Характеристика болезней, вызываемых РНК-содержащими вирусами. Исследование возбудителя телец включения. Изучение основных клинических признаков и патологоанатомических изменений при парамиксовирозе змей. Рассмотрение болезней с ДНК-содержащими вирусами.
Аннотация к работе
Однако, открытие в последние годы нескольких новых эмерджентных инфекций, несущих серьезную потенциальную угрозу не только искусственно созданным, но и природным популяциям рептилий и амфибий, заставляет гораздо внимательнее отнестись к вирусам, как к вероятным этиологическим агентам при инфекционных заболеваниях этих животных. К таким «новым» инфекциям можно отнести ранавироз и хитридиомикоз амфибий, распространение вируса Западного Нила в популяции мисиссипских аллигаторов в США и некоторых других видов крокодилов в иных регионах Земного шара, заболевание ящериц, содержащихся в неволе, типичным иридовирусом насекомых, спонтанное заражение сухопутных и водных черепах ранавирусом лягушек, распространение герпесвируса черепах за пределы естественного энзоотического ареала, обнаружение серопозитивных к герпесвирусу и микоплазме черепах в естественных популяциях, а в последнее время и манифестных больных, обнаружение летального внутриядерного кокцидиоза у черепах в неволе и хламидийных инфекций у европейских видов гадюк и др. По современным представлениям, в семействе Retroviridae выделяют 7 родов, при этом ретровирусы типа С рептилий пока не имеют собственного родового ранга, хотя и отличаются от вирусов С-типа млекопитающих и птиц. Вирусную РНК обнаружили у всех инфицированных змей через 18 недель с помощью ПЦР и выдели вирус в культуре у части животных после эвтаназии. Вирус выдели в культуре клеток VH-1, и затем супернатантом инокулировали клетки Vero, где вирус был выделен повторно.
Введение
Сообщения об обнаружении вирусов в тканях больных и клинически здоровых рептилий начали появляться с конца 60-х гг ХХ века. За прошедшие 40 лет вирусы были найдены у представителей всех отрядов рептилий, включая гаттерий, от которых выделили ретровирусы. К настоящему моменту от рептилий выделены представители не менее 7 семейств РНК-содержащих и не менее 6 семейств ДНК-содержащих вирусов. Возбудители, по крайней мере, 12 вирусных болезней человека и животных были инокулированы рептилиям экспериментально. При этом отмечали спектр реакций, начиная от низкотитровых, и заканчивая нормальной репликацией вируса в тканях инфицированных животных. Тем не менее, полноценных нозологических единиц, то есть четко охарактеризованных болезней вирусной этиологии, для которых уже были выполнены постулаты Коха, не так уж много. Далеко не все из них имеют серьезное значение в ветеринарии рептилий. Однако, открытие в последние годы нескольких новых эмерджентных инфекций, несущих серьезную потенциальную угрозу не только искусственно созданным, но и природным популяциям рептилий и амфибий, заставляет гораздо внимательнее отнестись к вирусам, как к вероятным этиологическим агентам при инфекционных заболеваниях этих животных. К таким «новым» инфекциям можно отнести ранавироз и хитридиомикоз амфибий, распространение вируса Западного Нила в популяции мисиссипских аллигаторов в США и некоторых других видов крокодилов в иных регионах Земного шара, заболевание ящериц, содержащихся в неволе, типичным иридовирусом насекомых, спонтанное заражение сухопутных и водных черепах ранавирусом лягушек, распространение герпесвируса черепах за пределы естественного энзоотического ареала, обнаружение серопозитивных к герпесвирусу и микоплазме черепах в естественных популяциях, а в последнее время и манифестных больных, обнаружение летального внутриядерного кокцидиоза у черепах в неволе и хламидийных инфекций у европейских видов гадюк и др.
