Дослідження експресного методу визначення ліполітичної активності ферментних препаратів та ліпазотропної активності об’єктів природного походження. Розробка складу, технології одержання та методів стандартизації комбінованого ферментного препарату.
Аннотация к работе
Разом з цим, під час планових алергічних досліджень у 230 благополучних щодо захворювання на туберкульоз господарствах України виявляють тварин, що реагують на туберкулін, у яких під час розтину у внутрішніх органах не виявляють властивих туберкульозу уражень, і такі господарства зазнають значних економічних збитків через необґрунтований забій здорових тварин. У звязку з цим, для підтримки благополуччя та контролю епізоотичної ситуації щодо туберкульозу в Україні необхідно здійснювати планові діагностичні дослідження ВРХ в господарствах різних форм власності, що обумовлює необхідність виготовлення вітчизняного високоспецифічного нереактогенного та біологічно активного туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців. Дисертаційна робота виконана згідно з планами науково-дослідних робіт Національного наукового центру «Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини» на 2001-2005 рр. за завданням «Розробити систему заходів боротьби з туберкульозом сільськогосподарських тварин в умовах реформування тваринництва» (номер державної реєстрації 0101U001615) та за завданням на 2006-2010 рр. «Вивчити поширення, адаптивну мінливість мікобактерій, особливості інфекційного та епізоотичного процесів у тварин, уражених різними видами мікобактерій, і вдосконалити заходи профілактики та боротьби з туберкульозом тварин» (номер державної реєстрації 0106U000351). установлено, що туберкулін, виготовлений методом ультрафільтрації з використанням мембранного фракціювання молекул туберкулопротеїну з молекулярною вагою від 10 до 300 КДА, за біологічними властивостями не поступається туберкуліну (ППД) для ссавців у стандартному розчині; У процесі визначення біологічної активності, реактогенності, сенсибілізуючих властивостей і виготовлення серій туберкуліну для контролю використовували «Туберкулін очищений (ППД) для ссавців у стандартному розчині» (серії №№ 60, 64, 66, 80, 86, 87) виробництва Сумської біофабрики; «Сухий очищений комплексний алерген з атипових мікобактерій» (КАМ) (серії №№ 20, 26), виготовлений Курською біофабрикою; «Сухий очищений алерген з атипових мікобактерій» (ААМ), виготовлений Сумською біофабрикою (серії №№ 7, 14); «Розчинник мікобактеріальних алергенів» (серія № 14, контроль № 14), а також міжнародні стандартні зразки туберкуліну (PPD) bovine з Національного інституту біологічних стандартів і контролю (NIBCSE, Вейбридж, Великобританія) та туберкулін виробництва фірми «Десау» (Німеччина), які були отримані з Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів.Аналіз звітних матеріалів свідчить, що найбільша кількість неблагополучних щодо туберкульозу ВРХ господарств за період із 1996 по 2006 рр. була зареєстрована у 1998 р. та становила 194 господарства. Установлено, що інтенсивність росту колоній була неоднаковою: так, у розведеннях 1:10-1 і 1:10-4 кількість колоній культур була від 100 до 200 і більше, а в розведеннях 1:10-5, 1:10-6 їх кількість була в межах від 20 до 50 та колонії були світло-сірого кольору, з бугристою шорсткою поверхнею. На підставі здійснених досліджень установлено, що культури мікобактерій №№ 4 і 23, порівняно з іншими культурами, мали більший вихід бактеріальної маси в середньому на 0,29 і 0,1 %, а також мали більший вихід загального білка в середньому на 3,2 і 0,4 мг/см3 відповідно. У дослідах на лабораторних тваринах і ВРХ встановлено, що туберкуліни, які виготовлені за вдосконаленою схемою, були нешкідливими, специфічними, а біологічна активність становила в серії № 1 - 50 459 ТО/см3, серії № 2 - 51 