Аналіз генетично модифікованих рослин шляхом використання методів генетичної і клітинної інженерії. Дослідження можливості підвищення регенераційної здатності у деяких видів з родини бобових. Опис умов отримання трансгених та трансгеномних форм рослин.
Аннотация к работе
Трансгенні організми - це рослини, риби, тварини, та інші істоти, що несуть в своєму геномі генетичну інформацію, яку було введено за допомогою методів генетичної трансформації. В результаті проведеної роботи було запропоновано та апробовано оригінальні способи культивування протопластів та протоколи регенерації рослин з протоклонів комерційних сортів люцерни та конюшини. Вперше був запропонований та апробований метод, що підвищує регенераційну здатність у люцерни та гороху шляхом генетичної трансформації “shooty”-мутантом Agrobacterium tumefaciens PGV 2206. В результаті проведених експериментів були отримані трансгенні регенераційні лінії люцерни та гороху, що дозволило запропонувати процедуру “подвійної трансформації”, що дає можливість отримувати трансгенні лінії цих бобових культур з генами, які мають практичний інтерес. Після переносу клітинних колоній люцерни на агаризоване поживне середовище, що містить 50 мг/л канаміцинсульфату, було відібрано 56 клонів, які були здатні до подальшого росту та спроможні зеленіти на світлі.Отримано канаміцинстійкі рослини люцерни і клітинні лінії сої та гороху. Молекулярно-біологічний аналіз і аналіз активності ферменту неоміцинфосфотрансферази підтвердив трансгенну природу отриманих ліній. Запропоновано і апробовано метод, що підвищує регенераційну здатність у люцерни і гороху шляхом генетичної трансформації мутантом “shooty” Agrobacterium tumefaciens PGV 2206. Отримано регенераційні лінії люцерни і гороху, що дозволяє використовувати їх для генетичної трансформації іншими генами. Запропоновано і апробовано метод генетичної трансформації гороху за допомогою неонкогенних штамів Agrobacterium tumefaciens.
Вывод
1. Апробовано систему генетичної трансформації шляхом електропорації протопластів. Отримано канаміцинстійкі рослини люцерни і клітинні лінії сої та гороху. Молекулярно-біологічний аналіз і аналіз активності ферменту неоміцинфосфотрансферази підтвердив трансгенну природу отриманих ліній.
2. Запропоновано і апробовано метод, що підвищує регенераційну здатність у люцерни і гороху шляхом генетичної трансформації мутантом “shooty” Agrobacterium tumefaciens PGV 2206. Отримано регенераційні лінії люцерни і гороху, що дозволяє використовувати їх для генетичної трансформації іншими генами.
3. Лінія трансгенного гороху з підвищеною здатністю до регенерації була використана для наступної трансформації векторними конструкціями, що несуть селективний ген стійкості до канаміцинсульфату. Отримано трансгенні пагони гороху, що несуть мобільний Ds-елемент кукурудзи. Показано можливість використання “подвійної трансформації” для отримання трансгенних ліній гороху з генами ,що цікавлять.
4. Запропоновано і апробовано метод генетичної трансформації гороху за допомогою неонкогенних штамів Agrobacterium tumefaciens. Отримано трансгенні лінії, що несуть ген стійкості до фосфінотріцину.
5. Розроблено спосіб утворення насіння у гороху в асептичній культурі. Запропоновано методику мікроклонального розмноження гороху, що дозволить клонувати до 500 000 генетично однорідних особин в рік.
6. У трансгенних ліній гороху шляхом індукції утворенння насіння в культурі in vitro отримано потомство. Молекулярно-біологічний аналіз підтвердив присутність послідовностей ДНК перенесеного гена в поколіннях генетично модифікованого гороху. Протопласти видів рослин з родини бобових, таких як конюшина, люцерна, соя, горох, люпин, голубиний горох, при використанні розроблених методів культивування здатні до утворення клітинних колоній з високим ступенем ефективності.
7. Запропоновано і апробовано протоколи регенерації рослин з клітинних ліній, отриманих з протопластів, що були виділені з комерційних сортів люцерни і конюшини. Регенерація рослин у конюшини може бути отримана як шляхом прямого, так і непрямого ембріогенезу, що підтверджено результатами гістологічного аналізу.
8. Розроблено методику культивування протопластів і регенерації рослин у Oenothera hookeri - модельного обєкту для молекулярно-генетичних досліджень.
9. Отримано асиметричні соматичні гібриди між видами з родини бобових. Показано можливість використання перенесеного гена неоміцинфосфотрансферази як генетичного маркера для відбору соматичних гібридів у видів з родини бобових.
Список литературы
1. Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений.// Київ “Наукова думка”.-1997.-152с.
2. Банникова М.А., Головко А.Э. Хведынич О.А., Кучук Н.В. Регенерация растений у сахарной свеклы (Beta vulgaris) в культуре in vitro, гистологическое изучение процессов регенерации.// Цитология и генетика.-1995.-29, N 6.-С. 14-22.