Эти вопросы приобретают все большее значение не только при содержании рептилий в зоопарках или при использовании их как объектов зоокультуры, но особенно, при реализации программ по сохранению и реинтродукции редких видов, а также при регуляции торговли, транспортировки и установления ветеринарных норм для этой категории животных. В этом смысле ветеринарное законодательство пока остается несовершенным. Так, в нашей стране, при ввозе рептилий, проходящих по категории «прочие животные», предусмотрена только копроскопия и бактериологическое исследование на наличие сальмонелл. При этом такие серьезные заболевания, как криптоспоридиоз, гексамитиаз, амебиаз, диссеминированные микозы и подавляющее большинство вирусных инфекций остаются за рамками стандартного диагностического протокола. Предусмотренный для этих животных 30-дневный карантин, как правило, не достаточен для выявления таких болезней, как болезнь телец включения (IBD), парамиксовироз змей (OPMV), герпесвироз черепах (THV), криптоспоридиоз и некоторых других. Без использования иммунологических и молекулярных методов диагностики выявление персистентных инфекций у рептилий становится вообще очень затруднительным. Значительный прогресс в разработке таких методов был достигнут за рубежом за последние 5 лет. Это позволило выявить ряд новых вирусных нозологий и в некоторых случаях провести анализ эпизоотической ситуации и эволюции вирусных патогенов. Тем не менее, в настоящий момент новые диагностикумы не имеют широкого практического применения и остаются в арсенале лишь нескольких исследовательских лабораторий США и Европы. Вероятно в ближайшем будущем количество ветеринарных лабораторий, имеющих возможность проводить вирусологическую диагностику болезней рептилий, существенно возрастет. В этом случае в ряде стран такие исследования будут введены в стандартный протокол при получении ветеринарных сертификатов. Тогда список инфекций рептилий, требующих обязательного контроля при перемещении этих животных, заметно расширится, а для стран, не имеющих соответствующих возможностей, ужесточившиеся нормы транспортировки окажутся неприемлимыми. Все это может нанести существенный удар по существующему зооторговому рынку, в том числе, и по вполне легальному. В связи с этим основной задачей данного сообщения будет освещение современного состояния вопроса, характеристика возбудителей наиболее проблемных вирусных болезней рептилий, обсуждение принятых на сегодняшний день методов диагностики и терапии. вирус патологоанатомический парамиксовироз
1. Болезни, вызываемые РНК-содержащими вирусами
1.1 Ретровирусы
Семейство Retroviridae - большая группа вирусов, поражающих все классы позвоночных и некоторых беспозвоночных (дрозофил, ленточных гельминтов). Вирионы ретровирусов представляют собой частицы сферической формы диаметром 80-100нм. Они состоят из сердцевины, внутренней белковой мембраны и наружной липосодержащей оболочки, на поверхности которой имеются выступы длиной до 8нм. В сердцевине различают икосаэдрическую капсулу и нуклеоид. У ретровирусов типа С нуклеоид находится в центре вириона. Геном ретровирусов, в отличие от такового всех других известных вирусов, является диплоидным и представлен двумя идентичными молекулами плюс-РНК, кодирующими у большинства вирусов 4 основных гена. Характерная особенность этих вирусов - наличие в составе вирионов РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы).
По современным представлениям, в семействе Retroviridae выделяют 7 родов, при этом ретровирусы типа С рептилий пока не имеют собственного родового ранга, хотя и отличаются от вирусов С-типа млекопитающих и птиц. За исключением IBD, почти все ретровирусные изоляты у рептилий были выделены из опухолей (Jacobson, 1986). Ретровирусные частицы С-типа были обнаружены в эмбриональной рабдомиосаркоме у маисового полоза Elaphe guttata, (Clark, et al, 1979), в культивированных клетках селезенки гадюки Рассела с миксофибромой (Zeigel and Clark, 1969), у обыкновенного удава с эритролейкозом (Konstantinov, Ippen, 1982), и нескольких пятнистых жарарак Bothrops moojeni с опухолями почек (Hoge, et al, 1995). Несколько не связанных с опухолями ретровирусов было обнаружено в клеточных линиях сердца гадюки Рассела (Clark, 1973), в ядовитой железе жараракуссу и в тканях гаттерии Sphenodon punctatus (Carneiro, 1992), Ретровирусы, включая эндогенные провирусы, постоянно обнаруживают у разных видов рептилий с помощью молекулярных методов (Marschang, et al, 2006). Неклассифицированные провирусы, напоминающие ретровирусы млекопитающих С-типа, были выделены от тигрового и пестрого питонов (Huder, et al, 2002).
IBD (Inclusion Body Disease)
IBD известна уже почти 30 лет; это заболевание поражает удавов и питонов в коллекциях змей по всему миру. Заболевание характеризуется образованием крупных эозинофильных включений в цитоплазме различных клеток эпителиального типа и нейронах ЦНС (Axthelm, 1985, 1989; Schumacher, et al, 1994). При электронной микроскопии пораженных тканей выявляются вирусные частицы с морфологическими характеристиками, схожими с вирионами ретровируса рептилий С-типа. Вирус обладает обратной транскриптазной активностью. Вирус был впервые выделен группой Шумахера в 1994г. (Schumacher, et al, 1994) и этим коллективом были выполнены постулаты Коха. Однако, впоследствии оригинальный изолят был утерян. Повторно вирус был изолирован группой Якобсона (Jacobson, et al, 1996), но постулаты Коха удалось выполнить лишь частично. И в этом случае, и при инокуляции здоровым змеям других штаммов ретровирусов, выделенных впоследствии, не возникает характерных изменений в клетках, хотя наличие вирусного антигена определяется с помощью ПЦР. При этом введение суспензии зараженных тканей вызывает IBD у здоровых змей (Jacobson, et al, 2004). Интересно, что исследование ультраструктуры включений показывает, что они состоят только из белковых метаболитов, поскольку клетки не имеют дегенеративных изменений, не индуцируют воспалительную реакцию и не содержат инфекционного агента. В дальнейшем было выяснено, что тельца включений в основном состоят антигенно-уникального белка массой 68КД (Wozniak, et al, 2000). В настоящий момент предполагается, что IBD - инфекционное заболевание, вызывающее системное нарушение клеточного метаболизма, по-видимому, индуцированное ретровирусом и имеющее характерные клинические манифестации.