031 ТО/см3, а в здорових тварин вони не викликали підвищеної чутливості сповільненого типу після їх введення. Під час проведення порівняльного випробування активності туберкулінів, що ми виготовили за вдосконаленою технологією (серії № 1 і № 2), та стандартної серії цього алергену, який був виготовлений на Сумській біофабриці (серія № 64), з туберкуліном, виготовленим фірмою «Десау» встановлено, що середня інтенсивність алергічних реакцій становила: на серію № 1 (10-300 КДА) - 5,7 ± 0,5 мм, серію № 2 (більше 300 КДА) - 5,0 ± 0,4 мм, серію № 64 - 5,3 ± 0,6 мм, а на туберкулін виробництва фірми «Десау» - 4,75 ± 0,6 мм.У дисертації наведено дані з вивчення епізоотичної ситуації щодо туберкульозу великої рогатої худоби в господарствах України та виділення культур мікобактерій з патологічного матеріалу. Розроблено спосіб виробничого висіву матричної розплодки на синтетичне поживне середовище, отримано протеїн з бактеріальної маси M. bovis, удосконалено технологічну схему біофабричного виготовлення туберкуліну (ППД) для ссавців, методику визначення повноти інактивації та біологічної активності туберкуліну відповідно до міжнародного стандарту. За 11-річний період (1996-2006 рр.) зареєстровано захворювання великої рогатої худоби на туберкульоз у 238 господарствах Київської, 123 - Черкаської, 108 - Сумської і 102 - Запорізької областей. Культивування на синтетичному поживному середовищі штаму M. bovis № 4 протягом 60 діб забезпечує накопичення загального білка 4,8
Вывод
Стан епізоотичної ситуації щодо туберкульозу в господарствах України. Аналіз звітних матеріалів свідчить, що найбільша кількість неблагополучних щодо туберкульозу ВРХ господарств за період із 1996 по 2006 рр. була зареєстрована у 1998 р. та становила 194 господарства. У 2006 р. значно зменшилась кількість неблагополучних пунктів щодо туберкульозу ВРХ - до 29 господарств, що у 6,6 разу менше порівняно з 1999 р. Результати аналізу епізоотичної ситуації щодо захворювання ВРХ на туберкульоз в окремих областях країни свідчать, що найбільшу кількість неблагополучних пунктів за останні 11 років було зареєстровано в Київській області - 238, Черкаській - 123, Сумській - 108 та Запорізькій - 102. У 2005 р. захворювання ВРХ на туберкульоз було зареєстровано в 44 господарствах Київської, 11 - Сумської, 5 - Черкаської і 5 - Запорізької областей.
При вивченні епізоотичної ситуації щодо туберкульозу ВРХ у господарствах України визначено, що в низці господарств, неблагополучних щодо туберкульозу ВРХ, після їх оздоровлення знову відбувались спалахи туберкульозної інфекції. Незважаючи на велику кількість господарств, неблагополучних щодо захворювання ВРХ на туберкульоз, в окремих областях здійснювали профілактичні та оздоровчі заходи. На кінець 2006 р. були оздоровлені від захворювання на туберкульоз ВРХ тваринницькі господарства Волинської, Закарпатської, Львівської, Рівненської, Івано-Франківської, Тернопільської та Чернівецької областей, а в АР Крим поголівя ВРХ більше ніж 35 років є благополучним щодо туберкульозу.
За період з 1996 до 2006 рр. лабораторії ветеринарної медицини України виділили з патматеріалу 7 529 культур мікобактерій. З них до збудника туберкульозу M. bovis віднесено 29,8 % культур, M. tuberculosis - 0,6 %, M. avium - 2,2 %, атипові - 67,4 %.
Якщо порівняти кількість патогенних і атипових культур мікобактерій, виділених за останні 11 років, то їх кількість помітно відрізняється. Так, кількість виділених культур збудника туберкульозу M. bovis у 1996 р. становила 28,3 % від загальної кількості виділених культур, а у 2006 р. цей показник збільшився до 41,9 % від загальної кількості ізольованих культур. Кількість виділених атипових культур мікобактерій за останні 11 років збільшилась у 2,2 разу порівняно з кількістю культур збудника туберкульозу M. bovis.
