Развитие методов конструирования бесплазмидных рекомбинантных штаммов Escherichia coli: от Mu-зависимой "случайной" интеграции до сайт-специфических перестроек хромосомы - Автореферат
Разработка нового генно-инженерного инструментария, использующего сайт-специфические системы рекомбинации фагов для интеграции рекомбинантных плазмид с целевыми генами в бактериальную хромосому и последующего вырезания векторной части этих плазмид.
Аннотация к работе
«Развитие методов конструирования бесплазмидных рекомбинантных штаммов Escherichia coli: от Mu-зависимой “случайной” интеграции до сайт-специфических перестроек хромосомы» АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Работа выполнена в лаборатории №4 Закрытого Акционерного общества «Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика» (ЗАО «АГРИ»). Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент И.В. Защита диссертации состоится «___» ________ 2008 года в 1400 на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г.2. разработка нового генноинженерного инструментария, использующего сайт-специфические системы рекомбинации фагов ?80 и l для интеграции рекомбинантных плазмид с целевыми генами в бактериальную хромосому и последующего вырезания векторной части этих плазмид, соответственно: · конструирование библиотеки штаммов с различной локализацией искусственных ?80-ATTB сайтов в бактериальной хромосоме; Осуществлено конструирование библиотеки штаммов E. coli с различной локализацией искусственных ?80-ATTB сайтов в бактериальной хромосоме и нового ?80-интегративного вектора, содержащего в своем составе ?ATTL/R сайты для вырезания векторной части плазмиды из бактериальной хромосомы после интеграции генетического материала. В качестве одного из примеров такой стратегии мы описываем использованную нами систему на основе mini-Mu для интеграции в бактериальную хромосому искусственно созданного оперона AROG4-SERA5-SERC, где ген SERC использовался в качестве генетического селективного маркера, при конструировании бесплазмидного штамма-продуцента L-триптофана. В данной работе именно ген SERC в составе, полученной таким образом, рекомбинантной плазмиды использовали в качестве селективного маркера для отбора клонов-интегрантов реципиентного штамма с фенотипом Ser содержащих в хромосоме интегрированный фрагмент ДНК с генами AROG4, SERA5и SERC, фланкированный участками Mu-ATTL и Mu-ATTR. Штамм TG1-CMR, содержащий в хромосоме кассету PTACAAROG4-SERA5-(LATTL-CMR-LATTR) был использован в дальнейшем как донор этой кассеты, маркированной CMR, для переноса в другие штаммы, включая штамм-продуцент триптофана, с помощью Р1-зависимой трансдукции.На основе использования механизмов Red/ET гомологичной рекомбинации и сайт-специфической рекомбинации бактериофагов ?80 и l разработана новая стратегия прецизионной интеграции в хромосому E. coli фрагментов ДНК, в состав которых могут входить как отдельные генетические элементы, так и целые гены и/или опероны.