По данным разных авторов IBD встречается в основном у императорского удава B.constrictor imperator, других подвидов B.constrictor, кольчатого удава C.annulatus, а также у некоторых питонов, в основном, у тигровых. Этому противоречат данные Garner Raymond (2004), которые не обнаружили заболевания ни у павших питонов (N=301), ни у анаконд (N=20). В некоторых случаях при характерной клинике IBD и обнаружении ретровируса, в тканях не происходит образования характерных телец включения (Boyer, et al, 2000), в других случаях гистологически поставленный диагноз не был подтвержден результатами ТЭМ. Такие сомнительные случаи IBD описаны у ужеобразных змей L.pyromelana (Jacobson, 1989) и маисовых полозов E.guttata (Fleming, et al, 2003), а также у нескольких видов питонов рода Morelia и пальмовых ботропсов B.marchi (Raymond, et al, 2000). В настоящее время не ясно, являются ли эти заболевания результатом заражения одним или несколькими видами ретровирусов или представляют собой болезни разной этиологии, имеющие сходное клиническое течение.
Клинические признаки и патологоанатомические изменения
У заболевших змей отмечают медленно прогрессирующую кахексию, нарушение линьки, координации движений, отрыгивание корма, неврологические расстройства («вертячку», анизохорию, задирание и подергивание головы, опистотонус, неправильное положение колец тела), реже отмечают новообразования (в основном на коже) и лейкозные реакции (до 80-100 тыс/мкл, преимущественно лимфоциты и пролимфоциты), а также вторичные инфекции. Изменения, выявляемые на вскрытии, обычно носят вторичный характер. Отмечают подагру почек, септический тромбоз, гепатоклеточный липидоз или гепатит, меланоз печени, дегенеративные изменения в поджелудочной железе и почках, интерстициальную пневмонию и т.п. Патогномоничным симптомом для удавов и питонов считают воспаление и формирование абсцессов в солитарных железах пищевода, развитых у ложноногих змей (Jacobson, et al, 1999). Эозинофильные включения в цитоплазме можно наблюдать практически в любых клетках и тканях, однако их количество может сильно варьировать. В отдельных случаях при световой микроскопии включения вообще не выявляются. Чаще всего их можно обнаружить в экзокринной части поджелудочной железы (в 100% случаев), в эпителиальной выстилке пищевода и желудка (в 30% случаев). При лейкозных реакциях включения выявляются в цитоплазме приблизительно в 1% периферических лимфоцитов.
Антигенная вариабельность и родство
Исследованные ретровирусы позвоночных имеют высокую видоспецифичность, и, поэтому, вполне вероятно, что различные штаммы ретровирусов, выделенные от змей, будут обладать генетическим и антигенным полиморфизмом. Пока, тем не менее, данные о секвенировании вирус-специфических нуклеиновых кислот и сравнительном анализе с известными генами других изолятов ретровирусов в литературе не представлены. Вирусные белки от 3-х изолятов ретровируса RV-1,2,3, выделенных от обыкновенного и мадагаскарского удавов (Jacobson, et al, 1999) показали сходные характеристики при миграции в агарозном геле. Также был исследован специфический 68КД-белок, формирующий тельца включений; к нему были получены моноклональные антитела и проведен блотинг и попытки секвенирования. Однако, сравнение этих данных с другими пробами белков пока не проводили (Jacobson, Bissel, et al, 2004).
Известно, что морфология телец включений при исследовании с помощью ТЭМ может отличаться. Так, включения, обнаруженные у полозов E.guttata, были связаны с мембранами ЭПР, содержали электронноплотный флуктуирующий материал, и размер включений составлял 2-4мкм. Включения, описанные у обыкновенного удава B.constrictor, не были связаны с мембранами, содержали электронноплотные субъединицы, лежащие по периферии включения и были размером 1-4мкм (Fleming, et al, 2003). Другие тельца включений могут содержать мелкие филаменты, электронноплотные субъединицы или гексагональные капсиды. Непонятно, являются ли эти различия результатом полиморфизма вирусных штаммов, особенностей клеточного метаболизма у разных видов змей или речь вообще идет о разных заболеваниях вирусной или невирусной природы.
Экспериментальная инфекция
Постулаты Коха для IBD были выполнены группой Schumacher, et al (1994) и затем Jacobson, et al (1996). При инокуляции экспериментальным животным суспензии зараженных тканей формирование включений в гепатоцитах наблюдалось через 15-24 недели.
