Дослідження впливу фізико-хімічних факторів кріоконсервування на морфофункціональні показники клітин кісткового мозку тварин з АІЗ. Життєздатність і морфофункціональний потенціал клітин кісткового мозку тварин з АА і ЕАЕ після експозиції кріопротекторами.
Аннотация к работе
Встановлений останнім часом факт причетності дефекту стовбурових кровотворних попередників до розвитку жорстких аутоімунних захворювань (АІЗ), які не піддаються традиційним методам лікування, став поштовхом для проведення такої “реконструктивної” терапії, як трансплантація кісткового мозку (КМ), клітин ембріональної печінки, ізольованих стовбурових гемопоетичних клітин та ін. Для реалізації програм лікування АІЗ за допомогою трансплантації кровотворних клітин необхідно створити їхні запаси і надійні способи довгострокового збереження з застосуванням оптимальних технологій кріоконсервування. Відзначається, що головними факторами ушкодження клітин у процесі їх кріоконсервування є сольові і температурні градієнти, зміна РН середовища, механічний вплив кристалів льоду та ін. На прикладі гемопоетичних клітин показано, що різні за ступенем диференціювання кровотворні попередники виявляють різну чутливість до однакових умов кріоконсервування, а різні режими кріоконсервування по-різному впливають на ті самі властивості клітин [Гольцев А.Н., 1988; Goltsev Крім того, отримано результати, що підтверджують можливість використання кріоконсервування як способу модифікації морфофункціонального статусу кровотворних клітин [Луценко Е.Д. и др., 1995; GoltsevДослідження були виконані на білих 5-6 - місячних щурах-самцях масою 160-180 г (116 тварин) і статевозрілих мишах-самцях лінії СВА масою 19-22 г (120 тварин), що утримувалися в стандартних умовах віварію Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України. Стан лімфогемпоетичної системи (ЛГПС) тварин оцінювали на 7, 14, 21 і 28-у добу після індукції патології з використанням гематологічних, імунологічних, біохімічних, морфологічних, гістологічних методів і культивування клітин КМ у системах in vitro та in vivo. До і після кріоконсервування оцінювали: життєздатність клітин КМ методом суправітального фарбування 0,2%-м розчином трипанового синього [Костенко Е.А., 1968]; якісний склад ядровмісних клітин на мазках, пофарбованих азур-II-еозином; адгезивну здатність клітин КМ [Пастер Е.У и др., 1989]; фагоцитарну активність (фагоцитарний індекс (ФІ) - відсоток клітин, які фагоцитували; фагоцитарне число (ФЧ) - число захоплених однією клітиною мікроорганізмів; абсолютний показник фагоцитарної активності мієлокаріоцитів - АПФАМ, що визначався за формулою: АПФАМ=ФИХФЧХ(абс. кількість кл/мкл суспензії х106)) [Александров М.Г., 1988]. З метою обєктивізації отриманих даних щодо стану КМ тварин з АІЗ до і після кріоконсервування було використано індекс сумарного ступеня відхилення (ССВ) [Пат. У той же час при розвитку ЕАЕ зміна вмісту ПК мала хвилеподібний характер: зниження на 7-у добу; зростання до 14-ї доби і тенденція до зниження в період 21-28-ї діб у порівнянні з контролем.Встановлено виражені відмінності в порівнянні з контролем морфофункціональних характеристик клітин КМ тварин з АІЗ, в тому числі статусу стовбурових кровотворних попередників різного рівня диференціювання, який виявляється в зміні їхної здатності формувати гемопоетичні структури в умовах in vitro та in vivo. Оцінка морфофункційного стану клітин КМ тварин з АІЗ продемонструвала відмінності відповіді на окремі фізико-хімічні чинники кріоконсервування в порівнянні з контрольним КМ. Зазначено, що клітини КМ, особливо тварин з ЕАЕ (при оцінці життєздатності і адгезивних властивостей), більш чутливі до дії гіперосмолярних розчинів у порівнянні з контролем. У той же час „оптимальними” відносно забезпечення функціонального потенціалу цих клітин КМ виявилися різні умови кріоконсервування: для КМ тварин з АА - режим 3 (10%-й ДМСО), з ЕАЕ - режим 1 (7%-й ДМСО), для здорових - режим 1 (10%-й ДМСО). Певні режими кріоконсервування реалізують у КМ тварин з АА ефект „реставрації” функції КУОС не тільки підвищуючи їхній функціональний потенціал, але і гармонізуючи співвідношення різних субпопуляцій.
