Дослiдження молекулярно-генетичного полiморфiзму серед 35 представникiв роду Helianthus. Проведення RAPD-аналiзу та розподiлу 30 iнбредних лiнiй соняшника згiдно ступеню генетичної спорiдненостi та вивчення характеру успадкування RAPD-фрагментiв.
Аннотация к работе
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту Молекулярної біології і генетики НАН України Селекція на високий гетерозис, а також необхідність використання дикорослих видів для поліпшення генофонду культурного соняшника, потребує застосування эфективних методів оцінки генетичного потенціалу цієї культури. Дослідження поліморфізму довільно ампліфікованої ДНК (RAPD) дозволяє отримати характеристику генетичного різноманіття як основи для філогенетичних побудов, відбиття звязків спорідненості серед генотипів селекційного матеріалу, пошуку звязку між молекулярними маркерами та конкретними ознаками, що цікавлять селекціонера. Безпосередніми завданнями роботи були: - дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму серед 35представників роду Helianthus та отримання дендрограми, що відображає філогенетичні взаємовідносини між ними; Особистий внесок здобувача . полягає в дослідженні поліморфізму ампліфікованої ДНК дикорослих видів та культурних форм соняшника, в проведенні аналізу придатності RAPD-технології для диференціації вивчаємих генотипів, для відображення взаємовідносин спорідненості на між-та внутрішньовидовому рівнях, в зясуванні характеру успадкування RAPD-фрагментів у соняшника, в оцінці характеру взаємозвязку між ДНК-різноманіттям та селекційними показниками.За цими даними для вивчення міжвидового різноманіття у Helianthus використали 5 праймерів, виявляючих 25 - 37% поліморфізму внутри виду. Для добору праймерів, що дозволяють вивчати поліморфізм інбредних ліній соняшника, проводили ПЛР з ДНК 8-10 індивідуальних рослин кожної лінії. Кількість різноманітних за молекулярною масою смуг залежно від праймера складала від 12 до 20 (для видів) та від 12 до 21 (для ліній). За даними RAPD-аналізу, порівнюючі ПЛР-профілі різних видів та ліній, визначили генетичні дистанції (D) між ними. Розмах генетичних дистанцій для видів склав від D=0,158 (між H.praecox rungoni та H.praecox hithus) до D=0,773 (між H.praecox praecox та H.rigidus); для інбредних ліній : від D=0,0152 (між лініями 6237 та 6085) до D=0,0426 (між лініями 2281 та 16В).Дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму соняшника на між-та внутришньовидовому рівнях за допомогою аналізу продуктів полімеразної ланцюгової реакції з довільними праймерами дало можливість зробити наступні висновки : 1. Розроблені умови i підібрані праймери, що дозволяють диференціювати генотипи соняшника i видів роду Helianthus. Вид H.rigidus (секція Divaricati), класифікований морфологами як представник серії Atrorubentes, за даними аналізу поліморфізма ДНК виявляє найбільшу генетичну спорідненість з видами серії Corona-Solis.
Вывод
1. RAPD-аналіз соняшника на між- та внутрішньовидовому рівнях.
При дослідженні представників дикорослих Helianthus не було виявлено праймерів, що не познаходжували б внутришньовидового поліморфізму. Різниця у спектрах ампліфікації становила від 25 до 65%. За цими даними для вивчення міжвидового різноманіття у Helianthus використали 5 праймерів, виявляючих 25 - 37% поліморфізму внутри виду.
Для добору праймерів, що дозволяють вивчати поліморфізм інбредних ліній соняшника, проводили ПЛР з ДНК 8-10 індивідуальних рослин кожної лінії. 11 мономорфних для кожної лінії праймерів в подальшому виявили 50 - 74% міжлінейний поліморфізм.
Продукти ПЛР уявляли собою фрагменти ампліфікації розміром 400-1400 пн. Кількість різноманітних за молекулярною масою смуг залежно від праймера складала від 12 до 20 (для видів) та від 12 до 21 (для ліній). Взагалі знайдено 82 RAPD-локуса у дикунів (усі поліморфні) та 194 (серед них 124 поліморфних) - у культурного соняшника. Рівень поліморфізму відповідно склав 100 та 64%.