За допомогою алергічного методу в Україні за останні 11 років було виявлено 174 127 хворих на туберкульоз тварин, та за своєчасного здійснення заключних оздоровчих заходів до кінця 2006 р. благополучними щодо туберкульозу було 13 областей. Але гострою залишається проблема параалергічних реакцій на туберкулін, кількість яких становить 0,6-3,0 %. В окремих областях країни частка тварин з неспецифічними реакціями становить 4,7-9,8 %.
Селекція й адаптація культур M. bovis. Селекцію культур збудника туберкульозу M. bovis, ізольованих з патологічного матеріалу, проводили на щільному яєчному середовищі для культивування мікобактерій. З бактеріальної маси кожної окремої культури, яка виросла на середовищі Павловського, готували завись на стерильному фізіологічному розчині в концентрації 1 мг/см3. Потім із цієї зависі методом послідовних розведень було приготовлено шість розведень від 1:10 -1 до 1:10 -6, які окремо висівали на щільне поживне середовище.
Первинний ріст колоній у культур, спостерігали на 21-30 добу в усіх розведеннях. Установлено, що інтенсивність росту колоній була неоднаковою: так, у розведеннях 1:10 -1 і 1:10 -4 кількість колоній культур була від 100 до 200 і більше, а в розведеннях 1:10 -5, 1:10 -6 їх кількість була в межах від 20 до 50 та колонії були світло-сірого кольору, з бугристою шорсткою поверхнею.
Після пятого пасажу з поверхні поживного середовища відбирали окремі колонії й висівали на середовище Павловського для накопичення бактеріальної маси та адаптації їх до синтетичних поживних середовищ.
Ураховуючи, що процес адаптації як епізоотичних, так і референтних культур мікобактерій під час виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців є складним, багатостадійним трудомістким процесом, для їх адаптації до синтетичного поживного середовища, дослідні культури висівали на середовище Сотона з вмістом картопляного відвару у співвідношенні відповідно 1:4 і 1:1 та без нього.
Установлено, що на зазначених середовищах ріст у двох культур спостерігався на 10-18 добу у вигляді тонкої прозорої плівки, яка займала ? поверхні середовища.
Результати селекційної роботи та адаптації епізоотичних культур M. bovis свідчать, що не всі культури здатні адаптуватися до рідких поживних середовищ. Так, епізоотичні культури M. bovis № 17 і № 100 давали незначний ріст колоній у вигляді окремих острівців. При 5-6 пасажах на середовищі Сотона спостерігали дисоціацію з R- в S-форму з незначним помутнінням середовища та випадінням плівки на дно флакона. Інші культури M. bovis після 2-3 пасажів формували типову бугристу плівку, рівномірно розташовану на всій поверхні середовища.
Результати порівняльного вивчення елективних властивостей поживних середовищ свідчать, що додавання до середовища Сотона картопляного відвару у співвідношенні 4:1 дозволяє скоротити строки адаптування M. bovis. Установлено, що найбільш придатним способом адаптації та висіву культур M. bovis на середовище Сотона є висів 15-20-добової матричної плівки культури сифонним способом.
Вивчення протеїногенних властивостей культур мікобактерій. У процесі виготовлення туберкуліну основним показником для вибору штамів є їх протеїногенність та висока біологічна активність отриманого алергену.
Визначення протеїногенних властивостей ми здійснили у пяти культур мікобактерій M. bovis (№№ 4, 17, 23, 27, 100)
Для прискорення формування поверхневої плівки, яка вміщує необхідну кількість бактеріальної маси, ми зробили прискорені пасажування
10-15-добової первинної тонкої плівки на елективні середовища. Через 60 діб культивування у вирощених культур визначали накопичення бактеріальної маси та вихід протеїну.
