані свідчать, що в ГМК taenia caeci морської свинки окрім викликаних вихідних калієвих струмів можуть також виникати СВС. На сьогоднішній день аналогічні струми вже описані в багатьох ГМК: трахеї, різних відділах кишечнику та кровоносних судин (Шуба 1965, Bolton et al. 1996). Фізіологічна роль СВС, поки що достеменно невідома.

Велике зацікавлення викликає питання з приводу джерела Са2 , необхідного для активації кожного зі згаданих раніше компонентів IK(Ca). На сьогодні існує багато думок з цього приводу. Проведені нами досліди, а також отриманні раніше дані (Cole et al. 1989, Повстян та ін. 1997) наочно демонстрували, що амплітуда вихідного К струму, через наявність Са2 чутливої компоненти, сильно залежить від кількості Са2 , що входить до клітини через потенціалкеровані Са2 канали під час деполяризуючого зміщення мембранного потенціалу. Блокування цих каналів іонами Со2 призводило до значного пригнічення вихідного струму. Нездатність паксиліна пригнічувати вихідний струм в умовах блокування входу іонів Са2 в клітину може слугувати доказом того, що для активації КСА каналів великої провідності ГМК taenia caeci морської свинки необхідне значне підвищення [Са2 ]i в даному разі за рахунок входу іонів Са2 ззовні через потенціалкеровані Са2 канали L-типу. В той самий час, для активації SK потрібно незначне підвищення [Са2 ]i вище порогового рівня, як зазначалось раніше, близько 85 НМ (Vogalis, Goyal 1997).

В той же час було виявлено, що іони Ca2 , які спонтанно вивільняються з саркоплазматичного ретикулуму (СР), так звані Са2 спарки, також можуть викликати активацію КСА , при цьому активність каналів буде проявлятись у вигляді СВС (Bolton et al. 1996, Gordienko et al. 1998, Bayguinov et al 2001). Са2 спарки призводять до локального підвищення [Са2 ]i, що в свою чергу призводить до активації невеликої кількості КСА (10-100) (Бурый та ін. 1992, Benham et al. 1986), які генерують появу СВС. Лише суттєве вивільнення Са2 з СР (викликане наприклад аплікацією кофеїну) може призвести до активації великої кількості КСА каналів та викликати появу вихідного інтегрального макроструму (Гордиенко та ін. 1995, Повстян та ін. 2000). Однак в реальних умовах, подібне масове вивільнення Са2 депо видається мало ймовірним.

В одній з недавніх робіт, що стосувалась вивчення впливу апаміна на іонні струми ізольованих ГМК ШКТ (Kong et al. 2000) було показано, що СВС можна розділити на два типи - великої та малої амплітуди. Перші блокувались харибдотоксином та утворювались завдяки активації ВК каналів, а другі ? апаміном, і, відповідно формувались SK каналами. Проведені нами досліди показали, що паксилін ефективно блокував СВС великої амплітуди, при цьому частота СВС малої амплітуди майже не змінювалась, і, відповідно, не блокувались паксиліном. що узгоджується з наведеними даними. В той же час d -TK призводив до блокування СВС малої амплітуди, що може свідчити про те, що вони формуються за рахунок активації SK. ТЕА неселективний блокатор К каналів, на відміну від паксиліна, блокуючи СВС великої провідності також незначно пригнічував СВС малої амплітуди. Як було показано, на інтегральних струмах існує К провідність, яка нечутлива до паксиліну, але блокується ТЕА, і відповідно робить вклад в СВС малої амплітуди.

Підсумовуючи вище згадані дані, можна зробити висновок, що в ГМК taenia caeci морської свинки існує щонайменше два компоненти IK(Ca). Ці компоненти відрізняються між собою не лише провідністю каналів, через які вони переносяться, але і їх чутливістю до [Са2 ]i та змін мембранного потенціалу, а також відрізняються кінетичними характеристиками. Окрім наведеного вище, ці канали відрізняються чутливістю до блокаторів (d-TK, паксиліну, ТЕА). Так, d-TK виступає ефективним блокатором SK каналів ГМК ШКТ та може бути використаний, як інструмент для розділення та вивчення іонних струмів.

Локальне підвищення Са2 виступає важливою ланкою в регуляції мембранного потенціалу, збудливості клітини та агоністіндукованих реакцій (Gordienko et al. 1998, Collier et al. 2000). Ці процеси є безпосереднім результатом вивільнення іонів Са2 через ріанодинчутливі канали, або через ІР3 активовані канали на саркоплазматичному ретикулумі. В деяких клітинах, локальне вивільнення Са2 може призводити до утворення так званої Са2 хвилі, що може розповсюджуватись навколо місця ініціації та через всю клітину (Gordienko et al. 1998, Jaggar et al. 2000). Локальне вивільнення Са2 в безпосередній близькості до плазматичної мембрани, викликає просторово обмежене збільшення концентрації останнього, що сягає 1 МКМ (Perez et al. 1999). Таке локальне підвищення [Са2 ]i активує Са2 залежні іонні канали, що розташовані поблизу місця вивільнення іонів Са2 . Тому головним звязуючим ланцюгом між вивільненням Са2 та клітинною відповіддю, виступає активація іонної провідності в плазматичній мембрані.