За даними Gentzbittel et al. (1992), які вивчали RFLP у роді Helianthus L., ступінь міжвидової різниці досягала 0,73.
Серед різних наборів ліній соняшника за допомогою RFLP Gentzbittel et al.(1994) та Zhang et al.(1995) виявляли 35 i 60% поліморфізму відповідно. Таким чином, треба відзначити значно більший потенціал RAPD-аналізу для отримання можливих маркерів.
Виявлені в результаті аналізу поліморфізма довільно ампліфікованої ДНК RAPD-локуси розподілили за частотою появи у досліджуваних генотипів на групи. У вивчених видів Helianthus найбільша кількість RAPD-локусів зявляється з частотою 0,4 та 0,5 (по 21% від загального числа), тоді як для самозапилених ліній більш характерні неполіморфні RAPD-локуси (35%).
Відзначена наявність видоспецифічних (Р28, Р55) праймерів та праймерів, більш відповідних для диференціації інбредних ліній (Р37).
Порівняння ампліфікаційних спектрів представників різних геномів дозволяє отримати кількісну оцінку їх дівергенції. За даними RAPD-аналізу, порівнюючі ПЛР-профілі різних видів та ліній, визначили генетичні дистанції (D) між ними. Значення міжлінейних D, у середньому, на порядок нижче, ніж міжвидових. Розмах генетичних дистанцій для видів склав від D=0,158 (між H.praecox rungoni та H.praecox hithus) до D=0,773 (між H.praecox praecox та H.rigidus); для інбредних ліній : від D=0,0152 (між лініями 6237 та 6085) до D=0,0426 (між лініями 2281 та 16В).
2. Аналіз успадкування RAPD-маркерів у F1 гібридів соняшника.
Для визначення можливості використання аналізу поліморфізма довжини ампліфікованих фрагментів ДНК для ідентифікації інбредних батьків простих гібридів соняшнику проводили тестування F1 гібридів та оцінювали, наскільки успадкування ампліконів відповідає простому менделівському. Використано три батьківські лінії (1036, 3369, 1750) та два гібрида від схрещувань 1036х3369 та 1750х3369. Взагалі досліджено 185 RAPD-локусів.
У більшості випадків ДНК-профіль гібрида вміщував суму фрагментів, що характерні для обох батьків. 94,4% RAPD-маркерів успадковувались за домінант-рецесивним типом. У 3% відзначена відсутність батьківського фрагменту у гібрида, а у 2,6% - поява нехарактерного для спектру батьків фрагмента ампліфікації.
Ряд авторів [Davis,1995; Heun,1993; Halden,1995] для зясування варіантів успадкування ПЛР-фрагментів пропонують проводити змішування батьківських ДНК-матриць. При порівнянні ампліфікаційних профілів ДНК інбредних ліній, ДНК відповідного їм гібрида та суміші 1:1 ДНК батьків даного гібрида поява нових смуг у спектрі гібрида не спостерігалась. У гібрида 1036х3369 був відсутнім ампліфікований фрагмент, характерний для лінії 3369 та суміші ДНК батьківських форм.
Зроблено висновок, що успадкування продуктів ампліфікації з довільними праймерами у більшості випадків відбувається згідно менделевським правилам за домінант-рецесивним типом. Наявність відхилень від такого успадкування не дає змоги вважати використання аналізу поліморфізма довільно ампліфікованої ДНК для ідентифікації інбредних батьків простих гібридів соняшника оптимальним.
3. Філогенетичні взаємовідносини між досліджуваними видами Helianthus L.
На базі RAPD-аналізу та оцінки генетичних дистанцій між досліджуваними видами отримана кладограма, що відбиває генетичну спорідненість 35 дикорослих видів Helianthus, Simsia foetida, Titonia speciosa, а також культурних представників H.annuus (мал.1).
