Процес удосконалення схеми очищення, концентрування та зберігання тешовірусних антигенів. Специфіка синтезації антивірусного та антисвинячого пероксидазного кон’юганту. Виявлення імуноглобулінів тешовірусу першого серотипу в сироватках крові свиней.
Аннотация к работе
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук Розробка імуноферментних тест-систем для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу та специфічних ig G Робота виконана в лабораторії мікробіології та вірусології тварин Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН Сорока Віктор Іванович, Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, провідний науковий співробітник лабораторії мікробіології та вірусології тваринДля цього в Інституті сільськогосподарської мікробіології УААН розроблено набір діагностикумів ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней в реакції нейтралізації вірусу [Романенко В.Ф., Сорока В.И., 1999]. Тому проведення порівняльної оцінки лабораторних методів діагностики ензоотичного енцефаломієліту (реакції нейтралізації та твердофазного імуноферментного аналізу) та розробка вітчизняної імуноферментної тест-системи для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу і удосконалення тест-системи для виявлення специфічних антитіл до них в сучасних умовах має актуальне науково-практичне значення. Мета - розробити імуноферментні тест-системи для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу та специфічних Ig G. Для розширення спектру доступних лабораторних методів діагностики ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней розроблено імуноферментні тест-системи для виявлення антигену тешовірусу свиней першого серотипу та специфічних антитіл. Одержання очищених вірусних антигенів, високоспецифічних сироваток крові тварин, імуноглобулінів класу G свині та кроля, конюгатів антитіл з пероксидазою хріну, визначення оптимальних умов проведення ТІФА, конструювання імуноферментної тест-системи для виявлення тешовірусу свиней першого серотипу, конструювання імуноферментної тест-системи для виявлення імуноглобулінів класу G до тешовірусу першого серотипу в сироватках крові свиней та її характеристику здобувач проводила самостійно на базі відділу фітовірусології та біотехнології Інституту сільськогосподарської мікробіології за консультативної підтримки кандидата біологічних наук М.М.Охарактеризовано збудника ензоотичного енцефаломієліту (хвороби Тешена) свиней з урахуванням останніх молекулярно-генетичних досліджень і його роль в патології тварин, висвітлено основні методи ідентифікації тешо-, ентеровірусів свиней та етапи підготовки специфічних компонентів для їх проведення. В дослідах використовували штами „Чернігівський-2372”, „Березнянський-652”, „Перечинський-642”, „Дніпровський-32”, які належать до тешовірусів свиней 1-го серотипу, та И 59 і Р501, які мають антигенні звязки з 13 серотипами ентеровірусів свиней. Для контролю використовували еталонні штами тешовірусів свиней 10-ти серотипів: „Teschen 199”, „O 3b”, „O 2b”, „PS 36”, „F 26”, „PS 37”, „F 43”, „UKG 173/74”, „VIR 2899/84”, „VIR 460/88” та штам ентеровірусів групи А „V 13” 8-го серотипу, які були люб’язно надані професором Мальте Даубером (Інститут вірусної діагностики ім. Контролювали чистоту очищеного вірусного антигену спектрофотометрично, електронно-мікроскопічно і в непрямому варіанті ТІФА з антитілами до білків культури клітин СНЕВ. При конструюванні та випробуванні імуноферментної тест-системи для виявлення антитіл до тешовірусу 1-го серотипу використовували сироватки крові свиней.Таким чином, визначено оптимальні параметри проведення сендвіч варіанту твердофазного імуноферментного аналізу, згідно з якими взаємодія антитіл з антигенами протягом 1 години при 37°С та додавання в буферний розчин 5 мкг/см3 яєчного альбуміну та 30 мг/см3 сечовини забезпечують необхідну специфічність реакції. Завершальним етапом нашої роботи було визначення ймовірних можливостей застосування сендвіч-варіанту ТІФА для виявлення антигену тешовірусів свиней 1-го серотипу. Тобто позитивним вважається результат, коли оптична густина на 10 % перевищує граничне значення, більше 0,345 оптичних одиниць. Значення оптичної густини при дослідженні тешовірусного антигену штаму „Березнянський-652” достовірно відрізняється від значень оптичної густини при дослідженні інших антигенів тешовірусу свиней першого серотипу (Р<0,05), однак перевищує граничне значення і не потрапляє до „сірої зони”, тому результат вважається позитивним. Статистична обробка результатів досліджень антигенів тешовірусу свиней першого серотипу в розробленій тест-системі показала, що значення оптичної густини при дослідженні еталонного штаму Teschen 199 достовірно не відрізняються від значень оптичної густини при дослідженні штамів тешовірусів свиней першого серотипу, виділених на території України.Отримано тешовірусні антигени з титром 1:10240 та робочим розведенням 1:640 в непрямому варіанті твердофазного імуноферментного аналізу та доведено, що гліцерин у співвідношенні 1:1 зберігає активність тешовірусного антигену протягом 9 місяців при-18°С.