Эпизоотологические особенности
В конце 70-х, начале 80-х годов в США IBD регистрировали преимущественно у молодых, разведенных в неволе тигровых питонов. У этих змей болезнь протекает более остро и неврологические нарушения наблюдают чаще, чем у других видов (Jacobson, et al, 2001). Это может указывать на отсутствие у данного вида иммунокомпетентности к IBD или о низком уровне сероконверсии. В последние 10 лет болезнь чаще всего встречают у обыкновенных и императорских удавов (Lock, Jacobson, 2003). Недавно проведенное исследование на наличие вирусного антигена с помощью nested PCR у диких удавов в Коста-Рике и содержавшихся в коллекциях Германии (N=22), выявило позитивную реакцию практически во всех образцах крови, взятой от удавов, и ее отсутствие в образцах от других видов змей (Marschang,et al, 2006). Это заставляет предположить, что болезнь имеет натуральный природный резервуар в популяции обыкновенных удавов в Южной Америке. Источником являются в основном персистентные носители и клинически больные животные. Распространение происходит, вероятно, с помощью пассивной трансмиссии змеиным клещом O.natricis, контактно, с кормом и водой, а также, возможно, путем вертикальной передачи от родителей эндогенных форм вируса.
Вирусоносительство и выделение вируса
Несомненно, что выделение вируса может начинаться задолго до появления клинических симптомов у змей, являющихся источником инфекции. Медленное прогрессирование заболевания, стертость и невыразительность клинических симптомов, делает возможным заражение и от манифестных больных. Без внедрения в практику серологических и других методов прижизненной диагностики заболевания, достоверно оценить эпизоотическую ситуацию по IBD пока невозможно.
Диагностика
Диагноз ставят на основании клинических симптомов и обнаружении телец включения в тканях больных животных. Для прижизненной диагностики рекомендуют слепую пункционную биопсию печени или эксцизионную биопсию слизистой из области пищеводных желез и кардии желудка, выполненной с помощью фиброэндоскопа. Можно брать биопсию кожи (на всю толщу кожного лоскута) из нескольких участков. Включения можно изредка обнаружить в миелоцитах и лимфоцитах костного мозга или мазках периферической крови. Однако, в цитологических образцах включения плохо прокрашиваются модификациями Романовского, а клеточный материал быстро разрушается вследствие осмотического шока. Образцы тканей, в которых включения были выявлены с помощью световой микроскопии, следует также исследовать с помощью ТЭМ для уточнения природы включений. Кроме того, желательно исследовать гистологический материал с помощью специальных окрасок на наличие нуклеиновых кислот. Рекомендуется также проводить электрофорез для выявления специфического 68-КД белка, но для этого пригоден только свежий или замороженный материал, не обработанный фиксаторами.
В последние годы были получены антивидовые сыворотки к IGG Boa constrictor на основании которых была разработана и тестирована непрямая ELISA (Lock, Jacobson, 2003) для обнаружения антител к ретровирусу. В качестве вирус-специфического антигена использовали очищенный штамм, выделенный от Boa constrictor с IBD в культуре клеток VH-1 в 2001г. (Jacobson, et al, 2001). Кроме того, были получены моноклональные антитела к 68КД-белку (Jacobson, Bissel, et al, 2004). Однако, ELISA пока не введена в практику. В Германии используют недавно разработанную nested-PCR на праймерах к вирус-специфической протеазе и обратной транскриптазе (Marschang, et al, 2006).
Эндогенные провирусы у рептилий обнаруживают с помощью ПЦР на субстрате культуры лейкоцитов (Huder, et al, 2002). Тем не менее, посмертное гистологическое исследование пока остается единственным практическим методом диагностики IBD, принятым во всех странах.
Дифференциальная диагностика
Клинически IBD необходимо дифференцировать с любыми инфекционными и неинфекционными заболеваниями, вызывающими неврологические нарушения, такими как менингоэнцефалит, полигиповитаминозы В, подагра, интоксикации, инсульт и т.п. При обнаружении включений в цитоплазме или ядрах клеток эпителиального типа или нейронах, необходимо определить природу этих включений. Обнаружение эозинофильных цитоплазматических включений с помощью световой микроскопии не уточняет диагноз IBD. Специальные гистохимические окраски могут помочь в определении нуклеинового материала телец включений, который может свидетельствовать о присутствии вирионов. Окраска метиловым зеленым пиронином используется для выявления РНК. Реакция Фельгена используется для окраски ДНК, где акридиновый оранжевый окрашивает РНК в красно-желтый, а ДНК в желто-зеленый цвет.
У млекопитающих практически нет заболеваний не вирусной природы, при которых образуются внутриклеточные включения (Cheville, 1983). Исключением можно считать образование телец Маллори, которые состоят из гиалина. Отравление свинцом может быть причиной внутриядерных включений, представляющих собой свинцово - гистонные комплексы.(Cheville, 1983, Coffin, 1996). При вирусном заболевании рептилий могут возникать включения, содержащие вирусные компоненты, такие как капсид, нуклеиновый материал, однако включения без вирусного компонента тоже могут присутствовать при вирусных инфекциях, и не только в случае IBD. Это было продемонстрировано при парамиксовирусной инфекции, когда в цитоплазме эпителия протоков поджелудочной железы гремучников образовывались характерные эозинофильные включения, которые состояли исключительно из гомогенного белкового материала (Jacobson, 1989). Таким образом, если присутствуют включения, должны быть взяты пробы для исследования с помощью специальных окрасок на нуклеиновый материал, электрофорез для определения вирусного белка и сопоставление ультрамикроснимков, полученных с помощью ТЭМ, со структурной морфологией включений.
