Дослідження білкових чинників та визначення антитіл до ендогенного або екзогенного інсулінів у складі цих білків методами імуноферментного та радіоімунного аналізів та створення на їх основі тест-системи "ІФА-АТ-інс" для лікування цукрового діабету.
Аннотация к работе
Відомо, що існують різні за властивостями типи білків сироватки крові, які звязують інсулін (БЗІ) [И.С. Роботи в цьому напрямку проводилися й раніше, але отримані результати мали фрагментарний характер, що не дає змоги зробити обґрунтовані висновки як про природу білкових чинників, які блокують інсулін, так і про вміст їх у крові [Ю.А. Для цього необхідно не тільки виділити чинники, які мають властивості звязуватись з інсуліном, але й визначити вміст антитіл до екзогенного (ІА) та ендогенного (ІАА) інсуліну, що входять до складу одержаних фракцій. Комісаренка АМН України: “Вивчити ефективність нових засобів фармакотерапії цукрового діабету” (№ держреєстрації 0100U00916), “Оцінка безпечності препаратів інсуліну” (№ держреєстрації 0103U004099), “Вивчити особливості стану інсулінорезистентності та дослідити ефективність нових засобів фармакотерапії цукрового діабету” (№ держреєстрації 0104U003258), “Вивчити роль імунологічних факторів в розвитку цукрового діабету І типу з метою розробки патогенетичних схем лікування” (№ держреєстрації 0100U003757). Виділити білки, що звязують інсулін в сироватках крові донорів і хворих на ЦД людей, використовуючи поетапну афінну хроматографію, та провести аналіз отриманих фракцій методами ІФА та електрофорезу в поліакриламідному гелі.Розробленим методом ІФА досліджено вміст ІА та ІАА в сироватці крові 438 хворих на цукровий діабет типу 1 (ЦД-1), 188 хворих на цукровий діабет типу 2 (ЦД-2), яких лікували препаратами інсулінів, та 104 хворих на ЦД-2, які не отримували інсулінів, а також 194 донорів. Для відокремлення ІА та ІАА від інших білків, що звязують інсулін в крові людей проводили поетапну афінну хроматографію сироваток спочатку на сорбентах з напівсинтетичним (“Hoechst”) або рекомбінантним людським інсуліном (“Eli Lilly), а потім - на сорбентах з білком А (або G). Для детальнішого дослідження БЗІ в сироватках крові здорових людей і хворих на ЦД застосовували поетапну афінну хроматографію таких сироваток на сорбентах з інсуліном та білком А (виділяють з Staphylococcus aureus) або білком G (отримують з Streptococcus sp.). Так, в одному з експериментів з 5 мл сироватки крові від 10 хворих на ЦД-1 на колонці з інсуліном (h = 3 см, d = 1 см) виділено 5,87 мг білків, що звязують інсулін, а при розподілі їх на сорбенті з білком А (h = 1,5 см, d = 1 см) - 1,036 мг білків імуноглобулінової природи. У подальшому цей метод планувалось використати для визначення їх вмісту в усіх білкових фракціях, виділених методом поетапної афінної хроматографії з сироваток крові здорових людей та хворих на ЦД.Вперше застосовано метод поетапної афінної хроматографії на сорбентах з інсуліном та білком А (або G) і продемонстровано його придатність для відокремлення антитіл до інсуліну від інших білків, що звязують інсулін в сироватках крові хворих на ЦД та здорових людей. Вперше в Україні розроблено метод гетерогенного твердофазного імуноферментного аналізу для визначення вмісту антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів у крові людей. Доведено його ефективність для виявлення ІА та ІАА, як в цільній сироватці крові людей, так і у складі білкових фракцій, виділених методом поетапної афінної хроматографії з цих сироваток.
План
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Вывод
1. Вперше застосовано метод поетапної афінної хроматографії на сорбентах з інсуліном та білком А (або G) і продемонстровано його придатність для відокремлення антитіл до інсуліну від інших білків, що звязують інсулін в сироватках крові хворих на ЦД та здорових людей. Показано, що вміст білкових чинників, причетних до звязування інсуліну, в сироватках хворих на ЦД в 2,5 - 3 рази вищий, ніж у здорових людей.