4. Кириченко И.В., Кучук Н.В., Сахно Л.А., Глеба Ю.Ю. Индивидуальное культивирование растительных протопластов и клеток.// Докл. АН Украины.-1990.- N 3.-C. 63-65.
5. Кучук Н.В., Каневский И.Ф. Методы генетической трансформации растений.// Биотехнология.- 1987.- 3, N 3. - С. 365-369.
6. Кучук Н.В. Выделение и культивирование протопластов пяти видов семейства бобовых// Физиология растений.-1989.-3, N 4. -С.821-824.
7. Кучук Н.В., Шаховский А.М., Комарницкий И.К., Глеба Ю.Ю. Получение генетически трансформированных клеточных клонов сои путем электропорации протопластов.// Биотехнология.- 1990.- N 5.- C. 30-31.
8. Кучук Н.В., Шаховский А.М., Воронин В.К., Глеба Ю.Ю. Получение асимметричных соматических гибридов в роде Medicago.// Биополимеры и клетка.-1991.-7, N 4.- С. 54-60.
9. Кучук М.В., Глеба Ю.Ю. Цитофізіологія та клітинна інженерія рослин.// Укр. бот. журнал.- 1992.-49, N 2.- С. 89-92.
10. Кучук Н.В. Генетическая трансформация высших растений, опосредованная бактериями из рода Agrobacterium. //Усп. совр. биол.-1997. - 117, N 6-C. 645-658.
11. Кучук Н.В., Глеба Ю.Ю. Применение трансгенных растений для целей практической селекции.// Цитология и генетика.-1997.- 31, N 4.-С. 102-114.
12. Кучук М. Генетична інженерія - входження в біологічну еру.// Вісн. НАН України.-1998.-N 3-4.- С. 28-34.
13. Сорочинский Б.В., Прохневский А.И, Гродзинский Д.М., Кучук Н.В. Иммунофлюоресцентная микроскопия компонентов цитоскелета в клетках растений.// Цитология и генетика.-1990.-24, N 3. -C. 64-65.
14. Радионенко М.А., Хведынич О.А., Гудзь В.Н., Банникова В.П., Кучук Н.В. Развитие соматических зародышей в каллусной культуре клевера лугового (Trifolium pratense L.)// Цитология и генетика.-1994.- 28, N 5.- С. 15-20.
15. Рачек Л.И., Стороженко С.В., Кучук Н.В. Генетическая трансформация гороха конструкцией, содержащей Ds-элемент кукурузы, методом электропорации.// Цитология и генетика.-1994.-28, N 6.- С. 49-54.
16. Рачек Л.И., Стороженко С.В., Кучук Н.В. Получение и молекулярно-биологический анализ трансгенных растений гороха (Pisum sativum L.), содержащих Ds-элемент кукурузы.// Биополимеры и клетка.-1995.-11, N 3-4.- С. 82-87.
17. Kuchuk N., Komarnitski I., Shakhovsky A., Gleba Y. Genetic transformation of Medicago species by Agrobacterium tumefaciens and electroporation of protoplasts.// Plant Cell Rep.-1990.- 8.-P. 660-663.
18. Kuchuk N.V., Gleba Y.Y. The development of biotechnological approaches for improvement of grain legume species.// In: Proc. of 1 Eur. Conference on Grain Legumes.- France, Anger, 1-3 June 1992.- P. 121-122.
19. Kuchuk N., Herrmann R.G., Koop H.U. Plant regeneration from leaf protoplasts of evening primrose (Oenothera hookeri).//Plant Cell Rep. - 1998.- 17, No. 8. - P. 601-604.
20. Radionenko M. A., Kuchuk N.V., Khvedynich O.A., Gleba Y.Y. Direct somatic embryogenesis and plant regeneration from protoplasts of red clover (Trifolium pratense L.)// Plant Sci.-1994.- 97. - P. 75-81.
21. Sarangi B.K., Kuchuk N.V., Gleba Y.Y. Isolation and culture of protoplasts of pigeonpea (Cajanus cajan L.).// Plant Cell Rep. -1992.-11.-P. 462-465.
22. А.с. 1549995 СССР от 15.11.89. Кучук Н.В., Глеба Ю.Ю. Способ выделения и культивирования протопластов из растительных тканей сои.
23. Момот В.П., Кучук Н.В., Пастернак Т.П. Методы клеточной иненерии растений. - Препринт 88.2, г. Киев "Комиссия УССР по делам ЮНЕСКО", 1988, 23с.
АНАТАЦІЇ
Кучук М.В. Використання прийомів генетичної інженерії і клітинної біології для отримання нових форм у видів з родини бобових і деяких інших рослин.
Дисертація у вигляді рукопису на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук за спеціальностями 03.00.22 “Клітинна біологія”, 03.00.15 “Генетика”. Інститут клітинної біології та генетичної інженерії, Київ 1998.
