Порівняльний аналіз впливу інгібіторів аніонного транспорту на динаміку трансформації еритроцитів людини, щура і півня в неелектролітному середовищі. Чутливість еритроцитів різних видів до трансформації, викликаної зміною електролітного складу середовища.
Аннотация к работе
Відомо, що еритроцити, циркулюючі в руслі крові, мають форму двоввігнутих дисків, яка є оптимальною з погляду виконання еритроцитами своєї головної функції - транспорту і постачання тканин організму киснем. Проте, той факт, що інгібітори аніонного транспорту змінюють конформацію білка смуги 3 і приводять до ехіноцитозу еритроцитів, свідчить на користь того, що зміна форми клітин і транспортні процеси можуть бути звязані між собою. Структурною компонентою механізму зміни форми є мембранний цитоскелет, що формує різні морфологічні типи клітин, тоді як функціональними є спрямовані в клітину і з клітини потоки аніонів, регульовані білком смуги 3 (Wong, 1999). Для порівняльного аналізу взаємозвязку між процесами іонного транспорту і зміною форми еритроцитів є доцільним проведення досліджень, для яких можуть бути залучені еритроцити різних видів тварин. У звязку з викладеним, важливого значення набуває питання, що стосується регуляції форми еритроцитів в умовах зміни іонної сили середовища, коли в мембрані активуються транспортні механізми, які є неактивними в нормальних фізіологічних умовах (Kaestner et al., 2000).Для вивчення динаміки змін форми еритроцитів у часі після різних дій використовували розроблений і виготовлений в ІПКІК НАН України двоканальний формометр-агрегометр ФА-01, який, разом з виміром оптичної щільності (ОЩ) або світло пропускання, вимірює флуктуації інтенсивності світлового потоку, які несуть інформацію про форму клітин (Руденко та ін., 1998; Руденко, 2006). Для зміни форми еритроцитів в кювету додавали від 5 до 100 мкл концентрованих розчинів досліджуваних речовин до заданої кінцевої концентрації і реєстрували зміни ОЩ або ІФ в часі. Для дослідження транспорту Н в сахарозному середовищі методом РН-метрії еритроцити людини двічі відмивали безбуферним розчином 0,15 М NACL за стандартною методикою і 50 мкл еритромаси вносили до 2 мл розчину сахарози (0,3 М) (кінцевий гематокрит 2%), що містить та не містить необхідну концентрацію інгібіторів аніонного транспорту або інших реагентів, і далі реєстрували зміну РН розчину в часі. Для обчислення констант швидкості транспорту ФЛ в еритроцити будували графік в координатах ln((F100%-Ft)/F100%) від часу, де F100% - інтенсивність флюоресценції після повного розподілу субстрату між клітинами і середовищем, Ft - інтенсивність флюоресценції в певний момент часу. Для визначення вихідного транспорту ФЛ з еритроцитів, клітини (гематокрит 2%) заздалегідь навантажували ФЛ шляхом інкубації їх в розчині ФЛ відповідної концентрації протягом 1 години при 25ЄС, відмивали в холодному середовищі, потім переносили в чисте середовище та інкубували 0, 5, 10, 20, 45 хвилин.У роботі досліджено вплив модифікаторів форми еритроцитів різної природи, що включають інгібітори аніонного транспорту і деякі детергенти на морфотрансформацію еритроцитів людини, щура і півня, а також взаємозвязок між активацією транспортних процесів і зміною форми еритроцитів при експозиції клітин в ізотонічному сахарозному середовищі. Введення еритроцитів в ізотонічне середовище сахарози з низьким вмістом іонів хлору призводить до трифазної послідовності змін форми клітин (морфологічній відповіді, МВ), яка складається із швидкої сферуляції (фаза 1), відновленню форми близькою до дискоїдної (фаза 2) і повторної сферуляції (фаза 3). Фази МВ еритроцитів залежать від іонної сили середовища та його складу, при цьому трифазна структура МВ еритроцитів зникає при збільшенні вмісту хлоридів в середовищі до рівня 15-20 ММ.
План
Основний зміст роботи
Вывод
У роботі досліджено вплив модифікаторів форми еритроцитів різної природи, що включають інгібітори аніонного транспорту і деякі детергенти на морфотрансформацію еритроцитів людини, щура і півня, а також взаємозвязок між активацією транспортних процесів і зміною форми еритроцитів при експозиції клітин в ізотонічному сахарозному середовищі.
1. Введення еритроцитів в ізотонічне середовище сахарози з низьким вмістом іонів хлору призводить до трифазної послідовності змін форми клітин (морфологічній відповіді, МВ), яка складається із швидкої сферуляції (фаза 1), відновленню форми близькою до дискоїдної (фаза 2) і повторної сферуляції (фаза 3).