2. Вперше в Україні розроблено метод гетерогенного твердофазного імуноферментного аналізу для визначення вмісту антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів у крові людей. Доведено його ефективність для виявлення ІА та ІАА, як в цільній сироватці крові людей, так і у складі білкових фракцій, виділених методом поетапної афінної хроматографії з цих сироваток.
3. Встановлено, що специфічність розробленого імуноферментного методу становить 90,9 %, а чутливість - 82,4 %; внутрішньосерійний коефіцієнт варіації складає 9,09 % для негативних зразків і 3,53 % для позитивних, а міжсерійний - 4,34 % для негативних зразків і 5,5 % для позитивних.
4. На основі розробленого методу створено вітчизняну імуноферментну тест-систему “ІФА-АТ-інс” та показано її придатність для виявлення ІА та ІАА при обстеженні здорових людей та хворих на ЦД.
5. За допомогою розробленої тест-системи проведено визначення антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів в сироватках крові здорових людей, та хворих на ЦД-1 і ЦД-2, які приймали таблетовані цукрознижуючі препарати, інєкції інсуліну або його аналогів. Відсоток осіб, у крові яких виявлено ІА або ІАА, у групі хворих на ЦД-1 дорівнював 10,96; у хворих на ЦД-2, лікованих інсуліном - 4,26; хворих на ЦД-2, які не отримували інсулін - 1,92. Серед донорів ІАА виявлено у однієї особи (0,52 % від загальної кількості обстежених).
6. Проведене порівняльне дослідження тест-системи “ІФА-АТ-інс” з імуноферментною комерційною системою “Anti-insulin ORG-520” виробництва фірми “ORGENTECH” (Німеччина), засвідчило її ефективність при визначенні антитіл до екзогенного (або ендогенного) інсуліну.
Список литературы
Статті в наукових спеціалізованих виданнях
1. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко, Р.Г. Лукашова, Н.В. Іванська, Г.Є. Раєвська. Опрацювання методу імунофентного аналізу для визначення антитіл до інсуліну у сироватці крові здорових людей та хворих на цукровий діабет // Ендокринологія, 2003, Т. 8, №1, С.24-30 (Автором самостійно здійснювався аналіз літератури, підбір хворих, експериментальні дослідження (підбір оптимальних умов проведення імуноферментного аналізу), статистична обробка та узагальнення матеріалів, написання статті).
2. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко, П.М. Карабун, Р.Г. Лукашова, Н.В. Іванська. Порівняння розробленої імуноферментної тест-системи (“ІФА-АТ-інс”) з комерційними наборами для виявлення антиінсулінових антитіл у сироватках крові людей // Ендокринологія, 2003, Т. 8, №2, С.158-168 (Автор самостійно здійснювала аналіз літератури, проводила порівняльні дослідження розробленої імуноферментної тест-системи „ІФА-АТ-інс” з комерційними наборами: імуноферментною тест-системою “Anti-insulin ORG-520” та радіоімунною - “Cis biointernational”).
3. В.В. Корпачев, Н.М. Гуріна, С.В. Мельниченко, Р.Г. Лукашова, А.А. Шупрович. Білки, що звязують інсулін, та контррецепторні білки сироватки крові хворих на цукровий діабет і здорових людей // Ендокринологія. - 2004.-Т.9.-№2.-С.221-235 (Автором здійснювалось написання фрагменту статті на підставі власних експериментальних досліджень сироваткових чинників, що блокують дію інсуліну (афінна хроматографія, електрофорез в поліакриламідному гелі).
4. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко, Р.Г. Лукашова, П.М. Карабун, Н.В. Іванська. Антигенність інсуліну та методи визначення антитіл до нього в сироватках крові здорових людей та хворих на цукровий діабет // Ендокринологія. - 2005.-Т.10.-№2.-С.206-223 (Автором самостійно здійснювався пошук літератури за темою, експериментальні дослідження (імуноферментне визначення вмісту антитіл), статистична обробка та узагальнення матеріалів, написання статті. ).
