Виділення низькомолекулярних термостабільних білків цитозолю та дослідження їхньої дії на проліферацію клітин печінки - Автореферат

На цей час відкрито велика кількість ендогенних модуляторів проліферації і ця кількість постійно збільшується, але механізми регуляції проліферації залишаються недостатньо вивченими. В цей час існує величезне число робіт, присвячених засобам виділення ендогенних регуляторів поділу клітин і дослідженню механізмів їхньої дії. На моделі печінки, що проліферує, встановлена важлива роль цитокінів у регуляції процесу проліферації клітин печінки (Anna Mae Diehl, 1997), трансформуючих факторів росту (Meyer et al., 1991), гепарінзвязуючих факторів росту (Harris et al., 1993; Kiso et al., 1995) і гормональної регуляції процесу проліферації (Spector et al., 1997; Barbason et al., 1995). У цьому відношенні розробка методики виділення та вивчення механізму дії білків, що приймають участь у регуляції проліферації клітин печінки, має важливе теоретичне та практичне значення як у розумінні механізмів регуляції проліферації, так і в одержанні нових модуляторів проліферативній активності. Дослідження проводилися у відділі молекулярної біології та біотехнології науково-дослідного інституту біології Харківського державного університету в рамках теми “Дослідження механізмів дії ендогенних регуляторів білкової та ліпідної природи на проліферацію клітин тваринних і рослинних організмів і роль цих регуляторів в онтогенетичній адаптації до екзогенних факторів довкілля” №ГР 0198U005803, яку включено до координаційного плану №16 “Механізми розвитку та старіння біологічних систем” за спеціальним напрямком “Біологія” Міністерства освіти України.Досліджувані білки (у дозах 0,01 мг, 0,1 мг, 0,3 мг, 0,6 мг, 4,0 мг/100 г маси тіла) і радіоактивні попередники ([3H]-тімідин у дозі 2 МБК/100 г маси тіла, [14С]-гідролізат білків хлорели 2МБК/100 г, [14С]оротова кислота 1 МБК/100 г маси тіла) у фізіологічному розчині вводили тваринам натще внутрішньочеревно. Надосадкову рідину фільтрували двічі через міліпоровий фільтр GS (“Millipor Corporation”, USA) із діаметром пір 0,22 мкм при тиску 2 атм, з отриманого обсягу осаджували білок етиловим спиртом до кінцевої концентрації 87%, осадок відмивали 96% етанолом, висушували та зберігали при температурі 100С. Питому радіоактивність ДНК і РНК визначали, вводячи тварині за 45 хвилин до забою [3H]тімідин як попередник ДНК у дозі 2 МБК на 100 г маси тварини та мічену [14С]оротову кислоту, як попередник РНК у дозі 1 МБК на 100 г маси тварини. Вплив різноманітних доз досліджуваних білків на швидкість синтезу ДНК клітин печінки: низькомолекулярні термостабільні білки вводили через 4 години після часткової гепатектомії в дозах 0,01 мг, 0,1 мг, 0,3 мг, 0,6 мг, 4,0 мг/100 г маси тварини; загальну кейлонутримуючу фракцію вводили в дозі 15 мг/100 г маси тварини; IHP-12 (Inhibitor of Hepatocyte Proliferation) фракцію вводили в дозах 1,0 мг, 2,5 мг, 5,0 мг, 10,0 мг/100 г маси тварини. Для вивчення впливу часу введення досліджуваних білків на синтез ДНК, низькомолекулярні термостабільні білки вводили через 4 і 14 годин після часткової гепатектомії в дозі 4,0 мг/100 г тварини, загальну кейлонутримуючу фракцію вводили в дозі 15мг/100 г маси тварини через 1 і 16 годин після часткової гепатектомії.Визначення співвідношення між білками в цій фракції показало, що на частку низькомолекулярних білків (молекулярна маса 10-14 КДА) припадає біля третини усіх білків, що входять у цю фракцію. Оскільки для багатьох факторів регулюючі процеси проліферації показана залежність між регуляторним впливом і фазою клітинного циклу клітин мішеней, досліджували вплив часу введення низькомолекулярних термостабільних білків на швидкість синтезу ДНК у клітинах печінки (мітку вводили за 45 хвилин до піка синтезу ДНК) після часткової гепатектомії. Низькомолекулярні термостабільні білки введені внутрішньочеревно в дозі 4 мг на 100 г маси тварини, через 4 години після часткової гепатектомії (20 год. до піка синтезу ДНК) знижували питому радіоактивність ДНК у два рази в порівнянні з тваринами, що не одержали ці білки. Було показано, що введення низькомолекулярних термостабільних білків у дозі 4 мг/100 г маси тварини через 4 і 14 годин після часткової гепатектомії (10 і 20 годин до настання піка синтезу ДНК) не робили достовірного впливу на швидкість синтезу РНК ядерної та цитоплазматичної фракції клітин печінки. До піка синтезу ДНК після часткової гепатектомії, кількість низькомолекулярних термостабільних білків у цитозолі клітин печінки збільшувалася, а до моменту відновлення маси печінки кількість низькомолекулярних термостабільних білків поверталася до вихідного рівня.З клітин печінки виділені термостабільні білки з молекулярною масою 10-14 КДА, що приймають участь у регуляції проліферації клітин печінки. Показано здатність термостабільних білків із молекулярною масою 10-14 КДА збільшувати швидкість синтезу ДНК у клітинах печінки , що регенерує , при внутрішньочеревному введенні в дозі 0,01 і 0,1 мг на 100 г маси тварини, та інгібувати синтез ДНК у дозах 0,3, 0,6 і 4,0 мг на 100 г маси тварини. Низькомолекулярні термостабільні білки (10-14 КДА)

