Дослідження гуморальної імунної відповіді на пластівцевоутворюючий фактор у хворих на стафілококову інфекцію та визначення цінності цього антигену для діагностики інфекцій. Вплив умов культивування на вихід рекомбінантного білка. Виявлення антитіл до ПлФ.
Аннотация к работе
На сьогодні лабораторна діагностика стафілококової інфекції передбачає комплексне дослідження з використанням мікробіологічних та серологічних методів (Бидненко и др., 1993), проте встановлення з його допомогою етіологічного діагнозу в багатьох випадках є доволі складним та мало ефективним. Видоспецифічність, поверхневе розташування та виражені антигенні властивості дозволяють розглядати ПЛФ як можливий діагностичний маркер стафілококової інфекції. Метою роботи було дослідження гуморальної імунної відповіді на пластівцевоутворюючий фактор у хворих на стафілококову інфекцію та визначення цінності цього антигену для діагностики інфекцій даної етіології. Вивчити гуморальну імунну відповідь на ПЛФ S. aureus, зокрема рівень, частоту виявлення та афінність антитіл, специфічних до ПЛФ, у хворих на стафілококову інфекцію різної локалізації, провести порівняльний аналіз вказаних показників хворих та здорових людей. Вперше показано діагностичне значення виявлення сироваткових анти-ПЛФ-антитіл у хворих на стафілококову інфекцію та розроблено ТІФА на основі рекомбінантного ПЛФ для підвищення точності діагностики захворювань, викликаних S. aureus.Доведено, що виявлення антитіл до пластівцевоутворюючого фактора S. aureus у сироватці крові має діагностичне та прогностичне значення, що зумовлює використання пластівцевоутворюючого фактора в імуноферментному аналізі для діагностики інфекцій стафілококової етіології. За допомогою імуноферментного аналізу встановлено, що антитіла класу G до пластівцевоутворюючого фактора S. aureus наявні у сироватках здорових донорів, титр їх коливається від 1:50 до 1:800 і не залежить від віку. Встановлено, що при стафілококовій інфекції відбувається підвищення титру антитіл, специфічних до пластівцевоутворюючого фактора: у хворих на стафілококову інфекцію середні значення титру антитіл до пластівцевоутворюючого фактора є вірогідно вищими (1 : 1055 - при остеомієліті, 1 : 400 - при гаймориті) за цей показник у здорових осіб (1 : 188). Достовірність різниці за вказаним показником у хворих на кістково-гнійну стафілококову інфекцію та інфекцію верхніх дихальних шляхів вказує на існування залежності між рівнем гуморальної імунної відповіді на цей антиген та локалізацією інфекції. Показано, що титри антитіл до пластівцевоутворюючого фактора, вищі за 1 : 800, визначені за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу, можуть слугувати надійним діагностичним критерієм при підтвердженні стафілококової етіології захворювань.
План
2. Основний зміст роботи
Вывод
Доведено, що виявлення антитіл до пластівцевоутворюючого фактора S. aureus у сироватці крові має діагностичне та прогностичне значення, що зумовлює використання пластівцевоутворюючого фактора в імуноферментному аналізі для діагностики інфекцій стафілококової етіології.
За допомогою імуноферментного аналізу встановлено, що антитіла класу G до пластівцевоутворюючого фактора S. aureus наявні у сироватках здорових донорів, титр їх коливається від 1:50 до 1:800 і не залежить від віку.
Встановлено, що при стафілококовій інфекції відбувається підвищення титру антитіл, специфічних до пластівцевоутворюючого фактора: у хворих на стафілококову інфекцію середні значення титру антитіл до пластівцевоутворюючого фактора є вірогідно вищими (1 : 1055 - при остеомієліті, 1 : 400 - при гаймориті) за цей показник у здорових осіб (1 : 188). Достовірність різниці за вказаним показником у хворих на кістково-гнійну стафілококову інфекцію та інфекцію верхніх дихальних шляхів вказує на існування залежності між рівнем гуморальної імунної відповіді на цей антиген та локалізацією інфекції.