Терапия
Не разработана. Змеи с подтвержденным диагнозом IBD должны подвергаться эвтаназии. Единственное сообщение о попытке применения ингибиторов обратной транскриптазы для рептилий сделал Levine (2002). Автор использовал для терапии обыкновенного удава с лейкемической формой IBD препарат Trizivir (Glaxo, SMITHKLINE), представляющий собой комбинацию трех ингибиторов ревертазы (abacivir, zidovudine и lamivuridine). Доза была рассчитана аллометрически от млекопитающих и составила по компоненту абацивира 5 мг на змею массой 32 кг каждые 72 часа. На фоне терапии нормализовалась картина крови, и змея начала брать корм. К сожалению, удав вскоре пал, и так как вскрытие не проводили, автор не смог сделать окончательного заключения об эффективности этой терапии.
Реовирусы
Большая группа вирусов, поражающих позвоночных, насекомых и растения. Вирионы представляют собой неконвертирующиеся икосаэдрические частицы размером 60-80нм, состоят из двойного капсида и сердцевины, содержащей 2-спиральную линейную РНК.
Семейство Reoviridae включает 9 родов.
Впервые о вирусном эцефалите удавов, возможно, ошибочно, сообщил Axthelm (1989). Наиболее специфическое заболевание, связанное с поражением нижних отделов респираторного тракта, описано у полозов E.mollendorfi и E.taeniura (Lamirande, et al, 1999). При эпизоотической вспышке в группе аризонских королевских змей, L. pyromelana, отмечали поражение тонкого кишечника и печени (Reavill, et al, 2003). Вирус также был выделен от взрослой самки удава, B.constrictor, с характерной клиникой IBD (Schragen, Hetzel, et al, 2004). Эпизоотическую вспышку респираторного заболевания регистрировали в группе мохавских гремучих змей, C.scutulatus (Wellehan, et al, 2005). Кроме того, ретровирусы изолировали от клинически здоровых рептилий, собакоголовых удавов C.caninus; королевских питонов P.regius; полозов E.longissima, зеленого гремучника C.viridis, игуан I.iguana и Ctenozaura sp., зеленой ящерицы L.viridis.
Клинические признаки и патологоанатомические изменения
У рептилий реовирусы вызывают острую летальную пневмонию, подострый трахеит, симптомы поражения ЦНС, поражение ЖКТ и печени, в редких случаях изолируются наряду с ретровирусами при IBD у удавов. Прижизненно может отмечаться снижение массы тела, отрыгивание корма, респираторный синдром.
На секции выявляли острую интерстициальную бронхопневмонию, некротизирующий колит или гепатит с образованием многоядерных формаций, серозную атрофию жира. Тельца включений обычно выявляются только с помощью ТЭМ в цитоплазме энтероцитов, гепатоцитов и альвеоцитов.
Антигенная вариабельность и родство
Во всех случаях, когда проводилось секвенирование вирурной РНК, вирус был отнесен к роду Orthoreovirus. Вирус охарактеризован как новый, отличающийся генетически от ортореовирусов птиц и млекопитающих.
Экспериментальная инфекция
Заражение тонкохвостых полозов E.taeniura изолятом, выделенным от спонтанно инфицированных полозов Меллендорфа E.mollendorfi и частичное выполнение постулатов Коха провели Lamirande, et al (1999). Группа Райчел Маршанг (Schragen, et al, 2004) инокулировала суспензию культуры вируса, выделенного от самки обыкновенного удава B.constrictor с клиникой IBD, 10 новорожденным удавам. Вирусную РНК обнаружили у всех инфицированных змей через 18 недель с помощью ПЦР и выдели вирус в культуре у части животных после эвтаназии.
Диагностика
Выделение вируса в культуре клеток сердца гадюки (VH-2), обнаружение вирусных частиц в тканях рептилий спомощью ТЭМ, ПЦР-диагностика (nested PCR) на праймерах к вирусной РНК-зависимой полимеразы ортореовируса млекопитающих и аквареовируса рыб (Wellehan, et al, 2005). Единственный разработанный серологический тест - РН (Marschang, et al, 2002).
Дифференциальная диагностика
При поражении легких дифференцируют с парамиксовирозом.
При поражении ЖКТ - с аденовирозом.
При поражении ЦНС - с ретровирозом (IBD).
Терапия
При эпизоотических вспышках в группах королевских змей и мохавских гремучников часть животных удалось сохранить, проведя поддерживающую терапию и профилактику вторичной инфекции цефтазидимом.
