Сравнительное изучение межклеточного взаимодействия мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток и гемопоэтических стволовых клеток в условиях различного содержания кислорода. Особенности поведения клеток в условиях тканевых концентраций кислорода.
Аннотация к работе
Роль кислорода в межклеточном взаимодействии гемопоэтических стволовых и мезенхимальных стромальных клеток in vitroИзвестно, что в костном мозге более примитивные гемопоэтические клетки находятся при 1 - 2% кислорода в окружении остеобластов и клеток стромы, в то время как более зрелые предшественники расположены в сосудистой нише, где уровень кислорода выше (Parmar et al., 2007). Показано, что в условиях in vitro содержание кислорода может влиять на гемопоэтические клетки, оказывая существенный эффект на предшественников одного уровня иерархии и оставаясь индифферентным для других (Cipolleschi et al., 1993). К сожалению, влиянию концентрации кислорода на взаимодействие гемопоэтических и стромальных клеток до сих пор уделяется недостаточно внимания. Аналогичные результаты получены и в других работах, где показано, что при сокультивировании ГСК и МСК из жировой ткани образуется меньшее количество CD34 клеток, чем при сокультивировании с костномозговыми ММСК (Kirloy et al., 2007; de Toni et al., 2011). Изучение особенностей взаимодействия гемопоэтических и стромальных клеток в условиях тканевых концентраций кислорода позволит расширить представления о влиянии факторов микроокружения на регуляцию гемопоэза, а также может использоваться в дальнейшем при разработке методик обогащения стволовыми и прогениторными клетками трансплантатов кроветворной ткани.Перед проведением эксперимента клетки инкубировали ночь в присутствии митомицина С (1.5 мкг/мл, Sigma-Aldrich, США) с целью остановки деления, а затем проводили пересев с плотностью, позволяющей получить 70-80% монослой. В день эксперимента клетки размораживали на водяной бане при 37 ?С и отмывали от криопротектора в избытке среды культивирования RPMI 1640 (Gibco, США), содержащей 2 ММ L-глутамина (ПАНЭКО, Россия), 10% ЭТС и 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco, США). Суспензию ПКМНК добавляли к ЖТММСК в концентрации 1.5-2.5х106 клеток/мл и культивировали совместно в условиях 1%, 5% и 20% кислорода ( 37С, 5% СО2, влажная атмосфера) в течение 72 часов. Помимо этого выявлялись незрелые формы клеток: оксифильные эритробласты, метамиелоциты и палочкоядерные гранулоциты, а также клетки, относящиеся к лимфоидному и моноцитарному росткам, степень зрелости которых невозможно установить с помощью световой микроскопии (рис. Среди Т-клеток значительно уменьшилась доля Т-ЕК-клеток (рис.Разработан методический подход на основе использования ЖТММСК и ПКМНК, в котором адгезировавшие гемопоэтические клетки в отсутствие суспензионной фракции способны генерировать популяции предшественников разной степени коммитированности. Гемопоэтические предшественники, адгезирующие из ПКМНК на ЖТММСК, способны образовывать популяцию, где доля CD34 клеток в 170-250 раз выше, чем в исходных ПКМНК. В условиях 1% и 5% кислорода, в сравнении с 20%, среди ПКМНК выявляется большее количество гемопоэтических колоний и изменяется соотношение КОЕ различных кроветворных ростков: увеличивается содержание более коммитированных предшественников - КОЕ-Г и КОЕ-М, а мульти-и бипотентных - КОЕ-ГЭММ и КОЕ-ГМ - уменьшается.