На побудованій схемі виділяються декілька кластерів. При порівнянні з класифікацією роду за морфологічними ознаками [Schilling, Heiser,1981], можна визначити, загальну тенденцію сумісного угрупування представників певних таксономічних одиниць. Визначені окремі кластери з видами серії Corona-Solis ( ) та Helianthus ( ). Представники H.annuus - селекційні лінії 2В, OD20, 1036, 3369 - зібрані в групу, що є часткою великого субкластеру, до якого уходять усі види секції Helianthus.
Генетична дистанція між підвидами H.praecox rungonii та H.praecox hithus (D=0,074) не перевищує такову між лініями культурного соняшнику.
За даними Schilling, Heiser (1981) група видів серії Microcephali найбільш близька до представників серії Corona-Solis. За нашим дослідженням H.laevigatus та H.microcephalus також показують генетичну близькість до таких видів Corona-Solis як H.californicus, H.giganteus.
H.rigidus класифікується морфологами як представник секції Divaricati серії Atrorubentes. У Gentzbittel et al.(1992) за ПДРФ-даними цей вид входить до однієї групи з видами Corona-Solis. За результатами ПЛР-аналізу показана близькість H.rigidus до серії Corona-Solis, а саме до H.decapetalus, H.strumosus, H.hirsutus.
Найменьші генетичні дистанції між H.annuus та H.laetiflorus, H.salicifolius, H.bolanderi, H.petiolaris, H.tuberosus дозволяють визнавати їх найбільш імовірними донорами корисних агрономічних ознак при поліпшенні культурного соняшника. Більше за інших генетично віддалені від H.annuus taki види як H.multiflorus, H.rigidus, Simsia foetida, схрещування з якими H.annuus повинно індукувати чоловічу цитоплазматичну стерильність.
Ряд узятих до дослідження видів (H.macrophillus, H.laetiflorus, H.pauciflorus, H.scaberimus, H.multiflorus, H.trachelifolius) не наведений у морфологічній класифікації. Це повязано з тим, що кількість видів, відносимих до роду Helianthus, зазнавала значних змін, більшість видів є видами-синонімами. У звязку з цим вважалось доцільним зясувати генетичні взаємовідносини таких видів, що є у колекціях та залучаються селекціонерами до віддаленої гібридізації з культурним соняшником, з іншими представниками Helianthus.
В результаті нашої роботи можна відзначити, що H.macrophillus, H.scaberimus, H.multiflorus та H.trachelifolius виявляють максимальну генетичну близькість до H.decapetalus, H.hirsutus, H.strumosus, H.californicus, що дозволяє віднести їх до серії Corona-Solis. Види H.laetiflorus та H.pauciflorus, у звязку з їх мінімальним віддаленням від H.rigidus, можуть розглядатися як представники серії Atrorubentes.
4. Класифікація селекційного матеріалу згідно ступеня генетичної спорідненності.
Для зясування характера генетичних взаємовідносин у вивчаємому селекційному матеріалі за допомогою кластерного аналізу генетичних дистанцій отримана дендрограма, що відбиває спорідненість інбредних ліній соняшника (мал.2).
На отриманій схемі лінії утворили два основних кластера. Один з них залучає лінії-відновники фертильності, що використуються як батьківські форми гібридів. До другого кластеру увійшли материнські лінії. Виключенням є лінії 67 та 13В.
Схеми, що відображають взаємозвязки в даному селекційному матеріалі, були побудовані в результаті обрахування різних довільно узятих наборів ПЛР-даних : по 5, 8, 10, 11 праймерам, що відповідає 60, 96, 117 та 125 поліморфним RAPD-локусам. Два основних кластера, що диференцюють материнські та батьківські форми, можна виділити вже при аналізі даних по 60 варіабельним локусам (48,2% інформативних поліморфних фрагментів ампліфікації). Це говорить о високій дискримінаційній здібності метода класифікації ліній на базі аналізу поліморфізма ДНК.
