Вплив кріопротектора ПЕО-1500 та процесів кріоконсервування на еритроцити, ядровмісні клітини, у тому числі стовбурові гемопоетичні, і плазму кордової крові людини. Визначення чутливості популяцій ядровмісних клітин до факторів кріоконсервування.
Аннотация к работе
Національна академія наук України Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наукРобота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України Науковий керівник: Доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Бабійчук Любов Олександрівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, зав. відділу кріоцитології та кількісної морфології, м. Офіційні опоненти: Доктор біологічних наук, професор Петренко Олександр Юрійович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу кріобіохімії, м. Захист відбудеться „20 ”жовтня 2009 року о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01. в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, Харків - 15, вул.Для розробки ефективних методів кріоконсервування, що дозволяють у максимальному ступені зберігати життєздатність всіх популяцій клітин, необхідне проведення комплексних досліджень, спрямованих на вивчення ролі факторів, які впливають на збереженість і життєздатність клітин на кожному з етапів технологічного процесу кріоконсервування, починаючи від температури передобробки крові кріопротектором і закінчуючи швидкістю заморожування. Виходячи із цього, дослідження впливу факторів кріоконсервування на еритроцити і різні популяції ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі й стовбурові гемопоетичні, є актуальною проблемою. Робота виконана відповідно до наукового напрямку роботи відділу кріоцитології і кількісної морфології Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України за темою №2.2.6.14: „Вивчення молекулярних механізмів структурно-функціональних змін плазматичних мембран і цитоскелета еритроцитів донорської й кордової крові людини під впливом температурно-осмотических ефектів і кріопротекторів різного механізму дії” (№ держ. реєстрації 0104U006436), та №2.2.6.47: „Вивчення механізмів структурно-функціональних змін ядровмісних клітин кордової крові і еритроцитів під впливом екзо-і ендоцелюлярних кріопротекторів та низьких температур” (№ держ. реєстрації 0109U00278), де автор виконував самостійні розділи. Мета роботи - вивчити структурно-функціональний стан, збереженість і життєздатність еритроцитів та різних популяцій ядровмісних клітин, у тому числі стовбурових гемопоетичних, а також збереженість біологічно активних речовин плазми при кріоконсервуванні цільної кордової крові під захистом непроникаючого кріопротектора ПЕО-1500 залежно від режимів заморожування. Оцінити збереженість і життєздатність еритроцитів і ядровмісних клітин кордової крові, у тому числі стовбурових гемопоетичних, після кріоконсервування з ПЕО-1500 залежно від режимів заморожування.Суспензію клітин заморожували зі швидкістю 400С/хв, 600С/хв, 800С/хв до кінцевих температур-200С,-400С и-600С перед зануренням у рідкий азот, а також зі швидкістю 30С/хв до температури-800С перед зануренням у рідкий азот і прямим зануренням у рідкий азот. Фенотипування та визначення життєздатності [Schmid І. et al., 1992] CD45 -і CD34 -клітин проводили за допомогою проточного цитофлуориметра FACS Calibur фірми Becton Dickinson (США) з використання реагентів BD по міжнародному ISHAGE протоколу. Було показано (табл.1), що використання даного кріопротектора й оптимальної для ЯВК швидкості заморожування 30С/хв дозволяє досить ефективно зберігати клітини, однак при цьому відбувається значна загибель еритроцитів внаслідок невідповідного для даних клітин режиму заморожування. Оскільки оцінка збереженості клітин після кріоконсервування є важливим, але недостатнім тестом, що визначає стан клітин, було проведено визначення їхньої життєздатності методом проточної цитофлуориметрії з використанням 7-аміно-актиноміцину D (7AAD). Дані по життєздатності ЯВК та CD34 -клітин корелюють зі збереженістю клітин, демонструючи кращі результати при заморожуванні зі швидкістю 600С/хв до температур-400С и-600С з послідуючим зануренням у рідкий азот.У дисертаційній роботі представлено теоретичне узагальнення й нове рішення наукового завдання, спрямованого на вивчення стану клітин кордової крові під впливом кріоконсервування із кріопротектором ПЕО-1500 залежно від температурних умов інкубації клітин із кріопротектором і швидкості охолодження суспензії. Оцінка збереженості й життєздатності клітин цільної кордової крові, кріоконсервованої різними методами, виявила, що заморожування зі швидкістю 600С/хв до температури-400С перед зануренням у рідкий азот разом з обробкою кріопротектором ПЕО-1500 при 0-40С (режим КЦКК) є оптимальним для збереження одночасно еритроцитів і ядровмісних клітин, у тому числі стовбурових гемопоетичних, у порівнянні з іншими режимами заморожування. Виявлено, що модифікації білків мембрано-цитоскелетного комплексу еритроцитів після кріоконсервування цільної кордової крові по режиму КЦКК залежать від температури інкубації суспензії клітин із кріопротектором: інкубація при 0-40С сприяє утворенню меншої кількості агрегатів і кращої збереженості структури таких білків як спектрин, б.с.4.