Активація вихідного калієвого струму відповідає за генерацію неадренергічних нехолінергічних гальмівних синаптичних потенціалів (НАНХ ГСП). На сьогоднішній день загальноприйнята думка, що АТФ, так само як і NO, виступає медіатором гальмівної нейропередачі в ШКТ (Шуба та ін. 1998, Shuba et al.2003, Moore et al. 1990). В taenia caeci морської свинки стимуляція НАНХ-нейронів призводила до генерації двофазного ГСП (И.А. Владимирова та ін. 1984,1993). Повільний компонент цього ГСП блокується інгібіторами NO-синтази та харибдотоксином, блокатором ВК каналів (Шуба та ін. 1998, Shuba et al. 2003, Загороднюк та ін. 1994), а швидкий - антагоністом пуринорецепторів суруміном, та блокатором SK каналів апаміном (Владимирова та ін. 1986, Шуба та ін. 1998, Shuba et al. 2003). Проведені нами досліди по вивченню впливу АТФ на поодинокі ГМК taenia caeci морської свинки показали, що АТФ (100 МКМ) при підтримуваному потенціалі в -40 МВ, призводив до значного приросту СВС малої амплітуди. При цьому частота СВС великої амплітуди сильно не змінювалась. Як було вказано раніше, СВС малої амплітуди формуються здебільшого за рахунок активації SK каналів. Прикладення d-TK, як блокатора SK каналів, призводило до значного пригнічення СВС малої амплітуди, та усунення впливу АТФ. Це збігається з існуючими даними на багатоклітинних препаратах, уявленнями та літературними даними (Bayguinov et al. 2000, Shuba et al. 2003). Для встановлення джерела кальцію, що задіється в цих процесах було використано мембраннопроникний антагоніст ІР3 рецепторів - 2-аміноетоксидифеніл борат (2-АРВ) (Maruyama et al. 1997). Преінкубація клітин в розчині з 2-АРВ (30 МКМ) не призводила до суттєвих змін СВС, активованих вивільненням Са2 з ріанодинових депо. В той же час ефект збільшення частоти СВС при аплікації АТФ був відсутній. Дослідження, проведені на багатоклітинних препаратах показували, що 2-АРВ пригнічував ГСП, викликані інтрамуральним подразненням у препаратах caecum та colon, а також АТФ та НА - викликану гіперполяризацію (Shuba et al. 2003). Це дає можливість зробити висновок, що вивільнення Са2 з ІР3чутливого кальцієвого депо виступає проміжною ланкою в передачі між P2Y рецепторами і активуванням КСА каналів малої провідності, які приймають участь у генерації апамінчутливого ГСП.

АТФ, як гальмівний нейромедіатор, взаємодіє у гладеньких мязах з P2Y рецепторами, котрі відносяться до групи метаботропних рецепторів. Ці рецептори звязані з внутрішньоклітинними G-білками (Gq/11) завдяки яким активують фосфоліпазу С (Kugelgen et al. 2006). Для визначення ролі фосфоліпази С у генерації АТФ-індукованої відповіді, було використано інгібітор фосфоліпази С - U73122 (Smith et al. 1990). За таких умов, додавання АТФ на фоні U73122 (5 МКМ) не призводило до зміни частоти появи СВС, як великої так і малої амплітуди. На багатоклітинних гладенькомязових препаратах caecum (Shuba et al. 2003), застосування U73122, призводило до зменшення амплітуди ГСП, викликаного інтрамуральним подразненням, у порівнянні з тестовим майже на 50%. Наступне додавання апаміну, блокатора КСА малої провідності, призводило до повного блокування ГСП, та появи нехолінергічних збуджуючих синаптичних потенціалів.

Наведені дані дозволяють припустити, що пуринергічна активація СВС є результатом локального вивільнення іонів Са2 із саркоплазматичного ретикулуму, внаслідок активації P2Y рецепторами фосфоліпази С та задіяного нею інозитолтрифосфатного механізму. трансмембранний вихідний струм кишечник1. За допомогою метода фіксації потенціалу було показано, що вихідний трансмембранний іонний струм ГМК taenia caeci морської свинки має три складові: потенціалзалежний струм «затриманого випрямлення» та два компоненти Са2 залежного К струму.

2. Вихідний калієвий струм на 50% блокується неселективним блокатором ВК каналів ТЕА (1ММ), та на 40% ? селективним блокатором ВК каналів паксиліном (100 НМ).

