Розробка та застосування комплексного підходу до оцінювання генетичних ресурсів аборигенних та малочисельних порід великої рогатої худоби в Україні шляхом дослідження високополіморфних мікросателітних маркерів ДНК. Паспортизація та ідентифікації тварин.
Аннотация к работе
Проаналізувати генетичну структуру племінного ядра генофондних стад великої рогатої худоби породи шароле, сірої української та світлої аквітанської порід за поліморфними мікросателітними маркерами ДНК та визначити їх популяційно-генетичні характеристики. Отримано нові дані поліморфізму 10-ти мікросателітних локусів ДНК популяційної вибірки трьох порід великої рогатої худоби - шароле, сірої української та світлої аквітанської за допомогою техніки капілярного гель-електрофорезу. Вивчення генетичної структури порід великої рогатої худоби за використання поліморфних мікросателітних локусів ДНК дає змогу підвищити ефективність оцінки генетичного різноманіття аборигенних та малочисельних порід великої рогатої худоби з метою добору, спрямованого на відтворення тварин бажаних генотипів. Вивчення поліморфізму мікросателітних послідовностей ДНК проводили на біологічному матеріалі (зразки крові) племінного ядра генофондних стад великої рогатої худоби трьох порід: шароле ДПДГ "Гонтарівка" ІТ НААН Вовчанського району Харківської області (n=23), сірої української та світлої аквітанської порід ДПДГ "Поливанівка" Магдалинівського району Дніпропетровської області (n=27 та n=11, відповідно). З метою створення ПЛР-тест-системи контамінаційного контролю біоматеріалу великої рогатої худоби досліджували проби ДНК, які виділяли із крові великої рогатої худоби, нативної та заморожено-відталої сперми бугаїв та зіскрібків слизової оболонки вагіни корів із підприємств: ТОВ "Агрофірма "Маяк", ВАТ "Лубенське племпідприємство" Полтавської області, СКВ "Міжгіря" Черкаської області, СТОВ "Нива" Вінницької області, СВК "Заповіт Леніна" Харківської області, племпідприємство Інституту тваринництва НААН (n=87).Розроблено комплексний підхід щодо оцінки та збереження генетичного різноманіття порід великої рогатої худоби України за використання мікросателітних ДНК-маркерів та системи контамінаційного контролю біоматеріалу, який призначено для створення кріобанку генетичних ресурсів племінного ядра малочисельних зникаючих порід. Визначено оптимальні методи та умови виділення ДНК із клітин крові, сперми та зіскрібків слизової оболонки вагіни великої рогатої худоби. Розроблено мультиплексну ПЛР-тест-систему, як молекулярно-генетичний спосіб контамінаційного контролю біоматеріалу великої рогатої худоби. Створено мультипраймерну систему для ідентифікації ділянки 16S-23S РРНК геному збудників хламідіозу та фрагменту гена глікопротеїну І (GI) вірусу інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби. Досліджено генетичну структуру племінного ядра генофондних стад великої рогатої худоби порід шароле, сірої української та світлої аквітанської за 10-ма мікросателітними локусами ДНК в техніці капілярного електрофорезу.
Вывод
Розроблено комплексний підхід щодо оцінки та збереження генетичного різноманіття порід великої рогатої худоби України за використання мікросателітних ДНК-маркерів та системи контамінаційного контролю біоматеріалу, який призначено для створення кріобанку генетичних ресурсів племінного ядра малочисельних зникаючих порід.
Визначено оптимальні методи та умови виділення ДНК із клітин крові, сперми та зіскрібків слизової оболонки вагіни великої рогатої худоби. Для довгострокового зберігання ДНК доцільне використання сольового та фенол-хлороформного методів екстракції (концентрація препаратів ДНК 80-100 нг/мкл та чистота А 260/280 > 1,8); для проведення експрес-аналізів - сорбенту Chelex-100, для дослідження великої кількості проб ДНК-гуанідинізотіоціанатного методу.
Розроблено мультиплексну ПЛР-тест-систему, як молекулярно-генетичний спосіб контамінаційного контролю біоматеріалу великої рогатої худоби. Створено мультипраймерну систему для ідентифікації ділянки 16S-23S РРНК геному збудників хламідіозу та фрагменту гена глікопротеїну І (GI) вірусу інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби. Визначено оптимальні умови проведення полімеразної ланцюгової реакції для одночасного виявлення контамінантів вірусної та бактеріальної природи.
Досліджено генетичну структуру племінного ядра генофондних стад великої рогатої худоби порід шароле, сірої української та світлої аквітанської за 10-ма мікросателітними локусами ДНК в техніці капілярного електрофорезу. Найбільшим числом алельних варіантів досліджуваних локусів характеризується порода шароле (55 алелей), у сірої української та світлої аквітанської порід ідентифіковано 48 та 49 алелей, відповідно. Найбільш поліморфними є локуси TGLA53 (10 алелей у шароле та 8 алелей у світлої аквітанської порід) та TGLA227 (8 алелей у сірої української породи).
Розкрито статистично вірогідні унікальні алельні варіанти в особин породи шароле (за мікросателітними локусами INRA023 - 200 п.н. та 218 п.н., TGLA53 - 154 п.н. та 176 п.н., ETH3 - 123 п.н.) та унікальні алелі у тварин сірої української породи (за локусами INRA023 - 196 п.н. та 216 п.н., TGLA53 - 172 п.н., TGLA126 - 111 п.н. та 125 п.н., TGLA227 - 79 п.н. та ETH225 - 152 п.н.), які можуть слугувати високоінформативними породоспецифічними маркерами.
