Функції DH і РН доменів білка Bcr, їх участь в сигнальних мережах при Ph"-позитивних лейкеміях. Вміст основних типів вторинної структури рекомбінантного білка, що відповідає РН-домену Bcr. Порівняльний аналіз з даними для РН-доменів із заданою структурою.
Аннотация к работе
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ ТА ГЕНЕТИКИРоботу виконано у відділі молекулярної генетики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України. Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Телегеєв Геннадій Дмитрович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу молекулярної генетики. доктор біологічних наук, професор Негруцький Борис Сергійович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідувач лабораторії біосинтезу білка відділу механізмів трансляції генетичної інформації. Захист відбудеться "22" квітня 2008 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за адресою: 03680, м. З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології та генетики НАН України.На відміну від цього, ген bcr має три ділянки, в яких розриви відбуваються найчастіше і залежно від точки розриву bcr, утворюються три різні за довжиною форми білка Bcr-Abl. Мультидоменний білок Bcr має у своєму складі DH (Dbl-гомологічний) і РН (pleckstrin - гомологічний) домени, що знаходяться в ділянці, яка відрізняє між собою форми р190 і р210 Bcr-Abl. Роботу виконано в рамках наукових проектів відділу молекулярної генетики Інституту молекулярної біології та генетики НАН України "Структура і функція ГТФ-аз модулюючих доменів Bcr та їх роль в перебігу Ph’-позитивних лейкемій" (державний реєстраційний номер №0107U008546, 2007 р.), наукова програма НАН України "Вивчення ендогенних чинників пухлинної прогресії при злоякісних лімфомах і мієлопроліферативних захворюваннях людини" (держ. реєстр. № 0104U000163, 2004-2008 рр.); роботу підтримано грантами Президії НАН України для молодих вчених "Роль доменів bcr при Ph’ - позитивних лейкеміях" (2003-2004 рр.), "Роль PH доменів при Ph" позитивних лейкеміях" (2005-2006 рр.), дослідницьким грантом Федерації Європейських біохімічних товариств FEBS "Investigation of bcr gene GTPASE-modulating regions in Philadelphia-positive leukemias" (2005 р.). Встановити вміст основних типів вторинної структури рекомбінантного білка, що відповідає РН домену Bcr, та провести порівняльний аналіз з даними для РН доменів із визначеною структурою.У роботі було використано антитіла: моноклональні мишачі анти-6xhis (Clontech, США), анти-myc, анти-HA, анти-Flag, анти-тубулін, анти-SMC1, анти-Cdc42, анти-RHOA (Santa Cruz Biotechnology, США); поліклональні кролячі анти-GFP (MOLECULARPROBES, США), анти-Rac1, анти-Abl (Santa Cruz Biotechnology, США); вторинні моноклональні анти-мишачі, анти-кролячі антитіла, кон‘юговані з пероксидазою хрону (Amersham Bioscienses, США). Для визначення афінності зв‘язування РН домену з ліпідами було використано мембрану PIP Array (Echelon, USA) з нанесеними ліпідами різної концентрації. Імунопреципітацію комплексів білків DHPH-myc або DH-myc і білків PLC?-flag або зизимін1-HA здійснювали, інкубуючи лізат клітин 293Т з моноклональними анти-myc антитілами і сефарозою Immunosorb Для аналізу GEF-активності DH домену Bcr in vivo було використано "pull down" аналіз з GST-кон‘югованими ГТФАЗО-звязувальними доменами білків PAK1 і Rhotekin (Richnau and Aspenstrom, 2001) . Білки було преципітовано рекомбінантним білком, що відповідає РН домену Bcr, на колонці Ni-NTA, після чого білки, що зв‘язувались із РН доменом, аналізували двовимірним електрофорезом.Визначено специфічність зв‘язування РН домену Bcr із ліпідами методом ліпід-білкової гібридизації. Підтверджено взаємодію PH домену Bcr із білками SMC1, ?-тубулін, зизимін1, PLC? in vitro та in vivo. Показано відсутність GEF-активності ізольованого DH домену Bcr щодо Rho-ГТФАЗ підкласів RHOA, Cdc42 і Rac1 in vitro та in vivo. Досліджено специфічність зв‘язування РН домену з ліпідами і білками, проаналізовано вплив РН домену на локалізацію білка, до складу якого він входить. Дисертантом отримано конструкції, що експресують DH і DHPH домени Bcr, перевірено GEF-активність DH домену в експериментах in vivo.