Результати здійснених досліджень свідчать про те, що накопичення бактеріальної маси у культури M bovis № 4 через 60 діб культивування дорівнювало 0,55 ± 0,02 %, культури № 23 - 0,36 ± 0,05 %, № 17 - 0,29 ± 0,03 %, № 27 - 0,24 ± 0,02 %, № 100 - 0,26 ± 0,03 % відповідно.
Разом із цим, під час визначення виходу білка з культурального фільтрату цей показник у культур M. bovis був неоднаковим. Так, у культуральному фільтраті з M. bovis № 4 кількість білка становила 4,8 ± 0,13 мг/см3, щодо культури M. bovis № 23 - 2,0 ± 0,12 мг/см3, № 17 - 1,8 ± 0,19 мг/см3, № 27 - 1,7 ± 0,17 мг/см3, № 100 - 1,5 ± 0,2 мг/см3.
На підставі здійснених досліджень установлено, що культури мікобактерій №№ 4 і 23, порівняно з іншими культурами, мали більший вихід бактеріальної маси в середньому на 0,29 і 0,1 %, а також мали більший вихід загального білка в середньому на 3,2 і 0,4 мг/см3 відповідно.
Під час визначення біологічних властивостей туберкуліну, виготовленого з культурального фільтрату M. bovis № 4, установлено, що його активність 50 955 ТО/см3, а з культури M. bovis № 23 цей показник не перевищував 41 031 ТО/см3.
На отриманий шляхом селекції протеїногенний штам M. bovis № 4 одержано патент України № 25807 на корисну модель та реєстраційне свідоцтво № 425 Державного науково-контрольного інституту біотехнології і штамів мікроорганізмів.
Виготовлення туберкуліну для ссавців за допомогою мікропористих мембран. Для виготовлення експериментальних мікросерій туберкуліну використовували виробничий туберкуліногенний штам M. bovis ІЕКВМ-1. Відокремлення білків у культуральному фільтраті здійснювали на фільтраційній установці УФМ-3-1 з використанням мікропористих мембран, які затримували білки з молекулярною вагою 10, 100, 10-300 КДА і більше 300 КДА. Біологічні властивості дослідних туберкулінів в розведеннях 100 і 1 000 ТО вивчали на морських свинках, сенсибілізованих вакцинним штамом BCG, у порівнянні з контролем. Результати наведені в таблиці 1.
Таблиця 1
Вивчення біологічної активності, реактогенності та сенсибілізуючих властивостей туберкулінів у дослідах на морських свинках
№ з/пТуберкулін із вмістом білкаБіологічна активність, ТОСенсибілізуючі властивостіРеактогенність
1до 10 КДА39 246ВідсутніНереактогенний
2до 100 КДА50 789ВідсутніНереактогенний
3від 10 до 300 КДА51 031ВідсутніНереактогенний
4більше 300 КДА51 603ВідсутніНереактогенний
З матеріалів, наведених у таблиці, видно, що триразове внутрішньошкірне введення алергенів з молекулярною вагою білків 10, 100, 10-300 КДА та більше 300 КДА не зумовлювало сенсибілізації у здорових морських свинок. Разом із цим, у здорових морських свинок за введення виготовлених алергенів у дозі 500 ТО на місці введення внутрішньошкірних реакцій не спостерігали, що свідчить про відсутність реактогенних властивостей у цих алергенів.
Біологічна активність туберкуліну (ППД) для ссавців, що вміщував протеїни до 10 КДА, становила 39,2 тис. ТО, 100 КДА - 50,8 тис. ТО, від 10 до 300 КДА - 51,0 тис. ТО, більше 300 КДА - 51 603 ТО.
Результати досліджень свідчать, що у туберкуліну, який вміщував протеїни до 10 КДА, біологічна активність була на 12,356 ТО менше, що не відповідає вимогам стандарту.
Установлено, що туберкулін, який у своєму складі вміщував білки від 10 до 300 КДА, мав високу біологічну активність, а рівень прояву перехресних алергічних реакцій був менш виражений порівняно з туберкуліном контрольної серії, що й було підставою для вдосконалення технологічної схеми виготовлення туберкуліну для ссавців.