1.2 Парамиксовирусы
Представители подсемейства Paramyxovirinae поражают разные виды позвоночных. Вирионы - плеоморфные частицы диаметром 150-300нм, имеют нуклеокапсид спиральной симметрии и липопротеиновую оболочку, на поверхности которой имеются выступы длиной 8-12нм. Геном представлен односпиральной линейной молекулой минус-РНК. Подсемейство включает 3 рода.
Впервые вирус был выделен во время эпизоотической вспышки в группе ямкоголовых гадюк Bothrops atrox, начавшейся в серпентарии (Швейцария) в 1973г. У змей внезапно развилась атония мышц и ступорозное состояние, после чего через несколько дней проявились симптомы острого респираторного заболевания (уже в терминальной стадии). На вскрытии у павших животных обнаружили большое количество кровянистого экссудата в легких и полости тела (Folsch, Leloup, 1976). Вначале болезнь посчитали обусловленной синегнойной палочкой, P.aerugenosa. Затем гомогенат легочной ткани ввели в полость аллантоиса яиц ложной водяной кобры C.gigas, что вызвало их гибель в течение 7 дней. Суспензия из яиц вызвала ЦПД в культуре клеток фибромы гремучей змеи при температуре 300С. Выделенный вирус, исследованный с помощью НЭМ, был определен как парамиксовирус (Clark, et al, 1979) и получил название FDLV (Fer-de-lance virus). После этого в 1980г. болезнь была описана Элиотом Якобсоном в США, и затем эпизоотические вспышки наблюдали во многих зоопарках США и Европы, включая Московский зоопарк (Кудрявцев и др., 2000). Вирус получил номенклатурное название OPMV (Ophidian paramyxovirus). В последние годы вирус был выделен у нескольких видов ящериц, как клинически здоровых (игуан, ксенозавров, аллигаторовых ящериц, смарагдового варана, тегу), так и имевших заболевание легких (Boyer, et al, 2005). Несколько эпизоотических вспышек за 2-летний период зарегистрировали в группе каймановых ящериц Dracaena guianensis (Jacobson, et al, 2000).
Клинические признаки и патологоанатомические изменения
К вирусу чувствительны настоящие и ямкоголовые гадюки, ложноногие змеи и, возможно, некоторые виды ужеобразных змей. На пике эпизоотической вспышки заболевание протекает остро (2-3 недели) или даже молниеносно (сутки), к концу эпизоотического процесса и у менее чувствительных видов принимая скорее подострое или хроническое течение (1-6 месяцев). При острой инфекции, особенно у гремучих змей, наблюдают экссудативную пневмонию, часто с геморрагическим экссудатом или открытым кровотечением из трахеи. Могут отмечаться острые неврологические расстройства: волнообразные движения, односторонние спастические явления, потеря установочного рефлекса. На вскрытии отмечают сильный интерстициальный отек и обильный экссудат в легком и полости тела. Гистологически отмечают пролиферацию выстилающих альвеолярных клеток II типа в легких, инфильтрацию гетерофилами, утолщение альвеолярных стенок. Воспалительные инфильтраты и кровоизлияния могут заполнять воздухоносные пространства. Кроме того, наблюдается интерстициальный отек и обширные очаги фиброза в поджелудочной железе. Наиболее характерные изменения - некроз эпителия протоков с преобладанием реактивной гиперплазии и синцитиальных клеток. При подостром и хроническом течении, характерном для старых гремучих змей, наблюдают ступорозное состояние, кахексию, периферические параличи, слизь в ротовой полости. Перед появлением клинических симптомов змеи могут пропускать 1-2 кормления. Смерть обычно наступает от сопутствующей бактериальной или грибковой пневмонии. У павших животных типичные макроскопические изменения, за исключением «пролиферативной» пневмонии, могут отсутствовать. Характерны очаги интерстициального фиброза, сконцентрированные вокруг протоков поджелудочной железы. Похожие изменения могут встречаться в желчных протоках, слюнных и ядовитых железах. В гистологических препаратах иногда можно наблюдать амфофильные внутриядерные и внутрицитоплазматические включения. В цитологическом материале, полученном из легких, специфические включения обычно не выявляются.
Антигенная вариабельность и родство
Для разработки генетических и серологических тестов было выделено 3 штамма OPMV: Fer-de-lance virus, Bush-viper virus и Neotropical virus. Результаты использования этих штаммов в нескольких лабораториях США показали, что между ними существует достоверный антигенный полиморфизм. Секвенирование 16 штаммов OPMV и сравнение по L и HN вирус-специфическим генам показало, что HN-ген имеет почти одинаковую длину во всех образцах, тогда как L-ген в некоторых случаях вообще не обнаруживается (Kik, et al, 2004). При парамиксовирусной инфекции ящериц позитивные серологические реакции на антиген OPMV выявляются только в редких случаях. При парамиксовирозе, подверженном с помощью НЭМ у водяной агамы не смогли выявить ни вирусной ДНК, ни матричной РНК, проводя ПЦР на праймерах для выявления OPMV (Boyer, et al, 2005). Вероятно, генетический и антигенный полиморфизм характерен и для вирусов, поражающих различные семейства змей.
