Шляхи енергозабезпечення і детоксикації у метилотрофних дріжджів та їх скерована модифікація з метою створення нових ферментативних і біосенсорних аналітичних систем - Автореферат

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наукРобота виконана у відділі біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. Науковий консультант - доктор біологічних наук, професор Сибірний Андрій Андрійович, завідувач відділу біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Великий Микола Миколайович, професор кафедри біоорганічної, біологічної і фармацевтичної хімії Національного медичного університету ім. Київ); доктор біологічних наук, професор Калачнюк Григорій Іванович, професор кафедри органічної та неорганічної хімії, директор НДІ біотехнологічних основ підвищення продуктивності тварин Львівської державної академії ветеринарної медицини ім. Гжицького; доктор медичних наук, доцент Журило Олександр Анатолійович, завідувач лабораторії мікробіології туберкульозу і неспецифічних захворювань легень Інституту фтизіатрії і пульмонології ім.Метилотрофні дріжджі - унікальні еукаріотичні мікроорганізми, здатні рости на метанолі як єдиному джерелі вуглецю та енергії. Метилотрофні дріжджі завдяки унікальній пристосованості до метаболізму одновуглецевих сполук генерують у присутності метанолу і формальдегіду ряд специфічних метаболічних реакцій, які можна розглядати як селективний аналітичний відгук на ці практично важливі речовини-аналіти. Робота виконувалась також у рамках вітчизняних і міжнародних конкурсних програм: 3-х проектів Державного фонду фундаментальних досліджень, зокрема, № 5.4/574 “Структурні та функціональні властивості цитохром с пероксидази із метилотрофних дріжджів і дослідження їх фізико-хімічних властивостей” (№ держреєстрації 0198U003999; автор - керівник проекту), 2 науково-технічних проектів, зокрема, № 2/1084-97 “Розробка ферментативних діагностикумів для кількісного визначення етанолу, метанолу, формальдегіду і глюкози в біологічних рідинах та харчових продуктах” (№ держреєстрації 0198U003993; автор - керівник проекту); 4-х міжнародних проектів: INTAS-94-0552 “Біофізичні, біотехнологічні та хімічні підходи до вивчення каталітичних механізмів дії каталаз, диоксигеназ і лакказ”; INTAS-96-1971 “Розробка нових ензиматичних наборів і мікросенсорів для екологічного моніторингу забруднень формальдегідом”; NATO Linkage Grant HTECH.LG 940691 “Структурні та функціональні дослідження мутантних форм каталази із метилотрофних дріжджів” і Міжнародного Наукового Фонду Сороса “Шляхи окислення метанолу і генерації енергії у метилотрофних дріжджів” (у чотирьох останніх проектах автор - відповідальний виконавець). Основною метою дослідження був пошук додаткових (альтернативних) систем в енергозабезпеченні метилотрофного росту і детоксикації інтермедіатів обміну метанолу - пероксиду водню, формальдегіду і мурашиної кислоти, а також розробка нових ферментативних і біосенсорних методів аналізу метанолу, формальдегіду і етанолу з використанням ферментів і спеціально сконструйованих мутантних штамів метилотрофних дріжджів. Доведено існування у метилотрофних дріжджів додаткової циклічно-лінійної системи енергозабезпечення росту на метанолі, яка включає ксилулозомонофосфатний цикл синтезу дигідроксиацетону з формальдегіду, ланку гліколітичного окислення тріозофосфатів та цикл трикарбонових кислот.У дисертації наведено теоретично-експериментальне обгрунтування існування у метилотрофних дріжджів нових, не відомих досі додаткових шляхів енергозабезпечення метилотрофного росту і детоксикації інтермедіатів обміну метанолу. Показано, що дані явища можуть розглядатись як специфічний фізіологічний відгук клітин на певні субстрати (метанол, етанол, формальдегід) і можуть бути використані у створенні нових біоаналітичних методів і продуктів для кількісного визначення практично важливих аналітів у біологічних рідинах і харчових продуктах. За використання підходів скерованої селекції мутантів, інгібіторного аналізу та вивчення включення радіоізотопної мітки показано, що у метилотрофних дріжджів існує додаткова циклічно-лінійна система енергозабезпечення росту на метанолі, яка включає ксилулозомонофосфатний цикл синтезу дигідроксиацетону з формальдегіду, ланку гліколітичного окислення тріозофосфатів та цикл трикарбонових кислот і доповнює відомий прямий шлях окислення формальдегіду у двох дегідрогеназних реакціях. За допомогою методів селекції специфічних мутантів та їх фізіолого-біохімічного аналізу відкрито додаткові шляхи детоксикації інтермедіатів обміну метанолу у метилотрофних дріжджів, які включають окислення формальдегіду в неспецифічній альдегіддегідрогеназній реакції, енергозалежну екскрецію мурашиної кислоти в середовище та детоксикацію пероксиду водню у цитохром с-пероксидазній реакції.