Виділення низькомолекулярних термостабільних білків цитозолю клітин печінки. На першому етапі досліджень визначали склад білків цитозолю клітин печінки, що не випадають в осадок при концентрації спирту 55%. Хроматографічний поділ на сефадексі G-75, а також поділ цих білків за методом електрофорезу в ПААГ із використанням ДСН показав, що це достатньо гетерогенна група білків (рис. 1).

У цю фракцію входили білки з молекулярною масою від 10 КДА до 70 КДА. Визначення співвідношення між білками в цій фракції показало, що на частку низькомолекулярних білків (молекулярна маса 10-14 КДА) припадає біля третини усіх білків, що входять у цю фракцію. Отримані після спиртового фракціонування білки піддавали термічній обробці (інкубували на водяній бані при 850С у плині 2 хвил.). Термолабільні білки в цих умовах денатурували та випадали в осадок, а термостабільні залишалися в розчині. Термостабільні та термолабільні білки розділяли центрифугуванням, як описано в методиці.

Термічна обробка дозволила зменшити вміст високомолекулярних білків досліджуваної фракції. Частка білків із молекулярною масою від 70 КДА до 14 КДА значно зменшувалася, при цьому кількість низькомолекулярної білкової фракції залишалася незмінною у порівнянні з вихідним рівнем. Отже, низькомолекулярні білки, що входять до складу досліджуваної фракції, є термостабільними та можуть бути відділені від високомолекулярних (термолабільних) білків цитозолю термічною обробкою.

Поряд із цим, після температурної обробки не всі високомолекулярні білки переходили до осадку, і таким прийомом не вдавалося цілком очистити фракцію білків із молекулярною масою від 10 до 14 КДА від високомолекулярних білків. Як відомо, одним із достатньо простих і ефективних методів фракціонування білків за молекулярною масою є ультрафільтрація.

Для відділення високомолекулярних білків, що не осаджуються при нагріванні, ми використовували ультрафільтрацію через міліпоровий фільтр GS (“Millipor Corporation”, USA) із діаметром пір 0,22 мкм і робочому тиску 2 атм. На рисунку 2 показаний поділ фракції після осадження білків 55% спиртом, впливи температурою 850С, 2 хв. і ультрафільтрацією. Очевидно, що до складу отриманої фракції входять тільки низькомолекулярні білки, що є термостабільними, характерний поділ цієї фракції на два основних піки зберігався.