Показано, що титри антитіл до пластівцевоутворюючого фактора, вищі за 1 : 800, визначені за допомогою твердофазного імуноферментного аналізу, можуть слугувати надійним діагностичним критерієм при підтвердженні стафілококової етіології захворювань. Нижчі за 1 : 800 титри антитіл, що співвідносяться з клінічними ознаками захворювання, також мають діагностичне значення і повинні враховуватись під час динамічного спостереження.
У хворих на кістково-гнійну стафілококову інфекцію сироваткові анти-ПЛФ-антитіла є високоафінними із значеннями константи дисоціації, що вірогідно вищі за такі 90 % здорових донорів. Для здорових людей характерна наявність у сироватці крові високо- та низькоафінних антитіл до пластівцевоутворюючого фактора. Залежності між титрами анти-ПЛФ-антитіл та їх афінністю не виявлено.
Досягнута ефективна експресія рекомбінантного пластівцевоутворюючого фактора в системі E. coli XLI-Blue (біля 30 % всіх клітинних білків) за рахунок розробленої схеми культивування штаму-продуцента.
На основі штаму E. coli BL21(DE3)Gold сконструйовано систему для конститутивної експресії рекомбінантного пластівцевоутворюючого фактора, перевагами якої є простота ферментації та низька собівартість процесу культивування штаму-продуцента.
Перелік праць, опублікованих за темою дисертації
1. Іванова В.Д., Позур В.К. Структура та біологічні властивості пластівцевоутворюючого фактора золотистого стафілокока // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т. 16, № 2. - С. 99-107.
2. Іванова В.Д., Позур В.К. Антигенні властивості фібриногензв‘язуючих білків та їхня роль у патогенезі стафілококових інфекцій. Фібриногензв‘язуючі білки клітинної стінки // Біополімери і клітина. - 2002. - Т. 18, № 1. - С. 26-36.
3. Іванова В.Д., Позур В.К. Антигенні властивості фібриногензв‘язуючих білків та їхня роль у патогенезі стафілококових інфекцій. Зовнішньоклітинні фібриногнезв‘язуючі білки // Біополімери і клітина. - 2002. - Т. 18, № 4. - С. 272-278.
4. Іванова В.Д., Позур В.К. Оптимізація експресії рекомбінантного пластівцевоутворюючого фактора Staphylococcus aureus у клітинах Escherichia coli XLI-Blue // Український біохімічний журнал. - 2002.-Т. 74, № 3. - С. 20-24.
5. Іванова В.Д., Позур В.К., Бідненко С.І., Лютко О.Б., Раєвська Г.Є., Пилипенко В.Г. Антитіла до пластівцевоутворюючого фактора Staphylococcus aureus у хворих на кістково-гнійну інфекцію // Біополімери і клітина. - 2002. - Т. 18, № 5.- С. 445-448.
6. Іванова В.Д., Позур В.К., Раєвська Г.Є., Пилипенко В.Г., Бідненко С.І., Лютко О.Б. Рівень гуморальної імунної відповіді на пластівцевоутворюючий фактор у хворих на стафілококову інфекцію // Імунологія та алергологія. - 2002. - № 4. - С. 34-38.
7. Іванова В.Д., Позур В.К. Оптимізація експресії рекомбінантного пластівцевоутворюючого фактора Staphylococcus aureus у клітинах E.coli XLI-Blue // Тези конференції-конкурсу молодих вчених “Актуальні проблеми фундаментальної та прикладної біохімії - 2001”. - Київ Україна. - Український біохімічний журнал. - 2002. - Т. 74, № 1. - С. 139-140.
8. Ivanova V.D. Effective expression of recombinant Staphylococcus aureus clumping factor in E.coli cells and it immunobiological activity // Conference for students, PHD students and young scientists on molecular biology and genetics. Dedicated to the establishment of Ukrainian Society for molecular biology. - Kyiv (Ukraine). - 2001. - P. 96.
9. Иванова В.Д, Позур В.К., Пилипенко В.Г., Раевская Г.Е. Определение антител к хлопьеобразующему фактору у больных стафилококковыми инфекциями и здоровых людей // Тези VIII Українського біохімічного з‘їзду. - Чернівці (Україна).-Український біохімічний журнал (спеціальний випуск). - 2002. - т. 74, № 4б (додаток 2). - С. 158-159.