Оценка эффективности различных молекулярно-генетических подходов с целью получения мутантных генов бактериальных фитаз с повышенной термостабильностью. Характеристика свойств полученного мутантного варианта фитазы с оптимизированными свойствами.
Аннотация к работе
РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ПРОМЫШЛЕННО-ВАЖНЫХ ХАРАКТЕРИСТИК ФИТАЗЫ CITROBACTER FREUNDIIРабота выполнена в лаборатории ВКПМ Федерального государственного унитарного предприятия ?Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов? (ФГУП «ГОСНИИ генетика») Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор С.П. Цыганков ФГУП «ГОСНИИ генетика» кандидат химических наук, доцент Л.Р. Защита состоится «__1__»_февраля___2011 года в 1400 часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, г.Целью данной работы явилась разработка молекулярно-генетического подхода к конструированию мутантного гена, кодирующего фитазу с повышенной термостабильностью, высокой удельной активностью и неизмененным температурным оптимумом, а так же его эффективная экспрессия в системе, пригодной для промышленности. Методами сайт-направленного мутагенеза и ?error-prone? ПЦР были получены, различные мутантные гены, кодирующие фитазы с повышенной термостабильностью. Показано, что некоторые аминокислотные замены в консервативных областях фитазы APPA E. coli, приводящие к увеличению ее термостабильности, аналогичным образом влияют на термостабильность фитаз Citrobacter freundii и Obesumbacterium proteus, несмотря на низкую аминокислотную гомологию. Так, в результате случайного мутагенеза областей гена, соответствующих аминокислотным участкам K29-G74 и Q104-Q131, методом ?error-prone? ПЦР был получен мутантный ген, кодирующий оптимизированную по свойствам фитазу. Мутации в генах, кодирующих фитазы бактерий C. freundii и O. proteus, получали методом сайт-направленного [Angelaccio S. et. al., 2002] или сайт-направленного насыщающего мутагенеза [David E. et. al., 1987] с помощью ПЦР, используя специфические праймеры.Обнаружены одинаковые аминокислотные мутации, приводящие к увеличению термостабильности фитаз из одного и того же семейства, несмотря на низкую аминокислотную гомологию. Предложены области для проведения сфокусированного случайного мутагенеза с целью эффективного получения генов фитаз с повышенной термостабильностью. Получен, клонирован и экспрессирован мутантный вариант гена фитазы C. freundii с оптимизированными характеристиками Разработан усовершенствованный ПЦР метод, с помощью которого синтезировали новый синтетический ген термостабильной фитазы для эффективной экспрессии в дрожжах P. pastoris. Мутантная рекомбинантная термостабильная фитаза (варианты), фрагмент ДНК, кодирующий указанную фитазу (варианты), штамм Pichia pastoris - продуцент указанной фитазы (варианты).