Экспериментальная инфекция
Постулаты Коха при OPMV были выполнены Элиотом Якобсоном с соавторами (Jacobson, et al, 2000) на экспериментальной группе гремучников острова Аруба Crotalus unicolor. Через 4 дня после интратрахеальной инокуляции штамма OPMV (“Aruba rattlesnake virus”) отметили инфильтрацию гетерофилами интерстиция легких. Через 9 дней начались процессы гиперплазии эпителия, в инфильтрате появились лимфоциты и макрофаги в краниальном отделе легкого. Через 15 дней выраженные изменения захватывали все отделы легкого, а к 19-22 дню последовала гибель всех зараженных змей. К этому моменту в краниальном отделе легкого был выражен коагуляционный некроз, вакуализация альвеолярного эпителия в среднем отделе, наблюдались многочисленные эозинофильные тельца включений в цитоплазме альвеоцитов. С 4-го дня после заражения вирусный антген выявили в легком с помощью окраски ИФА. ТЭМ выявила гиперплазию альвеоцитов II типа и деструкцию клеток I типа. Выделение вируса в просвет альвеол наблюдали с 9 по 19 день после заражения. Ни у одного из животных за этот срок не выявили сероконверсию с помощью РТГА. Антитела в определяемом титре появляются у переболевших животных через 6-9 недель после инокуляции вируса. Постулаты Коха также были частично выполнены во время эпизоотической вспышки в группе каймановых ящериц (Jacobson, et al, 2000). Вирус выдели в культуре клеток VH-1, и затем супернатантом инокулировали клетки Vero, где вирус был выделен повторно.
Диагностика
Диагностируют все подозрительные случаи, касающиеся острых пневмоний пролиферативного характера или неврологических нарушений у чувствительных видов змей. Ставят диагноз на основании макроскопических изменений, гистологического исследования и НЭМ легочного экссудата. Вирус изолируют в культуре клеток VH-1, Vero или на куриных эмбрионах. Для уточнения диагноза применяют РИФ, для чего образцы тканей необходимо замораживать при -20 - 700С. Для выявления серопозитивных животных применяют РТГА, разработанную Элиотом Якобсоном (Jacobson, et al, 1981), который использовал первый изолированный штамм “Fer-de-lance virus”. В дальнейшем была разработана РТГА на основе штамма “Neotropical”. В настоящее время в США РТГА проводят только 3 лаборатории, каждая на основе собственного штамма. При этом перекрестные реакции к различным штаммам вируса могут заметно отличаться. Позитивным считается титр от 1:20. Змеи, перенесшие OPMV, могут иметь чрезвычайно высокие титры, более, более 10240. Для определения активной инфекции повторную пробу берут через 2-4 недели. Повышение титра более чем на одно разведение, указывает на активную инфекцию. Плазму для анализа берут с литиевым гепарином и транспортируют на сухом льду; требуется 0,2 мл плазмы.
В Европе в последние годы стали применять ПЦР, разработанную Ahne, et al (1999). Праймеры для ПЦР были получены секвенированием L-гена из всех 3-х штаммов вируса.
Дифференциальная диагностика
У удавов и питонов OPMV необходимо дифференцировать с IBD, особенно при наличии неврологических симптомов. У гадюк и ямкоголовых гадюк дифференциальный диагноз включает острые и хронические пневмонии иной этиологии, а также септицемию с геморрагическим синдромом.
Терапия
Необходим карантин для вновь поступающих змей не менее 90 дней и серологический контроль при поступлении и через 2-3 месяца. Серопозитивных змей и животных, имеющих подозрительную симптоматику, необходимо строго изолировать. Неспецифическая терапия включает профилактику вторичной инфекции с помощью антибиотиков, назначение витаминов и иммуномодуляторов. Во время эпизоотической вспышки OPMV, начавшейся в июле 1999г. в Московском зоопарке, животным назначали деринат, гаммаплант и для купания змей использовали сильный вирулицидный дезинфектант - септабик в 0,025% концентрации (Кудрявцев и др., 2000).
Иммунитет и специфическая профилактика
Исследования по созданию убитой вакцины для профилактики OPMV проводились в начале 90-х годов в США (Jacobson, et al, 1992), но затем были прекращены в связи с недостаточным финансированием.
1.3 Флавивирусы
Вирусы семейства Flaviviridae поражают позвоночных и насекомых. Вирионы представляют собой сферические частицы диаметром 40-60нм. Они состоят из нуклеокапсида икосаэдрической симметрии и наружной липопротеидной оболочки. Геном представлен односпиральной молекулой РНК. В семействе выделяют 3 рода. Представители центрального рода Flavivirus вызывают около 30 заболеваний человека и около 8-10 видов - заболевания домашних животных.