2. МВ концентраційно-залежним чином залежить від наявності в сахарозному середовищі модифікаторів форми еритроцитів эхіноцитарного (DIDS, SITS, DNDS, СТАВ, SDS) або стоматоцитарного (CPR, альбумін) типів дії. При збільшенні концентрації всіх модифікаторів, окрім SDS, спостерігається стабілізація фази 1 або інгібування фази 2 МВ.
3. Фази МВ еритроцитів залежать від іонної сили середовища та його складу, при цьому трифазна структура МВ еритроцитів зникає при збільшенні вмісту хлоридів в середовищі до рівня 15-20 ММ.
4. Вплив модифікатів на формування МВ еритроцитів залежить від їх типу, концентрації та моменту початку дії щодо трифазної послідовності трансформації клітин, що розвиваються.
5. Для еритроцитів щура МВ як за наявністю, так і за відсутністю модифікатів розвивається у напрямку інвагінованих, стоматоцитарних форм, що розрізняються за ступенем сферичності, тоді як в разі еритроцитів людини під впливом SDS та альбуміну відбувається формування ехиноцитів.
6. Еритроцити півня в сахарозному середовищі трансформувалися в стоматоцити, а при наявності модифікаторів практично зберігали свою дискоїдну еліптичну форму та високе значення індексу форми. Поряд зі вказаними відмінностями в МВ еритроцитів людини і щура ці дані вказують на видоспецифічність морфологічної реакції цих клітин в сахарозному середовищі.
7. Вивчення транспорту флюоресцеїну в еритроцитах людини показало, що він транспортується в клітини шляхом простої дифузії через ліпідний бишар мембрани і розподіляється, практично у відповідності з трансмембранним потенціалом. Останнє дозволяє використовувати флюоресцеїн як маркер для оцінки значення розміру трансмембранного потенціалу еритроцитів при зміні іонного складу середовища.
Список литературы
1. Алмазова Е.Б., Мохамад Хани Румиех, Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Влияние температуры на транспорт протонов в эритроцитах, нагруженных сульфатом // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Біофізичний Вісник. 2000. №497, Вип. 2(7). С. 47-51. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).
2. Олейник О.А., Мохамад Хани Румиех, Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Распределение флуоресцеина между эритроцитами и внеклеточной средой в условиях, моделирующих изменение мембранного потенцала // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Біофізичний Вісник. 2001. №525, Вип. 1(8). С. 50-53. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).
3. Олейник О.А., Мохамад Хани Румиех, Рамазанов В.В., Бондаренко В.А. Влияние температуры и модификаторов мембраны на транспорт флуоресцеина в эритроцитах // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Серія: біологія. 2006. №729, Вип. 3. С. 260-264. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).
4. Руденко С.В., Мохамад Хани Румиех, Бондаренко В.А. Морфологическая реакция эритроцитов на изменение электролитного состава среды. I. Влияние альбумина // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. Серія: біологія. 2007. №768, Вип. 5. С. 150-156. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).
5. Руденко С.В., Мохамад Хани Румиех, Бондаренко В.А. Морфологическая реакция эритроцитов на изменение электролитного состава среды. II. Влияние ингибиторов анионного транспорта // Біофізичний вісник. 2007. Вип. 1 (18). С. 53-60. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).
6. Руденко С.В., Мохамад Хани Румиех. Видовая специфичность морфологических изменений эритроцитов в сахарозных средах // Біофізичний вісник. 2007. Вип. 2 (19). С. 68-75. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).
7. Бондаренко В.А., Мохамад Хани Румиех, Рамазанов В.В., Алмазов Е.Б. Транспорт протонов в эритроцитах, нагруженных сульфатом при температуре и осмотическом давлении // Тезисы докладов Всеукраинской научной конференции “Успехи и перспективы развития криобиологии и криомедицины”. Харьков, 2000. С.12. (Дисертантом виконано експериментальну частину, проведено статистичний аналіз, зроблено літературний огляд).
8. Руденко С.В., Мохамад Хани Румиех. Вплив модифікаторів на динаміку зміни форми еритроцитів людини, щура і півня в сахарозному середовищі // Тези доповідей 2-го зїзду Українського товариства клітинної біології. Київ, 2007. С. 86.
9. Руденко С.В., Мохамад Хани Румиех. Ингибиторы анионного транспорта блокируют морфологическую реакцию эритроцитов на изменение электролитного состава среды // Тезисы докладов научно-практической конференции “Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине”. Ростов-на-Дону, 2007. C. 37.