Микробиологические и молекулярно-биологические исследования активности комплексов бактериальных экзометаболитов. Технология производства биологически активного комплекса для подавления роста патогенного штамма E.coli О75 в виде капель для приема внутрь.
Аннотация к работе
РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ТЕХНОЛОГИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ КОМПЛЕКСОВ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭКЗОМЕТАБОЛИТОВДиссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации на кафедре биотехнологии и в Федеральном государственном унитарном предприятии «Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов» Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации Ведущая организация: ФГУП «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и Предприятие по производству бактерийных препаратов» Федерального медико-биологического агентства Российской Федерации (198320, г. Защита состоится «26» марта 2013 г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д.208.088.01 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197227, Санкт-Петербург, пр-т Испытателей, д.14).Исследовать состав и динамику низкомолекулярных карбоновых кислот и аминокислот: а) в процессе роста штаммов E.coli М-17, VL613, №14, О75 и S. enteritidis var.Issatchenko; На основе синтетических аналогов экзометаболитов разработать комплекс, подавляющий рост и понижающий уровень патогенности патогенного штамма E.coli О75. На основе синтетических аналогов экзометаболитов разработать биологически активный комплекс, стимулирующий рост пробиотического штамма E.coli VL613. Разработать технологию производства биологически активного комплекса для подавления роста патогенного штамма E.coli О75 в виде капель для приема внутрь. Предложить показатели качества комплекса бактериальных экзометаболитов для подавления роста и патогенности E.coli O75 в виде капель для приема внутрь и на основании полученных результатов разработать проект фармакопейной статьи предприятия.В обзоре литературы обсуждается концепция, согласно которой развивающаяся популяция микроорганизмов представляется как саморегулируемая система, функционирование которой определяется не только изменением внешних условий, но и влиянием продуцируемых ею метаболитов: специализированных регуляторов и продуктов энергетического или конструктивного метаболизма. Обсуждаются механизмы «чувства кворума» у бактерий и роль в них регуляторных метаболитов.Периодическое культивирование энтеробактерий осуществляли на среде М-9 в колбах на качалке. Культивирование L. plantarum осуществляли на среде Блаурокка без агара, на среде Блаурокка, разбавленной в 2 раза, и на среде МРС-1. B. bifidum 1 выращивали только на среде МРС-1. Анализ низкомолекулярных карбоновых кислот проводили методом ВЭЖХ на колонке Supelcogel H 250?4,6 мм (Sigma-Aldrich) в H3PO4 0,1% с ацетонитрилом 5% (скорость потока 0,3 мл/мин, температуры 25ОС и 55ОС). О биологическом действии ВС, экзометаболитов или их комплексов судили из сравнения мутности в опытных и контрольных пробирках и по относительному приросту биомассы (ОПБ) за время (t) роста культур: ОПБТ = (Dопt-Doпо)/(Dkt-Dko), где Dопt и Dkt - оптические плотности соответственно опытной и контрольной культуры через t часов после внесения добавки, Doпо и Dko - оптические плотности в момент внесения добавки. При выращивании бактерий на агаризованной среде действие экзометаболитов оценивали по значению индексов площади (ИП): ИП=[S(опыт)-S(контроль)]/S(контроль); где S(контроль) и S(опыт) - средние площади колоний на среде без добавки (контроль) и с добавлением экзометаболитов или их комплексов, мм2.Методом ВЭЖХ во внеклеточной среде (ВС) энтеробактерий были идентифицированы кислоты: уксусная и муравьиная (все штаммы), молочная (E.coli) и янтарная (E.coli VL613). Штаммы бактерий различались по концентрации накапливаемых кислот: наибольшее количество уксусной выделял штамм E.coli VL613 (10,6 ММ), муравьиной - E.coli №14 (2,8 ММ), молочной - пробиотические E.coli M-17 и VL613 (1,9 ММ). Состав накапливаемых аминокислот также различался от штамма к штамму, причем пробиотические бактерии выделяли аминокислот больше (E.coli VL613 - 0,41 ММ), чем патогенные (E.coli №14 и S.enteritidis - 0,12 ММ). В среде B. bifidum 1 и L. plantarum 8P-A3 были идентифицированы три кислоты: уксусная (ацетат), молочная (лактат) и лимонная (цитрат), причем их концентрации зависели от состава среды и в 10-80 раз превышали соответствующие концентрации у энтеробактерий. Лактат в процессе роста E.coli О75 постепенно накапливался и потреблялся при замедлении темпов роста, а E.coli №14 поглощала лактат дважды: на фазе ускоренного роста и в начале стационарной фазы (рис.1 в).Скрининг активности аминокислот и СКК проводили при выращивании E.coli О75 на твердой и жидкой средах.