План
2. Основний зміст роботи
Вывод
Аутотрансплантація КМ як важливий складовий компонент лікування АІЗ визначає необхідність оптимізації методів його кріоконсервування. Проведені в дисертаційній роботі дослідження акцентують увагу на істотній важливості початкового стану цього біообєкту у визначенні його кріолабільності і кріостабільності. Отримані дані чітко демонструють як різноспрямовані зміни морфофункціонального потенціалу КМ здорових тварин і з АІЗ в однакових умовах кріоконсервування, так і збіг характеру такого роду змін при використанні різних режимів.
1. Встановлено виражені відмінності в порівнянні з контролем морфофункціональних характеристик клітин КМ тварин з АІЗ, в тому числі статусу стовбурових кровотворних попередників різного рівня диференціювання, який виявляється в зміні їхної здатності формувати гемопоетичні структури в умовах in vitro та in vivo.
2. Оцінка морфофункційного стану клітин КМ тварин з АІЗ продемонструвала відмінності відповіді на окремі фізико-хімічні чинники кріоконсервування в порівнянні з контрольним КМ. Зазначено, що клітини КМ, особливо тварин з ЕАЕ (при оцінці життєздатності і адгезивних властивостей), більш чутливі до дії гіперосмолярних розчинів у порівнянні з контролем. Поряд з цим клітини КМ тварин з ЕАЕ більш стійкі до лужних РН, тоді як з АА - до кислих.
3. Порівняльний аналіз ступеня відхилення характеристик морфофункціонального стану клітин КМ на етапі їх експозиції з ДМСО і гліцерином довів перевагу ДМСО як потенційного кріопротектора для низькотемпературного консервування КМ тварин із АІЗ.
4. Відзначена різноспрямована відповідь клітин КМ тварин із різними АІЗ на реалізацію однотипних режимів кріоконсервування. Так, заморожування зі швидкістю 1 і 40°С/хв індукує підвищену експресію молекул адгезії на клітинах КМ при ЕАЕ і інгібує - при АА.
5. Доведено, що ідентичні умови кріоконсервування КМ здорових тварин і з АІЗ забезпечували не тільки різну збереженність кровотворних попередників, що реалізують функціональний потенціал in vitro та in vivo, але й перерозподіл у цих компартментах попередників з різним ступенем комітованості. У той же час „оптимальними” відносно забезпечення функціонального потенціалу цих клітин КМ виявилися різні умови кріоконсервування: для КМ тварин з АА - режим 3 (10%-й ДМСО), з ЕАЕ - режим 1 (7%-й ДМСО), для здорових - режим 1 (10%-й ДМСО).
6. Певні режими кріоконсервування реалізують у КМ тварин з АА ефект „реставрації” функції КУОС не тільки підвищуючи їхній функціональний потенціал, але і гармонізуючи співвідношення різних субпопуляцій. Крім того, для КМ тварин з АА всі режими кріоконсервування виявляли ефект стимуляції функції кровотворних попередників КУОС-8 (більш диференційованих) на тлі інгібіції КУОС-14 (менш диференційованих).
7. Варіювання швидкостями охолодження і концентрацією кріопротектора дозволяє спрямовано забезпечувати в КМ більший або менший ступінь збереження кожної із субпопуляцій кровотворних попередників. Загалом швидкісне заморожування КМ здорових тварин і з АІЗ (з будь-якими концентраціями кріопротектору) призводило до реалізації „супресивної” дії кріоконсервування у відношенні більш потентних попередників як серед КУО-ГМ, так і КУОС, що може бути використано в тій або іншій клінічній ситуації.
Перелік опублікованих праць
1. Гольцев А.Н., Козлова Ю.А. Аутоиммунная патология как предрасполагающий фактор изменения криочувствительности клеток лимфогемопоэтической системы // Пробл. криобиологии. - 2003. - № 3. - С. 62-70.