Статті в наукових виданнях
1. Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко. Методы определения антител к инсулину. // В кн. В.В Корпачева: Инсулин и инсулинотерапия.- Киев, РИА «Триумф», 2001.- С.309-322 (Пошук літератури та її аналіз, оформлення).
2. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко, Р.Г. Лукашова, П.М. Карабун, Н.В. Іванська. Дослідження цукрознижувальної та антигенної властивостей Новорапіду - аналога людського інсуліну ультракороткої дії // Клінічна ендокринологія та ендокринна хірургія, 2004, №3 (8), С.46-52 (Автором здійснювались: аналіз літератури, експериментальні дослідження (визначення вмісту антитіл до інсуліну), участь у написанні статті).
3. С.В. Мельниченко, Н.В. Іванська, В.В. Корпачев. Патогенетичне значення антитіл до ендогенного та екзогенного інсулінів // Сімейна медицина. - 2005.- №3.- С.45-47 (Аналіз літератури, написання статті).
Тези доповідей на наукових конференціях і зїздах
1. С.В. Мельниченко, В.В. Корпачев, Р.Г. Лукашова, О.А. Шевчук, Н.В. Іванська. Розробка методу визначення антитіл до інсуліну в сироватці крові людей на основі твердофазного імуноферментного аналізу // Ендокринологія, 2001, Т.6 (додаток), С. 194.
2. В.В. Корпачев, С.В. Мельниченко, Н.В. Иванская, Г.А. Раевская, Р.Г. Лукашова. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к инсулину в сыворотках крови людей // Материалы I съезда аллергологов Украины, 2002, С. 79.
3. В.В. Корпачев, Н.В. Иванская, С.В. Мельниченко, Р.Г. Лукашова, Г.Е. Раевская. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к инсулину // Укр. біохім. ж., 2002, 74, 4а (додаток 1), С.101-102.
4. С.В. Мельниченко. Розробка тест-системи для визначення антитіл до інсуліну в сироватці крові людей на основі твердофазного імуноферментного аналізу // Ендокринологія, 2002, Т. 7, №1, С.142.
5. В.В. Корпачев, Н.М. Гурина, С.В. Мельниченко. Нарушение толерантности к глюкозе у крыс после введения инсулинсвязывающих белков из сыворотки крови интактных животных // Укр. біохім. журнал.- 2002.- Т.74, №4а (додаток 1).- С.147.
6. С.В. Мельниченко. Выделение и анализ инсулинсвязывающих белков сывороток крови больных сахарным диабетом // Укр. биохим. журнал.- 2006.- Т.2, (спец.выпуск).- С.88.
7. В.В. Корпачев, Н.В. Іванська, Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко. Розробка та апробація імуноферментної тест-системи для виявлення антитіл до інсуліну // Вісник Вінницького держ. Мед. університету.- 2003.- №1-2.- с.57.
8. В.В. Корпачев, Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко, П.М. Карабун. Визначення вмісту антитіл до інсуліну та дослідження інших інсулінзвязуючих білків в сироватці крові хворих на цукровий діабет // Ендокринологія. - 2007.-Т.12 (додаток).-С.122.
Патент
1. В.В. Корпачев, Р.Г. Лукашова, С.В. Мельниченко, О.А. Шевчук, Н.В. Іванська, Г.Є. Раєвська, В.Г.Пилипенко. “Тест-система для виявлення аутоантитіл до ендогенного або антитіл до екзогенного інсулінів в сироватках та плазмі крові людей (ІФА-АТ-інс)” // Деклараційний патент на винахід 57640 А “Тест-система для виявлення аутоантитіл до ендогенного або антитіл до екзогенного інсулінів в сироватках та плазмі крові людей (ІФА-АТ-інс)” 16.06.2003.- бюл. №6.