Отже, у ході температурної обробки й ультрафільтрації кількість білків цитозолю, що не осаджується спиртом у концентрації 55%, зменшувалася в три рази. Співставляючи ці дані з хроматографічним поділом досліджуваної фракції білків до температурної обробки (рис. 1) і після неї (рис. 2) очевидно, що в ході температурної обробки й ультрафільтрації піддавалися денатурації та затримувалися на фільтрі білки з молекулярною масою вище 14 КДА. Виділена фракція складається тільки з низькомолекулярних (нижче 14 КДА) термостабільних білків. Отриману фракцію низькомолекулярних термостабільних білків цитозолю клітин печінки розділяли електрофоретично з додецилсульфатом натрію, аналізуючи якісний склад вхідних у цю фракцію білків. Було виявлено, що якість поділу білків залежала від умов проведення електрофорезу. Було визначено, що дана фракція подана пятьма індивідуальними білками (рис. 2 в). Отже, у ході трьохстадійного фракціонування білків цитозолю клітин печінки, використовуючи осадження білків етиловим спиртом, дією високої температури й ультрафільтрацією, була отримана фракція білків із молекулярною масою 10-14 КДА. До складу якої входять пять індивідуальних білків за даними електрофорезу в ПААГ із ДСН.

Вплив низькомолекулярних термостабільних білків на швидкість синтезу ДНК і РНК у клітинах печінки. У такій серії експериментів визначали вплив низькомолекулярних термостабільних білків на проліферативну активність клітин печінки.

Показано, що часткова гепатектомія стимулює перехід частини клітин печінки до поділу. При цьому пік синтезу ДНК наступав до 22-24 год. після часткової гепатектомії (рис. 3). Оскільки для багатьох факторів регулюючі процеси проліферації показана залежність між регуляторним впливом і фазою клітинного циклу клітин мішеней, досліджували вплив часу введення низькомолекулярних термостабільних білків на швидкість синтезу ДНК у клітинах печінки (мітку вводили за 45 хвилин до піка синтезу ДНК) після часткової гепатектомії.

Зразок білків вводили в ранньої G1 фазі, тобто через 4 години після часткової гепатектомії та наприкінці G1 початку S періоду клітинного циклу, тобто через 14 годин після часткової гепатектомії.

Низькомолекулярні термостабільні білки введені внутрішньочеревно в дозі 4 мг на 100 г маси тварини, через 4 години після часткової гепатектомії (20 год. до піка синтезу ДНК) знижували питому радіоактивність ДНК у два рази в порівнянні з тваринами, що не одержали ці білки.

Введення білків у цій же дозі через 14 годин після часткової гепатектомії (за 10 год. до піка синтезу ДНК) не змінювало швидкість умикання мічених попередників у ДНК клітин печінки (табл. 1).

Таблица 1 Удельная радиоактивность ДНК (тыс.имп./мин на 1 мг ДНК) в клетках регенерирующей печени крыс после внутрибрюшинного введения низкомолекулярных термостабильных белков в дозе 4 мг на 100 г массы тела через 4 и 14 часов после частичной гепатэктомии. Контроль - группа животных, которой не вводили исследуемые белки. Удельную радиоактивность определяли через 24 часа после частичной гепатэктомии

Фракция нуклеиновых кислотКонтрольВремя введения исследуемых белков после частичной гепатэктомии

Через 4 ч Через 14 ч

Удельная радиоактивность ДНК Клеток печени 57,4 ± 2,1 23,8 * ±1,1 58,5 ±17,1

* - отмечена достоверная разница по сравнению с контролем при Р <0,05.