Виготовлення туберкуліну методом ультрафільтрації в умовах біофабрики. На Сумській біофабриці туберкулін очищений (ППД) для ссавців виготовляють у стандартному розчині. Але технологічні процеси його виготовлення трудомісткі, що суттєво впливає на кількісні показники готового продукту та його собівартість.
Ураховуючи вищезазначені дані, ми вдосконалили схему технологічних процесів, насамперед використання сифонного способу висіву матричної культури, концентрацію культурального фільтрату на фільтраційній установці УПВ-6 з порожнистими волокнами з пропускною здатністю білків 10-300 КДА за температури розчину 10 °С та концентрації розчину до 1:10 загального обєму, осадження та переосадження протеїну трихлороцтовою кислотою та сірчаним амонієм, стерилізуючу фільтрацію алергену на установці Sartorius. Технологічна схема виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців у стандартному розчині наведена на рисунку 1.
IMG_f82dadaf-4630-4b43-a636-e570b730334f
Рис. 1. Схема виготовлення туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців.
За вдосконаленою схемою ми виготовили дві серії туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців (вміст протеїну 10-300 КДА і більше 300 КДА) та здійснили визначення їх біологічних властивостей згідно з ТУ У 24.4-00497087-2001. У дослідах на лабораторних тваринах і ВРХ встановлено, що туберкуліни, які виготовлені за вдосконаленою схемою, були нешкідливими, специфічними, а біологічна активність становила в серії № 1 - 50 459 ТО/см3, серії № 2 - 51 031 ТО/см3, а в здорових тварин вони не викликали підвищеної чутливості сповільненого типу після їх введення.
Результати здійснених досліджень серії туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців у стандартному розчині, що виготовлені в умовах Сумської біофабрики за удосконаленою схемою, відповідають вимогам ТУ У 24.4-00497087-2001 і міжнародним вимогам для цього препарату.
Виготовлення ППД-туберкуліну з дезінтегрованої бактеріальної маси M. bovis. У дослідженнях використовували бактеріальну масу культури мікобактерій штаму M. bovis ІЕКВМ-1, вирощену на рідкому поживному середовищі Сотона протягом 60 діб за температури 37 ± 0,5 °С. Інактивовану бактеріальну масу відокремлювали шляхом фільтрування, яку дезінтегрували на ультразвуковій установці (УЗДН-1) за 22 КГЦ протягом 30 хвилин. Отриману надосадову рідину фільтрували через мікропористі капронові мембрани на установці УФМ-3-1, а з отриманого фільтрату виготовляли туберкулін.
Активність дослідних мікросерій туберкулінів у туберкулінових одиницях (ТО) визначали на сенсибілізованих вакцинним штамом BCG морських свинках живою вагою 400-500 г. Результати алергічних реакцій порівнювали з контрольними зразками туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців (серія № 69), виготовленого на Сумській біофабриці. Установлено, що біологічна активність туберкуліну, виготовленого з дезінтегрованих мікробних клітин M. bovis,становила 55 546 ± 10 000 ТО/см3.
У процесі випробування експериментальних мікросерій туберкулінів на великій рогатій худобі, сенсибілізованій культурою вакцинного штаму BCG, доведена їх висока біологічна активність. При цьому, середня інтенсивність алергічних реакції на туберкулін (у дозі 5 000 ТО в 0,1 см3), виготовлений з бактеріальної маси, становила 10,3 ± 1,1 мм, а щодо контрольної серії туберкуліну (серія № 69), то цей показник становив 9,8 ± 1,0 мм. Крім того, встановлено, що дослідні туберкуліни були нереактогенними й не зумовлювали сенсибілізацію у клінічно здорових тварин.
Використання методу ультразвукової дезінтеграції бактеріальної маси дозволило додатково отримати 78,5 см3 туберкуліну (ППД) для ссавців зі 100 г бактеріальної маси, який можна ефективно застосовувати для прижиттєвої алергічної діагностики туберкульозу в сільськогосподарських тварин.