Одним з показників обєктивності отриманих дендрограм є їх відповідність що до інформації о родоводі. Дендрограма, відбиваюча спорідненість між материнськими формами (мал.3), в цілому згідна з їх педігрі. Група ліній (2281, 6121, 6237, 6085), створена на базі лінії 3369, складає один субкластер. Лінія 1036, що є основою ліній 6253 та 2593, також поєднана з ними до однієї підгрупи. Лінії 2071 та 6071, виділені в різні роки з гібриду 1036х3369, значно віддалені одна від одної, та не входять ні до одного з субкластерів.
Використання ПЛР з довільними праймерами дозволило у даній роботі проаналізувати достатньо велику кількість селекційного матеріалу та виявити високий поліморфізм серед інбредних ліній соняшника на рівні ДНК; чітко розподілити їх на пули батьківських та материнських форм; вірогідно відбити інформацію о родоводі інбредів. Знання генетичної спорідненості ліній уявляється корисним для генетико-селекційних досліджень.
5. Аналіз звязку між молекулярно-генетичними маркерами та показниками гібридів.
Генетичні дистанції між лініями, визначені на основі обчислення 194 RAPD-локусів, розглядали як міру генетичного різноманіття серед вихідних батьківських генотипів. Згідно даних різних дослідників, кореляції між такими параметрами як генетичні дистанції та врожайність значно варюють. Lee et al.(1989) знайшов кореляцію r=0,74 між показниками специфічної комбінаційної здібності та генетичними дистанціями за ПДРФ-даними у кукурудзи. В роботі Melchinger et al.(1990) аналогічний показник був значно меншим : r=0,39.
У 1996р. на полях СГІ (с.Дачне, Одеська обл.) було проведено схрещування під ізоляторами за системою топкроса та отримане насіння 36 гібридів з різним рівнем генетичних дистанцій між батьківськими лініями, залучаючи близько-, средньоспоріднені та найбільш віддалені. Середня врожайність батьківських ліній по насінню - 10ц/га, по олії - 4,2ц/га, олійність - 46,4%, що складає по відношенню до національного стандарту України (стандарт 249) відповідно 47,6%, 45,2% та 92,2%. Мінімальні середні показники за усіма розглядаємими ознаками (врожайність насіння, врожайність олії, олійність, гетерозис за врожайністю насіння та олії, гетерозис за олійністю) спостерігали у гібридів I групи (генетичні дистанції між батьківськими лініями 0,0152<D<0,0250), максимальні - у гібридів II групи (0,0250<D<0,0350), з подальшим збільшенням генетичних дистанцій (III група гібридів, 0,0350<D<0,0450) показникі декілька зменьшуються. Мінімальні значення за усіма тестуємими ознаками виявлено у гібрида 6237х6085, між батьками якого знайдена найменьша генетична дистанція (0,0152). Гетерозис, що перевищує 100%, визначено тільки в одному випадку для гібрида з I групи. Гібрид 3497х6121 показав 130% гетерозис по врожаю олії. Гібриди I групи не досягають показників національного стандарту. У 57% гібридів II групи врожайність насіння була більше ніж у стандарту на 2 - 35,7%. З III групи також 57% гібридів перевищили врожайність насіння стандарту на 2 - 30%. Половина гібридів II групи та 71% гібридів III групи відрізняються збільшеними значеннями врожаю олії у порівнянні з стандартом. Збільшення складає 35,7 - 126,2% по II групі та 7,1 - 95,2% по III групі.
Отримані дані дозволяють погодитися з думкою Frei et al.(1986), що молекулярно-генетичні дистанції можуть мати велике значення саме для вибраковки близькоспоріднених схрещувань.
Дана теза підтверджується кореляційним аналізом, результати якого надані у табл.1. Значення коефіцієнтів кореляції для даного набору інбредів у 1,8 - 2,5 рази перевищують відповідні показники, отримані для гібридів, серед яких не було представників I групи.