Таким чином, для низькомолекулярних термостабільних білків цитозолю клітин печінки показана здібність придушувати синтез ДНК у клітинах печінки при введенні в ранньої G1 фазі клітинного циклу. У такій серії експериментів досліджували вплив дози низькомолекулярних термостабільних білків на питому радіоактивність ДНК клітин печінки, стимульованих частковою гепатектомією. Виявилося, що доза 0,01 і 0,1 мг на 100 г маси тварини стимулювала вмикання мітки в ДНК клітин печінки. Дози 0,3 мг, 0,6 мг і 4,0 мг на 100 г маси тварини інгібували вмикання мітки в ДНК клітин печінки більш ніж у 2 рази (рис. 4).

Отже, для низькомолекулярних термостабільних білків показана здатність впливати на швидкість синтезу ДНК у клітинах печінки, що регенерує. Цей вплив залежить як від дози введеного препарату, так і від часу введення.

Зважаючи на те, що регуляторний вплив низькомолекулярних термостабільних білків може бути опосередковане через зміну швидкості транскрипції в наступній серії експериментів досліджували вплив низькомолекулярних термостабільних білків на швидкість умикання міченої оротової кислоти в тотальну цитоплазматичну РНК (ЦРНК) і ядерну РНК (ЯРНК) клітин печінки. Було показано, що введення низькомолекулярних термостабільних білків у дозі 4 мг/100 г маси тварини через 4 і 14 годин після часткової гепатектомії (10 і 20 годин до настання піка синтезу ДНК) не робили достовірного впливу на швидкість синтезу РНК ядерної та цитоплазматичної фракції клітин печінки. Отже, внутрішньочеревні інєкції низькомолекулярних термостабільних білків цитозолю клітин печінки вірогідно не впливали на інтенсивність експресії геному.

Можна укласти, що введення низькомолекулярних термостабільних білків гепатектоміруваним тваринам робили дозозалежний і залежний від часу ефект на швидкість синтезу ДНК, і не робили вірогідного впливу на процеси синтезу тотальної ядерної РНК і швидкість транспорту РНК у цитоплазму клітин печінки.

Динаміка вмісту та швидкість синтезу низькомолекулярних термостабільних білків цитозолю клітин печінки в ході регенерації печінки. Вміст тотального водорозчинного білка цитозолю клітин печінки в контролі складав 34,5-48,3 мг на грам печінки (сира маса печінки).

Часткова гепатектомія призводить до переходу частини клітин печінки до поділу, при цьому кількість тотального білка цитозолю після часткової гепаектомії вірогідно не збільшувалася (рис. 5).

Вміст в клітинах печінки контрольних тварин фракції низькомолекулярних термостабільних білків складав у середньому 0,62 мг/г печінки (рис. 5), що складає 1,5% від загальних білків цитозолю та 30% від білків, що не осаджуються 55% спиртом (рис. 6).

На рисунку 5 показана динаміка зміни кількості низькомолекулярних термостабільних білків у процесі регенерації печінки. До піка синтезу ДНК після часткової гепатектомії кількість низькомолекулярних термостабільних білків вірогідно збільшувалася в 1,6 рази. До шостої доби, коли велика частина маси печінки відновлялася, кількість низькомолекулярних термостабільних білків поверталася до вихідного рівня.

Отже, зміна вмісту низькомолекулярних термостабільних білків прямо пропорційна швидкості синтезу ДНК. До піка синтезу ДНК після часткової гепатектомії, кількість низькомолекулярних термостабільних білків у цитозолі клітин печінки збільшувалася, а до моменту відновлення маси печінки кількість низькомолекулярних термостабільних білків поверталася до вихідного рівня. Збільшення вмісту білків фракції може бути результатом збільшення швидкості синтезу цих білків. У наступній серії експериментів був вивчений рівень умикання мічених амінокислот у білки низькомолекулярної термостабільної фракції.

Питома радіоактивність тотального білка цитозолю в контролі складала 3,24.103 імп. /хв. мг білка. До піка синтезу ДНК у клітинах печінки , що регенерує , цей показник вірогідно збільшувався до 5,48. 103 імп. /хв. мг білка (рис. 7).