Встановлено відносне зниження генетичної різноманітності породи шароле (Н = 0,61 та Е = 3,35), порівняно з сірою українською (Н = 0,67 та Е = 3,50) та світлою аквітанською (Н = 0,66 та Е = 3,51), відмічено істотну перевагу гомозиготних генотипів над гетерозиготними за мікросателітними локусами ЕТН 10 - 87,0 %, TGLA126 - 56,5 %, ETH225 - 52,2 % у породи шароле.
Виявлений низький рівень генетичної дистанції між породами шароле та світлою аквітанською (0,1299) відбиває характер історичних звязків між ними і свідчить про ефективність використання обраних мікросателітних локусів для оцінки генетичної диференціації порід великої рогатої худоби.
Виявлено високий поліморфізм досліджуваних 10-ти мікросателітних локусів (РІС та Н > 0,5), що вказує на ефективність використання цих послідовностей ДНК при вивченні генетичної структури великої рогатої худоби породи шароле, сірої української та світлої аквітанської порід, а також при проведенні індивідуальної паспортизації та контролю походження тварин.
Запропоновано алгоритм сертифікації зразків ДНК аборигенних та зникаючих порід великої рогатої худоби, які підлягають довгостроковому збереженню, за умов ідентифікації унікальних алелей мікросателітних локусів та створення "паспорту якості" біоматеріалу з обовязковим контамінаційним контролем ДНК.
Пропозиції виробництву
1. Для збереження генетичного біорізноманіття порід при створенні кріобанків біологічного матеріалу аборигенних та малочисельних порід великої рогатої худоби застосовувати комплексний підхід щодо маркування зразків ДНК за мікросателітними маркерами та ДНК-маркерами контамінаційного контролю.
2. При проведенні протиепідемічних заходів на племпідприємствах та племрепродукторах рекомендуємо використовувати розроблену тест-систему з одночасного виявлення збудників хламідіозу та інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби методом ПЛР.
Список литературы
1. Шкавро Н.М. Молекулярно-генетичний підхід до діагностики інфекційних захворювань сільськогосподарських тварин на моделі хламідіозу ВРХ / Н.Н. Шкавро, Е.В. Щербак // Науково-технічний бюлетень, № 89 / ІТ УААН. - Харків, 2005. - С. 168-171. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).
2. Шкавро Н.М. Застосування методів ПЛР-аналізу у біотехнології відтворення сільськогосподарських тварин / Н.Н. Шкавро, Е.В. Щербак // Науково-технічний бюлетень, № 91 / ІТ УААН. - Харків, 2005. - С. 159-162. (Дисертантом зібрано та проаналізовано джерела літератури, проведено експериментальні дослідження, підготовлено роботу до друку).
3. Шкавро Н.М. Виявлення ДНК збудників хламідіозу та ІРТ ВРХ за допомогою полімеразної ланцюгової реакції / Н.Н. Шкавро, Е.В. Щербак, І.М. Ксьонз // Біологія тварин. - Львів, 2006. - Т. 8, № 1-2.- С. 255-259. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).
4. Шкавро Н.М. Аналіз генетичної структури мясних порід великої рогатої худоби на основі використання мікросателітних маркерів ДНК / Н.М. Шкавро, В.І. Россоха, А. Радко // Науково-технічний бюлетень, № 99 / ІТ УААН. - Харків, 2009. - С. 129-135. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).
5. Россоха В.І. Пошук породоспецифічних генетичних ДНК-маркерів для типування біологічних зразків великої рогатої худоби / В.І. Россоха, Н.М. Шкавро // Науковий вісник ЛНУВМБТ ім. С.З. Гжицького. - 2010. - Т. 12; №2(44), Ч. 3. - С. 211-217. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).
6. Шкавро Н.М. Поліморфізм мікросателітних маркерів ДНК двох порід великої рогатої худоби / Н.М. Шкавро, А. Радко, Е. Слота [та ін.] // Вісник Харківського національного університету імені В.Н. Каразіна. - Серія: біологія. - 2010. - № 905, Вип. 11. - С. 120-126. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).
7. Шкавро Н.Н. Выделение ДНК из соматических и половых клеток млекопитающих / Н.Н. Шкавро, Е.В. Щербак // Матеріали VII Міжнародної науково-практичної конференції "Наука і освіта".- Дніпропетровськ. - 2004. - Т. 56.- С. 12-13. (Дисертантом зібрано та проаналізовано джерела літератури, проведено експериментальні дослідження, підготовлено роботу до друку).
8. Россоха В.И. К вопросу изучения генетической структуры крупного рогатого скота породы шароле на основе использования микросателлитных маркеров ДНК / В.И. Россоха, Н.Н. Шкавро, А. Радко [и др.] // Стратегия развития зоотехнической науки: тезисы докладов Междунар. научно-практ. конф., посвященной 60-летию зоотехнической науки Беларуси. - Жодино: Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси по животноводству, 2009. - С. 127-129. (Дисертантом проведено експериментальні дослідження, статистичне опрацювання даних, написано основний текст статті, сформульовано висновки).