Щонайменші значення отримані для коефіцієнтів кореляції між генетичними дистанціями та найменш варюючими ознаками : олійністю та гетерозисом за олійністю. Значення r відрізняються залежно від розглядаємого агрономічного показника, но, в цілому, відповідають результатам інших дослідників. Кореляції між генетичним різноманіттям за молекулярними (ДНК) маркерами та показниками гібридів рису були 0,338 i 0,165 [Zhang et al.,1996], у пшениці - 0,49 i 0,47 [Perenzin et al.,1996], у кукурудзи - <0,5 [Melchinger et al.,1990], а також 0,54 i 0,53 [Вербицька, у друку].
В нашій роботі максимальне значення r=0,45 виявлено для D та показників врожайністі олії.
Розвиток молекулярного маркування локусів кількісних ознак, у тому ж числі i локусів елементів, формуючих врожай, повинен збільшити значущість та прогнозуючу здібність маркерів на основі ДНК.Дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму соняшника на між- та внутришньовидовому рівнях за допомогою аналізу продуктів полімеразної ланцюгової реакції з довільними праймерами дало можливість зробити наступні висновки : 1. Розроблені умови i підібрані праймери, що дозволяють диференціювати генотипи соняшника i видів роду Helianthus.
2. Вид H.rigidus (секція Divaricati), класифікований морфологами як представник серії Atrorubentes, за даними аналізу поліморфізма ДНК виявляє найбільшу генетичну спорідненість з видами серії Corona-Solis.
3. В результаті RAPD-аналізу визначені генетичні дистанції між культурним соняшником та його дикорослими спорідненими видами. Максимальну близькість до культивованого H.annuus на рівні ДНК показали H.laetiflorus, H.salicifolius, H.bolanderi, H.petiolaris, H.tuberosus.
4. Дослідження міжлінейного поліморфізму дозволяє диференцувати на рівні ДНК материнські та батьківські форми, що використовуються для створення гібридів.
5. Визначений домінант-рецесивний характер успадкування ампліфікованих фрагментів ДНК у соняшника.
6. Звязок між генетичними дистанціями, грунтованими на поліморфізмі ДНК, та деякими показниками гібридів соняшнику значно варюють в залежності від розглядаємого селекційного показника.
7. ДНК-поліморфізм може служити надійним критерієм для вибраковки близькоспоріднених схрещувань при створенні високопродуктивних гібридів.
Список литературы
1. Sivolap Yu.M., Solodenko А.E., Burlov V.V. Inter- and intraspecific polymorphism of sunflower revealed by RAPD-analysis // Eucarpia: Proceedings of the Symposium, Zaporozhye, 1996.-Р.262-266.
3. Кожухова Н.Э., Солоденко А.Е., Сиволап Ю.М. Наследование продуктов амплификации ДНК у F1 гибридов кукурузы и подсолнечника // Цитология и генетика.-1998.-N4.-С.26-31.
4. Солоденко А.Е. Молекулярно-генетический полиморфизм на межвидовом уровне // Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях. Научно-методическое руководство. Под ред. Сиволапа Ю.М.-Киев: Аграрна Наука, 1998.- 156с.
5. Солоденко А.Е. Внутривидовой полиморфизм подсолнечника // Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях. Научно-методическое руководство. Под ред. Сиволапа Ю.М. -Киев: Аграрна Наука, 1998.-156с.
6. Продан А.Е., Сиволап Ю.М., Бурлов В.В. Дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму соняшника та класифікація селекційного матеріалу за допомогою RAPD-аналізу // Наслідки наукових пошуків молодих вчених-аграрників в умовах реформування АПК: Тези доповідей міжнар. науково-практ. конф. мол. вчених та спец., Чабани, 1996.-С.221.
7. Солоденко А.Е., Сиволап Ю.М., Бурлов В.В. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма подсолнечника на меж- и внутривидовом уровнях // Молекулярно-генетические маркеры растений: Тез. докл. Межд. конф. 11-17 ноября 1996.-Ялта.-С.82-83.
8. А.Е.Солоденко, Ю.М.Сиволап. Использование ПЦР для дифференциации генотипов подсолнечника // Молек. генетика и биотехнол.: Тез. докл. Межд. конф. 6-8 апреля 1998.-Минск.-С.97-99.