Питома радіоактивність білків низькомолекулярної термостабільної фракції в контролі складала 20. 103 імп. /хв. мг білка, що на порядок вище, ніж у тотального білка цитозолю. У процесі регенерації рівень умикання мічених амінокислот у низькомолекулярні термостабільні білки вірогідно збільшується в 1,7 рази в порівнянні з контролем на першу добу після часткової гепатектомії (рис. 7). Це говорить про те, що низькомолекулярні термостабільні білки є білками, що швидко синтезуються, швидкість синтезу, яких збільшується в ході регенерації печінки.

Якісний і кількісний склад білків низькомолекулярній термостабільній фракції. Зважаючи на те, що сумарна фракція низькомолекулярних термостабільних білків складається з пятьох індивідуальних білків, було вивчене співвідношення білків, що входять до складу цієї фракції, та динаміка його зміни в процесі регенерації печінки. Динаміка співвідношення між білками в низькомолекулярній термостабільній фракції в ході регенерації печінки подана на рисунку 8.

У контрольних тварин вміст білка в смузі, що відповідає 14 КДА (пік 1), складав 0,63% від усього білка фракції, до піка синтезу ДНК вміст цього білка збільшувався до 4,9% сумарного білка фракції і залишався на цьому рівні до третьої доби включно. Достовірного розходження між вмістом інших білків низькомолекулярної термостабільної фракції в контрольних і опитних тварин не відзначалося. Отже, часткова гепатектомія, що стимулює перехід частини клітин печінки до поділу, не призводила до достовірного збільшення кількості тотального білка цитозолю. Вміст низькомолекулярної термостабільної фракції збільшувався в 1,6 рази в порівнянні з контролем на першу добу після часткової гепатектомії. Питома радіоактивність низькомолекулярного термостабільного білка цитозолю в 6 разів вище питомої радіоактивності тотального білка цитозолю. У процесі регенерації печінки питома радіоактивність низькомолекулярних термостабільних білків збільшувалася в 1,7 рази, до 24 години після часткової гепатектомії, одночасно зі збільшенням питомої радіоактивності тотального білка цитозолю. Якісний склад тотального білка цитозолю після часткової гепатектомії не змінювався. Кількісно змінювався вміст білка в смузі, що відповідає 14 КДА.

Визначення вуглеводних компонентів у низькомолекулярних термостабільних білках цитозолю клітин печінки. Отримана низькомолекулярна термостабільна фракція з нормальної печінки та з печінки після часткової гепатектомії була досліджувана на вміст глікопротеїдів. Глікопротеїди офарблювали за допомогою реакції з йодною кислотою та реактивом Шиффа. В усіх отриманих фракціях, як то: 24, 48, 72 години після часткової гепатектомії та в контрольній групі, глікопротеїди не реєструвалися.

Дослідження тканинної та внутрішньоклітинної локалізації низькомолекулярних термостабільних білків. Здатність модулювати процес проліферації низькомолекулярною термостабільною фракцією при її внутрішньочеревному введенні очевидно залежить від характеру розподілу досліджуваної фракції в організмі після введення. Нами була досліджувана тканинна локалізація мічених низькомолекулярних термостабільних білків цитозолю при їх однократному введенні в організм пацюків через 24 години після часткової гепатектомії. Була визначена динаміка зміни вмісту цих білків у різноманітних тканинах у плині 12 годин. Досліджувані білки локалізуються переважно в нирках, печінці та сироватці крові (рис. 9).

У серці легенях і селезінці відзначався однаковій низький рівень мітки і він не змінювався протягом 12 годин після введення білка. Найбільшій вміст радіоактивної мітки в усіх часових точках відзначався в нирках.