Розроблено методику культивування протопластів і регенерації рослин у люцерни, конюшини, гороху і у Oenothera hookeri. Протопласти сої, люпину, голубиного гороху при використанні розроблених методів культивування здатні до утворення клітинних колоній з високим ступенем ефективності. Отримано канаміцинстійкі рослини люцерни і клітинні лінії сої та гороху шляхом електропорації протопластів. Запропоновано метод, що підвищує ефективність трансформації у гороху та люцерни - “подвійна трансформація”, що включає 1) отримання лінії рослин, які здатні до регенерації в культурі in vitro, за рахунок трансформації мутантом “shooty” A. tumefaciens PGV2206; 2) - трансформація ліній, які здатні до регенерації, селективним геном. Таким шляхом було отримано регенераційні лінії люцерни і гороху і далі трансгенні рослини гороху з Ds транспозоном кукурудзи та з геном стійкості до фосфінотрицину. Присутність генів в геномі рослин було доказано за допомогою методів полімеразної ланцюгової реакції, блот-гібридизації за Саузерном, NPT II аналізу, аналізу GUS активності, імуноферментного аналізу (ELISA). Міжвидові соматичні гібриди Medicago sativa M.varia і M.borealis M.lupulina були отримані за допомогою асиметричної гібридизації. Хромосомний аналіз та блот-гібридизація рибосомальної ДНК підтвердили гібридну природу отриманих ліній. Було проведено гістологічний аналіз процесу регенерації у конюшини, гороху та цукрового буряка.
Кучук Н.В. Использование приемов генетической инженерии и клеточной биологии для получения новых форм у видов из семейства бобовых и у некоторых других растений.
Диссертация в виде рукописи на соискание ученой степени доктора биологических наук по специальностям 03.00.22 “Клеточная биология” и 03.00.15 “Генетика”, Институт клеточной биологии и генетической инженерии, Киев 1998.
Разработаны методы культивирования протопластов и регенерации растений у люцерны, клевера, гороха и у Oenothera hookeri.Протопласты сои, люпина, голубиного гороха способны с высокой эффективностью образовывать клеточные колонии при использовании разработанных методов культивирования. Путем электропорации протопластов получены канамицин-устойчивые растения люцерны и клеточные линии сои и гороха. Предложен метод, повышающий эффективность трансформации у гороха и люцерны - двойная трансформация. Суть метода заключается в следующем 1) получение регенерационноспособных линий путем трансформации мутантом “shooty” A. tumefaciens; 2) трансформация регенерационных линий селективным геном. Таким образом были получены регенерационные линии люцерны и гороха и в дальнейшем трансгеные растения гороха, как с Ds транспозоном кукурузы, так и с геном устойчивости к фосфинотрицину. Присутствие генов в геноме растений было доказано с использованием методов полимеразной цепной реакции, блот-гибридизации по Саузерну, анализа активности NPTII, анализа GUS активности, иммуноферментного анализа (ELISA). Межвидовые соматические гибриды Medicago sativa M.varia и M.borealis M.lupulina были получены с помощью асимметричной гибридизации. Хромосомный анализ и блот-гибридизация рибо-сомальной ДНК подтвердили гибридную природу полученных линий. Был проведен гистологический анализ процесса регенерации у клевера, гороха и сахарной свеклы.
Kuchuk N.V. “Application of genetic engineering and cell biology approaches to produce new forms of species from Leguminosae family as well as of some other plants.”
Dissertation thesis as manuscript is presented for academic degree the doctor of biological sciences in fields 03.00.22 “Cell biology” and 03.00.15 “ Genetics”.
Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, Kiev, 1998.
Methods of protoplast cultivation and plant regeneration have been developed for alfalfa, clover and pea and for Oenothera hookeri. Protoplasts isolated from soybean, lupine and “pigeonpea” have been cultivated with high efficiency. But, only callus has been obtained. Protoplast electroporation has been successfully applied to produce transgenic alfalfa plants as well as soybean and pea calli by using kanamycine as selectable agent. To produce transgenic alfalfa and pea plants double transformation system has been developed. The adopted approach involves two transformation steps: 1) production of regenerable legume lines through transformation with "shooty" mutant of A.tumefaciens PGV2206; 2) transformation of these regenerable legume lines with the gene construct containing selectable genes. Regenerable transgenic alfalfa and pea lines have been obtained using the developed approach. Transgenic pea plants carried of maize Ds trasposon as well as phosphinotricine resistant plants have been produced. The presence of transferred genes in the genomes of produced plants has been confirmed by PCR, Southern blot hybridization, NPTII activity analysis, ELISA analysis, GUS activity analysis. Interspecific hybrid Medicago sativa M.varia plants and M.borealis M.lupulina calli have been developed using the asymmetric somatic hybridization. Chromosome number analysis and Southern blot hybridization of ribosomal DNA have confirmed the hybrid nature of lines developed. Processes of plant regeneration of clover, pea and sugar beet have been studied with histological analysis.