Порівняльне випробування туберкулінів, виготовлених за різними технологіями, із закордонними алергенами. Дослідження біологічної активності туберкулінів здійснювали на 3-х групах тварин ВРХ (по 10 голів), щеплених культурою BCG у дозі 5 мг/см3. Було відібрано дві серії туберкулінів: № 1 та № 2, виготовлених за удосконаленою схемою, у порівнянні з Європейським стандартним зразком виробництва NIBSCE (Великобританія), а також з туберкуліном, виготовленим у Німеччині (фірма «Десау»). Активність дослідних серій туберкулінів вивчали в 3-х розведеннях - 1:200, 1:1 000 і 1:5 000 ТО. Облік реакцій здійснювали через 72 години після введення туберкулінів (табл. 2).
Данні, наведені в таблиці 2 свідчать, що середньостатистичні показники інтенсивності внутрішньошкірних алергічних реакцій у ВРХ на введення туберкуліну серії № 1 у дозі 200 ТО становили 3,3 ± 0,5 мм, 1 000 ТО - 3,6 ± 0,3, 5 000 ТО - 6,3 ± 0,9, у той час як на Європейський стандартний зразок туберкуліну NIBSCE ці показники становили відповідно 4,0 ± 0,5 мм, 4,3 ± 1,1 мм та 7,5 ± 1,2 мм.
Таблиця 2
Результати порівняльного вивчення активності туберкуліну в дослідах на ВРХ
Група тваринСередня інтенсивність реакцій (мм) на введення туберкулінів (М±m)
Серії, виготовлені за вдосконаленою технологією Міжнародний стандарт (NIBSCE)
Інтенсивність прояву алергічних реакцій на введення експериментальної серії № 2 була дещо меншою, ніж на введення туберкуліну NIBSCE. Так, на перше розведення (200 ТО) середня інтенсивність прояву алергічних реакцій становила 3,7 ± 0,5 мм, на 1 000 ТО - 4,3 мм, на 5 000 ТО - 6,2 мм. Реакції на Європейський стандартний зразок виробництва NIBSCE (Великобританія) становили відповідно 3,8 ± 0,7, 4,2 ± 1,0 і 8,7 ± 0,6 мм.
У результаті порівняння інтенсивності прояву алергічних реакцій дослідних серій туберкуліну (№ 1 і № 2) з показниками на туберкулін NIBSCE (Великобританія) була засвідчена відповідність вітчизняного туберкуліну Європейському стандарту.
Під час проведення порівняльного випробування активності туберкулінів, що ми виготовили за вдосконаленою технологією (серії № 1 і № 2), та стандартної серії цього алергену, який був виготовлений на Сумській біофабриці (серія № 64), з туберкуліном, виготовленим фірмою «Десау» встановлено, що середня інтенсивність алергічних реакцій становила: на серію № 1 (10-300 КДА) - 5,7 ± 0,5 мм, серію № 2 (більше 300 КДА) - 5,0 ± 0,4 мм, серію № 64 - 5,3 ± 0,6 мм, а на туберкулін виробництва фірми «Десау» - 4,75 ± 0,6 мм. Отримані дані свідчать, що алергени, які виготовлені в умовах Сумської біофабрики за різними технологіями, у порівнянні із закордонними зразками алергенів, за біологічною активністю не поступались туберкуліну (ППД) для ссавців, виготовленому в Німеччині.
На підставі отриманих результатів досліджень установлено, що серії туберкулінів, які виготовлені за вдосконаленою технологією в умовах Сумської біофабрики, є нереактогенними, активними, не володіють сенсибілізуючими властивостями і можуть застосовуватись для проведення алергічного дослідження ВРХ на туберкульоз.
Удосконалення методу визначення біологічної активності туберкуліну (ППД) для ссавців. Основною вимогою якості мікобактеріальних алергенів, які застосовуються для прижиттєвої діагностики туберкульозу, є їх відповідність міжнародним стандартам.