Високий рівень вмісту мітки відзначався й у печінці. Досліджувані білки звязувалися з клітинами печінки вже через 15 хвилин, а максимальна кількість мітки в клітинах печінки відзначалася через 3 години після введення мічених білків. Максимальна кількість мітки відзначалася в усіх органах, що звязують низькомолекулярні термостабільні білки, та в сироватці крові до 3 години після введення білка.

Отже, із приведених даних випливає, що мічені низькомолекулярні термостабільні білки після однократного введення в організм звязуються переважно з печінкою, нирками та виявляються в сироватці крові.

Важливим етапом у дослідженні механізмів дії різноманітних факторів регуляції проліферації є дослідження їх внутрішньоклітинної локалізації.

При вирішенні питання про внутрішньоклітинну локалізацію низькомолекулярних термостабільних білків цитозолю, що введені в організм, ми використовували подвійну [3Н] і [14С] радіоактивну мітку. Для цього 15 пацюкам 12 місячного віку за 1 годину до забою вводили по 2 МБК гідролізату білка хлорели, міченого по вуглецю [14С] і по 1,5 МБК глюкози, міченої по водню [3Н]. З печінки цих тварин виділяли фракцію низькомолекулярних термостабільних білків цитозолю. Надалі визначали вміст і питому радіоактивність низькомолекулярних термостабільних білків. Питома радіоактивність складала в середньому 36760 імп./хв. на 1 мг білка для [3Н] і 43150 імп./хв. на 1 мг білків для [14С], а співвідношення [3Н] до [14С] в отриманих білках дорівнювало 1,17. Використання цього підходу, тобто наявність двох радіоактивних міток у досліджуваних білках дозволяє оцінити ступінь “нативності” цих білків у клітині.

Мічені білки вводили пацюкам через 24 години після часткової гепатектомії.

Визначення радіоактивної мітки у білках гомогенату печінки через 1 годину після введення мічених низькомолекулярних термостабільних білків цитозолю показало, що вона складала 195100 імп./хв. на 1 мг загального білка гомогенату для [3Н] і 149500 для [14С], а співвідношення [3Н]/[14С] 1,3 (табл. 2).

Таблица 2 Локализация низкомолекулярных термостабильных белков клеток печени меченых по 3Н и 14С в гомогенате, цитозоле и ядрах клеток печени спустя час после внутрибрюшинного введения. Исследования проводили на крысах через 24 часа после частичной гепатэктомии.

Фракции клеток печениУдельная радиоактивность, имп/мин*10-3 на 1 мг белка

3Н14С3Н / 14С

Гомогенат195,12 28,40149,51 12,491,30 0,13

Цитозоль753,06 73,48470,80 45,991,59 0,28

Ядра318,96 56,47458,70 91,650,69 0,03



Отже, вводимі в організм білки звязувалися з клітинами печінки і мабуть не піддавалися значній деградації принаймні протягом години після введення.

У наступній серії експериментів визначали локалізацію низькомолекулярних термостабільних білків у цитозолі та ядрах клітин печінки. Було виявлено, що рівень радіоактивності білків у фракції цитозолю був у 3 рази вище в порівнянні з гомогенатом (табл. 2). Необхідно звернути увагу на те, що співвідношення радіоактивних міток [3Н]/[14С] було трохи змінено в порівнянні зі стандартним зразком. Ці результати свідчать про те, що велика частина вводимих в організм і потрапляючих у печінку білків локалізується в цитозолі та мабуть там здійснюється модифікація цих білків.

Виявилося, що достатньо великі кількості мічених низькомолекулярних термостабільних білків звязуються з ядрами клітин печінки (табл. 2). Проте, співвідношення між радіоактивними мітками, включеними в досліджувані білки, у ядрах відрізнялися від стандартного препарату. Така зміна була обумовлена зменшенням частки радіоактивності [3Н]. Ці результати вказують на те, що вводимі в організм білки модифікуються в ядрі з більшою швидкістю ніж у цитозолі. Можна припустити, що мішенню дії цих білків є ядра клітин печінки та їхня дія на швидкість реплікації залежить від звязування цих білків із ядром.