Вирус Западного Нила - арбовирусная болезнь, эндемичная для Африки, Азии, Европы и Океании, которая передается комарами семейства Culicidae. Вирус поражает человека, млекопитающих и птиц, вызывая у чувствительных видов явления менингоэнцефалита. Сравнительно недавно вирус проник в США. Первая эпизоотия среди птиц была зарегистрирована в Нью-Йорке в 1999г. В основном заболевали вороны и дневные хищники. К 2002г. вирус распространился практически по всем штатам, причем только за лето этого года заболело 120 человек, 11 из которых умерло. В 2001г. были описаны первые случаи заболевания аллигаторов во Флориде на крокодильих фермах, а в следующем году - на фермах во Флориде, Джорджии, а также на ферме нильских крокодилов в Израиле и среди крокодилов Морелетта C.moreletti в Мексике (Jacobson, 2004). К 2005г. болезнь зарегистрировали в Техасе, Луизиане и Айдахо, причем только в Луизиане погибло 5000 молодых аллигаторов, и было зафиксировано 4 случая заражения людей из персонала ферм (Nevarez et al, 2005). Среди диких аллигаторов в эпизоотических очагах были обнаружены серопозитивные особи.
Клинические признаки и патологоанатомические изменения
У аллигаторов в возрасте 1-2 месяцев болезнь проявляется неврологической симптоматикой (плавание по кругу, атаксия, тремор мышц и головы), отмечается вздутие желудка и скопление в нем воды, вероятно, в связи с парезами мышц, участвующих в глотании. Симптомы развиваются через 7-10 дней после контакта с больными животными. При остром течении (6-8 дней) летальность составляет 40-60%. У аллигаторов в возрасте 12-14 месяцев отмечали летаргию, спастический тортиколлис и вздутие кишечника с нарушением флотации. На вскрытии обычно отмечают макроскопические изменения в печени, легких, миокарде, головном мозге, в толстом кишечнике - выраженный фибринозный колит с образованием характерных псевдомембран. Гистологически выявляется гетерофильный менингоэнцефалит; некротический гетерофильный гепатит; гетерофильный, гистиоцитарный спленит, генерализованный лимфофолликулит и некротический гетерофильный панкреатит. С помощью иммуноперидоксидазной окраски выявляется высокая иммунопозитивность тканей мозга, селезенки, поджелудочной железы, почек и ЖКТ.
Антигенная вариабельность и родство
Для крокодиловых ВЗН является типичной эмерджентной инфекцией и, по-видимому, связан с интродукцией одного штамма вируса, патогенного для человека, птиц и лошадей. Тем не менее, при выделении вируса, полученного от аллигаторов, в культуре клеток Vero, в отдельных случаях наблюдали удивительно раннее ЦПД (Nevarez, et al, 2005). Пока не выяснено, могут ли штаммы вируса, изолированные от аллигаторов, реплицироваться быстрее, чем штаммы от других животных или это доза-зависимый эффект, связанный с чрезвычайно высоким количеством вируса в зараженных тканях.
Вирусоносительство и выделение вируса
В настоящий момент роль рептилий в эпизоотологии ВЗН остается неизученной. Среди диких черепах с помощью РТГА не смогли выявить серопозитивных особей (Mitchell, el al, 2002). Сероконверсию отмечали у диких аллигаторов после вспышки заболевания среди птиц, однако титры антител оказались значительно ниже, чем у остро переболевших животных на фермах (Jacobson, 2004). У последних высокие титры сохраняются более 1 года после вспышки заболевания. По некоторым данным у заболевших аллигаторов отмечается высокая виремия и, по-видимому, значительное выделение вируса (Miller, et al, 2003). Исходя из данных о характере эпизоотических вспышек, предполагается, что ВЗН может распространяться среди чувствительных видов крокодилов более агрессивными путями, чем только трансмиссивно. Недавно было сообщено о парентеральной и оральной инокуляции вируса в экспериментальной группе аллигаторов (Klenk, et al, 2004). Это создает потенциальную опасность заражения людей, находящихся в прямом контакте с фекалиями и тканями животных.
Диагностика
Для серологической диагностики ВЗН у рептилий не применяют PRNT (реакцию нейтрализации редукции бляшек), принятую в диагностике арбовирусных болезней млекопитающих. Для прижизненного выявления сероконверсии используют недавно разработанную непрямую ELISA, основанную на полученных антивидовых поликлональных антителах кролика к IGG аллигатора (Jacobson, 2004). Для посмертной диагностики применяют специфический иммуноперидоксидазный тест, непрямую иммунофлуоресцентную окраску с использованием доступных коммерческих антиарбовирусных моноклональных антител к ВЗН млекопитающих, а также выделение вируса в культуре и ПЦР. Для изоляции вируса используют культивирование и субкультивирование на клеточных линиях Vero. ЦПД обычно наблюдают в течение 3-10 дней. RT-PCR была разрабо