2. Козлова Ю.А., Гольцев А.Н., Останков М.В. Влияние изолированных физико-химических факторов криоконсервирования на клетки костного мозга с различным исходным структурно-функциональным статусом // Пробл. криобиологии. - 2003. - № 4. - С. 3-11.
3. Гольцев А.М., Козлова Ю.О., Дубрава Т.Г., Гуріна Т.М., Ямпольська К.Є. Вміст КУО-ГМ в кріоконсервованому кістковому мозку тварин з аутоімунними захворюваннями // Клінічна та експериментальна патологія. - 2004. - Т. 3, № 2. - С. 392-393.
4. Козлова Ю.А., Гольцев А.Н., Дубрава Т.Г., Гурина Т.М. Предпосылки оптимизации метода криоконсервирования костного мозга животных с аутоиммунной патологией // Пробл. криобиологии. - 2004. - № 2. - С. 76-83.
5. Козлова Ю.А., Дубрава Т.Г., Гольцев А.Н. Некоторые характеристики структурной организации и функционального потенциала клеток костного мозга при аутоиммунных патологиях // Пробл. мед. науки та освіти. - 2004. - № 3. - С. 48-50.
6. Гольцев А.Н., Козлова Ю.А., Бабенко Н.Н., Овсянников С.Е., Никитченко Ю.В. Интенсивность метаболических процессов организма крыс в динамике развития экспериментального аллергического энцефаломиелита // Медична хімія. - 2004. - Т. 6, № 3. - С. 117-119.
8. Гольцев А.Н., Козлова Ю.А., Останков М.В., Дубрава Т.Г., Луценко Е.Д. Через понимание особенностей влияния физико-химических факторов криоконсервирования на клетки костного мозга с различным исходным структурно-функциональным статусом к повышению эффективности их использования // Збірник тез III Міжнародної науково-практичної конференції „Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія”. - Харків, 2003. - С. 253.
9. Гольцев А.Н., Козлова Ю.А., Останков М.В., Бабенко Н.Н. Изменение функциональных характеристик клеток костного мозга животных с аутоиммунными заболеваниями под действием изолированных факторов криоконсервирования // Збірник наукових праць „Сучасні аспекти репродуктології, перинатальної медицини та кріобіології”. - Харків, 2003. - С. 19-23.
10. Kozlova Yu.A. Change in structural and functional organization of bone marrow cells under development of autoimmune diseases as a probable factor of their cryosensitivity modificatation // Abstract book of conference for young scientists, PHD students and students on molecular biology and genetics „50 years of the double helix of the DNA and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine”. - Kyiv, 2003. - P. 169.
11. Kozlova Yu.A., Dubrava T.G., Babenko N.N., Ostankov M.V., Lutsenko E.D., Goltsev A.N. Effect of PH on the structural and functional properties of normal rat myelokaryocytes and during autoimmune pathology // Cryobiology. - 2003. - Vol. 47, № 3, - P. 282.
12. Goltsev A.N., Dubrava T.G., Kozlova Yu.A., Ostankov M.V., Goltsev K.A., Kurov A.M. Cryostability of various bone marrow cell populations during adjuvant arthritis // Abstracts book „World congress of cryobiology and cryomedicine (CRYO-2004)”.- Beijing, 2004. - P. 154.
13. Козлова Ю.А., Гольцев А.Н., Луценко Е.Д., Дубрава Т.Г. Влияние различных режимов криоконсервирования на сохранность кроветворных клеток костного мозга животных с адъювантным артритом // Сборник материалов VIII Международной научной экологической конференции „Актуальные проблемы сохранения устойчивости живых систем.”- Белгород, 2004. - С. 89-90.
14. Козлова Ю.А., Бабенко Н.Н., Овсянников С.Е., Гольцев А.Н. Свободнорадикальное окисление липидов при экспериментальном аллергическом энцефаломиелите до и после введения продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса // Збірник тез I Української наукової конференції „Проблеми медичної і біологічної фізики”. - Харків, 2004.- С. 120.