Получение рекомбинантного васкулярного эндотелиального фактора роста человека VEGF 165 в эукариотической и прокариотической системах экспрессии: условия культивирования; разработка схемы выделения и очистки высокоэффективного штамма-продуцента E.coli.
Аннотация к работе
К факторам, способствующим росту сосудов относятся ростовые факторы: кислый и основной факторы роста фибробластов (AFGF и BFGF), сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), тромбоцитарный фактор роста (PDGF), белки клеточной адгезии, белки матрикса, матриксные металлопротеиназы (MMP). Ангиогенная эффективность многих из них показана на моделях ишемии миокарда и скелетных мышц животных, однако в клинических исследованиях основная доля приходится на VEGF и фактор роста фибробластов (FGF) (Парфенова и Ткачук, 2000). VEGF165 является основным сосудистым эндотелиальным фактором роста в человеческих тканях, поэтому нашел свое применение в качестве мощного проангиогенного препарата при моделировании процесса неоангиогенеза. Применение в медицине препаратов, полученных генноинженерным способом растет, так как получение биологически активных белков из природных источников является, как правило, очень сложным и, как сказано выше, дорогостоящим процессом.В 1983 году Сенгером был открыт в клеточной линии карциномы фактор сосудистой проницаемости эндотелиальных клеток, особенно, им оказалась богата асцидная жидкость опухоли (Senger et al., 1983).Эти биологически активные белки влияют на развитие кровеносных сосудов и обладают общей структурной архитектурой, несмотря на малую степень гомологии первичных последовательностей. Представители семейства VEGF проявляют биологическую активность в виде димеров: главным образом в виде гомодимеров и иногда в виде гетеродимеров (Bonnie et al., 2009). Биологическая активность VEGF реализуется за счет связывания с тремя высокоаффинными тирозинкиназными рецепторами: рецептор сосудистого эндотелиального фактора (VEGFR)-1, 2 и 3 (Rosana et al., 2008).Экспрессия VEGF-А стимулирует образование везикуло-вакуолярных органелл, которые служат каналом для переноса белков крови в опухоли. Показаны домен, гомологичный PDGF (PDGF homology domain) (оранжевый), гепарин-связывающий домен (heparin-binding domain) (светло синий) и NRP связывающий домен (NRP-binding domain) (синий) (Shalini Iyer and K. Взаимодействие лиганда с рецептором запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосуда, их выживание и пролиферацию (Bonnie et al., 2009). При активации рецепторов VEGFR участвуют также «вспомогательные» белки FRS2, которые так же, как и в случае FGFR рецептора, фосфорилированные по тирозиновым и серин-треониновым остаткам, связывают адапторные белки Grb2 и Shp2 (тирозин-фосфатазу) и запускают внутриклеточную сигнальную последовательность PKC (протеин-киназа С), PI3K, Src и Crk (Matsumoto and Mugishima, 2006). Зрелый белок состоит из 165 аминокислотных остатка первые 115 участвуют в образовании цистеинового узла и ответственны за связывание с рецептором.Ангиогенная эффективность многих из них показана на моделях ишемии миокарда и скелетных мышц животных, однако в клинических исследованиях основная доля приходится на VEGF и фактор роста фибробластов (FGF) (Парфенова и Ткачук, 2000). В экспериментальных работах совместное использование VEGF и фактора стабилизации сосудов ангиопоэтина-1, а также тромбоцитарного фактора роста (PDGF-BB) в сочетании с FGF-2 индуцирует образование сосудистой сети, которая остается стабильной даже через 1 год после прекращения действия этих факторов (SHYUK-G et al 2003; Cao R et al 2003).В настоящее время анти-VEGF препараты применяются в качестве адъювантного лечения при метастазах опухолей. Бевацизумаб представляет собой моноклональные антитела против VEGF; рекомбинантные IGG1-подобные антитела, с молекулярной массой около 149 КДА, произведенный в системе экспрессии клеток линии CHO, в питательной среде, содержащей антибиотик гентамицин. Препарат рассчитан на внутривенное введение и выпускается в дозах 100мг и 400 мг в одноразовых ампулах, с концентрацией в растворе 25мг/мл (Базин и Гарин, 2008). Препарат связывается со всеми изоформами VEGF, препятствуя тем самым взаимодействию лигандов с рецепторами VEGFR; т.е. блокирует инициацию клеточного сигнала, ведущего к пролиферации эндотелиальных клеток. Сорафениб (Нексавар, Sorafenib/ Bayer) - одобрен управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA, США) в декабре 2005 года для клинического применения при метастатическом раке почки и первичном раке печени.Как упоминалось ранее, нативная форма VEGF165 содержит сайт гликозилирования (Asn75) и является гомодимером за счет образования двух межцепочечных дисульфидных мостиков. Поэтому для получения биологически активной формы рекомбинантного VEGF использовали в качестве продуцентов эукариотические системы экспрессии. Lee Seong-Baek с соавторами была описана методика получения RHVEGF165 в ооцитах китайских хомячков (Lee Seong-Baek et al., 2008). Авторами была достигнута сверхпродукция целевого белка, составившая более 80 мг/л, и разработана методика выделения, включающая последовательные стадии хроматографической очистки. Особенностью эукариотической экспрессии в отличии от прокариотической является
План
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
1.1 Общие сведения о васкулярных эндотелиальных факторах роста
1.1.1 История открытия
1.1.2 Семейство васкулярных эндотелиальных факторов роста
1.2 Сосудистый эндотелиальный фактор роста - А 1.3 Васкулярный эндотелиальный фактор роста 165 (VEGF165)
1.4 Биологическая роль VEGF 165
2. ПРИМЕНЕНИЕ ВАСКУЛЯРНОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА VEGF 165 В МЕДИЦИНЕ
2.1 Терапевтический ангиогенез
2.2 Анти VEGF терапия
3. МЕТОДЫ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАТНОГО VEGF 165 ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО
3.1 Получение RHVEGF165 в эукариотической системе экспрессии
3.2 Получение RHVEGF165 в прокариотической системе экспрессии
4. МАТЕРИАЛЫ
5. МЕТОДЫ
6. ЭЛЕКТРОФОРЕЗ БЕЛКОВ В ПААГ
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
VEGF - сосудистый эндотелиальный фактор роста (Vascular endothelial growth factor)