У дослідах було використано туберкулін очищений (ППД) для ссавців, виготовлений за вдосконаленою технологією, та контрольну комерційну серію туберкуліну очищеного (ППД) для ссавців у стандартному розчині (серія № 66), виготовлену на Сумській біофабриці. Для визначення активності туберкулінів із дослідної й контрольної серій алергенів готували розведення, що містили 50, 100, 500 ТО. Кожне розведення туберкуліну вводили сенсибілізованим морським свинкам внутрішньошкірно за схемою «неповного латинського квадрата». Облік реакцій здійснювали через 24 години після введення алергенів. Спочатку дослідні серії туберкуліну обчислювали за ступенем розкиду даних реакцій у тварин на дози введення порівняно зі стандартним зразком за F-критерієм. Для здійснення розрахунку середню величину шкірних реакцій по кожній дозі, а потім по серії, обчислювали за допомогою десяткових логарифмів. Для зменшення похибки під час розрахунку лінії регресії використовували три значення, величину реакцій на 1, 2, 3 розведення, крім експериментально одержаних значень (сумарна інтенсивність реакцій, мм), використовували четверте значення «нуль» (табл. 3).
Таблиця 3
Результати визначення співвідношення біологічної активності дослідної та контрольної серій туберкуліну
ПоказникиРозведення
ІІІІІІ0
Lg D3,762,761,760
Х (дослід), мм18,020,020,50
Х (контроль), мм18,521,021,00
Аналіз результатів таблиці свідчить, що для 1-го розведення дослідної серії середній розмір реакцій становив 20,5 мм3, 2-го розведення - 20 мм3, 3-го - 18 мм3. На введення 1-го розведення контрольної серії цей показник становив 21 мм3, 2-го - 21 мм3, 3-го - 18,5 мм3. Після проведення розрахунку F-критерію для кожного розведення дослідної та контрольної серій установлено, що F-критерій 1-го розведення становив 0,56, 2-го - 0,41, а на 3-тє цей показник дорівнював 1,62. Для побудови лінії тренда при графічному вираженні біологічної активності отриманих результатів за трьома розведеннями дослідної серії відносно показників контрольної серії туберкуліну використовували компютерну програму Microsoft Excel (рис. 2).
Розрахунок біологічної активності дослідної серії туберкуліну для ссавців: А = 0,97 Ч 50 000 = 48 500 ТО, де 50 000 - активність контрольної серії туберкуліну, ТО;
ДІ = 48 500 Ч 0,0225 = 1 091 ТО;
А = 48 500 ± 1 091 ТО.
На підставі аналізу отриманих результатів установлено, що розбіжність активності дослідної серії туберкуліну зі стандартним зразком не перевищувала допустимі значення та була найбільш близькою до одиниці (0,97), кут лінії у графіку був мінімальним. Це свідчить, що серії мали практично однакову біологічну активність.
Lg.Д
IMG_37f9d57c-a289-40c1-920b-5ced192db480
-- лінійний ряд 1 (дослідної серії), ---- лінійний ряд 2 (контрольної серії), к/к=0,97.
Рис. 2. Співвідношення біологічної активності дослідної та контрольної серій туберкуліну для ссавців.
Результати проведеної оцінки серії національного стандарту свідчать, що величина відносного коефіцієнту у/У становила в дослідної серії у = 6,5972, у контрольної серії цей показник становив у = 6,8194, що вкладається в параметри (від 80 до 120 %), які відповідають вимогам для туберкуліну (ППД) для ссавців. На підставі здійснених досліджень розроблено нову схему визначення біологічної активності туберкуліну з метою визначення національного стандарту, який відповідає вимогам ЄС. Це також дозволило спільно з Державним науково-контрольним інститутом біотехнології і штамів мікроорганізмів розробити ДСТУ «Препарати ветеринарні. Стандартний зразок туберкуліну для ссавців. Метод контролювання біологічної активності».