3. Близько 10% вихідного калієвого струму пригнічується блокатором нікотинових холінорецепторів та КСА каналів d-ТК в концентрації 50 МКМ.

4. Спонтанні вихідні струми (СВС) за своїми ознаками можна розділити на струми малої та великої амплітуди. СВС великої амплітуди чутливі до паксиліну та ТЕА. Це вказує, що вони переносяться через ВК канали. СВС малої амплітуди чутливі до дії d-ТК, що свідчить про активацію SK каналів.

5. Блокатор ІР3 рецепторів 2-АРВ (30 МКМ) пригнічує частоту СВС малої амплітуди та не впливає на СВС великої амплітуди. Це свідчить, що результатом виникнення СВС малої амплітуди є вивільнення Са2 з ІР3чутливого Са2 депо міоцитів.

6. Активація пуринорецепторів шляхом прикладення АТФ (100 МКМ) супроводжується значним приростом частоти СВС малої амплітуди, що обумовлено активацією SK каналів чутливих до дії d-TK.

7. АТФ в присутності селективного блокатора фосфоліпази С U73122 (5 МКМ) не впливає на частоту та амплітуду СВС

8. АТФ-індукований Са2 залежний калієвий струм в міоцитах taenia caeci обумовлений залежним від фосфоліпази С збільшенням внутрішньоклітинного рівня ІР3, та наступним вивільненням Са2 з ІР3 чутливого депо міоцитів.

Список опублікованих робіт здобувача за матеріалами дисертації

1. Nessin V.V. Purenergic activation of the cationic conductivity in the guinea pig // Нейрофізіологія/Neurophysiology - 2003. - T.35, № 3/4, - C. 361.

2. Несін В.В., Кришталь Д.О., Шуба М.Ф. d-тубокураринчутливий компонент кальційзалежного калієвого струму в міоцитах taenia coli морської свинки // Нейрофізіологія/Neurophysiology - 2005. - Т.37, № 3, - С. 271-276. (Всі електрофізіологічні дослідження, обробка експериментального матеріалу та написання статті виконано особисто автором).

3. Несін В.В., Кришталь Д.О., Шуба М.Ф. Характеристики паксилінчутливого кальційзалежного калієвого струму ізольованих міоцитів кишечнику, Нейрофізіологія/Neurophysiology - 2007. - Т.39, № 3, - С. 201-207. (Всі електрофізіологічні дослідження, обробка експериментального матеріалу та написання статті виконано особисто автором).

4. Кришталь Д.О., Несін В.В., Шуба М.Ф. Модуляція калієвого струму А-типу в гладенькомязових клітинах vas deferens щура кальцій/кальмодулінзалежною протеїнкіназою ІІ // Нейрофизиология/Neurophysiology. - 2007. - Т.39, № 4/5, - С. 419-422. (Приймав участь у обробці експериментального матеріалу, узагальненні та обговоренні результатів досліджень).

5. Кришталь Д.О., Несін В.В., Шуба М.Ф. Дія паксиліну на кальційзалежний калієвий струм в ізольованих гладенькомязових клітинах сімявивідних протоків щура // Фізіологічний журнал. - 2007. - Т. 53, № 5, - С. 67-74. (Автор приймав участь у обробці експериментального матеріалу та написанні статті).

Тези доповідей

1. Nessin V.V. Purenergic activation of the spontaneous transient outward current in the guinea pig taenia coli // Abstract book of IBRO Advanced School of Neuroscience “Receptor, Channels, Messengers”, Yalta, September 16-28, 2004.

2. Несін В.В. Властивості спонтанних вихідних струмів, викликаних пуринергічною активацією міоцитів кишечнику морської свинки // Матеріали міжнародної конференції “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”, приуроченої до 80-ліття з дня народження проф. І.В.Шостакової. - С. 55. Львів, 7-9 жовтня 2004.

3. Несін В.В., Кришталь Д.О., Шуба М.Ф. Властивості катіонного струму активованого АТФ у міоцитах кишечнику морської свинки // Матеріали І Української наукової конференції “Проблеми біологічної і медичної фізики ” - С. 124. Харків, 20-22 вересня 2004.

4. Несін В.В. Вплив d-тубокурарину на кальційзалежний калієвий струм в ізольованих гладенькомязових клітинах кишечнику // Матеріали міжнародної наукової конференції “Механізми функціонування фізіологічних систем”, приуроченої до 60-ліття новоствореної кафедри фізіології людини і тварин Львівського університету ім. Івана Франка. - С. 107. Львів, 8-11 листопада 2006.

5. Несін В.В. Властивості паксилінчутливої компоненти кальційзалежного калієвого струму ізольованих гладенькомязових клітинах кишечнику // Матеріали 4-го зїзду Українського біофізичного товариства - С. 79. Донецьк, 19-21 грудня 2006.