Проточная цитометрия как метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции. Параметры клеток, регистрация флуоресценции. Неспецифическое связывание антител, гейтирование.
Аннотация к работе
Они включают множество задач, начиная от поиска наиболее информативных морфометрических и цитоспектрофотометрических критериев кинетики ДНК в клеточном цикле и кончая многопараметрическим изучением гетерогенных популяций исследуемых объектов. Для статической цитометрии могут быть использованы конфокальные микроскопы, а также более простые и дешевые системы анализа изображений, смонтированные на обычных люминесцентных микроскопах.Название метода связано с основным приложением, а именно, с исследованием одиночных биологических клеток в потоке. Основа метода заключается в: 1) использовании системы гидрофокуссировки, которая обеспечивает прохождение клеток в потоке поодиночке;Суспензия клеток под давлением подается в проточную ячейку, где за счет разности давлений между образцом и обтекающей жидкостью клетки, находясь в ламинарном потоке жидкости, выстраиваются в цепочку друг за другом (т.н. гидродинамическое фокусирование).Луч лазера, проходя сквозь клетку, многократно преломляется и рассеивается во все стороны. Регистрация этого излучения позволяет судить о сложности внутреннего строения клетки (соотношение ядро-цитоплазма, наличие гранул, других внутриклеточных включений). Основными типами таких красителей являются моноклональные антитела, коньюгированные с флюоресцентной меткой (FITC, PE, APC, PERCP и др.) для определения мембранных и цитоплазматических антигенов клетки, красители, позволяющие оценить жизнеспособность клеток (7AAD, PI) флуорофоры, связывающиеся с нуклеиновыми кислотами (DAPI, Hoechst), PH-чувствительные флуорофоры (Fluo-3), ион-зависимые флуорофоры (Indo-1). Проходя сквозь заряжающее кольцо, капля может приобретать положительный или отрицательный заряд в зависимости от того, какая клетка содержится внутри капли. Преимуществами сортировки клеток на проточномцитометре является высокая чистота получаемой популяции клеток (до 99.9% позитивных клеток в отсортированной фракции), возможность сортировать клетки по любым комбинациям детектируемых параметров.Короткое время анализа за счет высокой скорости (до 100 000 событий в секунду), анализ большого количества клеток (до 108 клеток в мл), определение субпопуляций клеток, измерение параметров редко встречающихся клеток, объективное измерение интенсивности флуоресценции.Иммунология: иммунофенотипирование клеток периферической крови, определение фагоцитарной активности (захват меченных флюорохромами бактерий или дрожжей), определение внутриклеточных цитокинов (спонтанная продукция и под действием различных специфических или неспецифических активаторов, таких как ФМА иономицин, ЛПС, ФНО-альфа), определение внутриклеточных белков, например транскрипционных факторов GATA-3, T-bet, FOXP3 для дискриминации CD4 Т-лимфоцитов, определение пролиферативной активности (выявление инкорпорированого бромдезоксиуридина), исследование клеточного цикла, оценка клеточной цитотоксичности. Онкология: количественный анализ внутриклеточных компонентов (ДНК), анализ стадий клеточного цикла, выявление анеуплоидного клона, определение пролиферативной активности анеуплоидного клона, определение специфических маркеров, позволяет проводить наблюдение пациентов, входящих в группу риска, оценка состояния иммунной системы, оценка клеточного звена иммунитета (определение субпопуляций лимфоцитов), оценка функциональной состоятельности иммунокомпетентных клеток (NK тест, фагоцитарный тест и т. п.). Цитология: определение цитоморфологической принадлежности клетки размер, соотношение ядро/цитоплазма, степень асимметричности и гранулярности клеток, оценка активности внутриклеточных ферментов с помощью флуорогенных субстратов, определение экспрессии поверхностных антигенов, анализ стадий клеточного цикла, измерение физиологических параметров клетки (внутриклеточный PH, концентрация свободных ионов Ca2 , потенциал наружной клеточной мембраны). В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определенных клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100-1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови.
План
Содержание
Введение
1. Проточная цитометрия
2. Принцип метода
3. Параметры, клеток регистрируемые при помощи проточного цитометра
4. Некоторые, термины, часто использующиеся в проточной цитометрии
5. Преимущества
6. Применение
Литература
Введение
Возможности применения методов количественной цитометрии в биологических и медицинских исследованиях очень широки. Они включают множество задач, начиная от поиска наиболее информативных морфометрических и цитоспектрофотометрических критериев кинетики ДНК в клеточном цикле и кончая многопараметрическим изучением гетерогенных популяций исследуемых объектов.
В настоящее время цитометрию принято подразделять на проточную и статическую. Первый вариант цитометрии осуществляется с помощью специальных приборов - проточных цитометров и сортеров. Для статической цитометрии могут быть использованы конфокальные микроскопы, а также более простые и дешевые системы анализа изображений, смонтированные на обычных люминесцентных микроскопах. Существует много методик, которые с одинаковым успехом можно воспроизводить как с помощью проточной, так и статической цитометрии. Более того, статическая цитометрия в некоторых случаях позволяет получить более обширную информацию о клетках, причем ее производительность не намного меньше проточной.
Список литературы
1. Davey H. Flow cytometry for clinical microbiology. CLI 2004; 2/3:12-5.
2. Shapiro H.M. «Practical Flow Cytometry», Alan Liss, .N.Y., 1985.
3. Принцип метода [Электронный ресурс]. - http://www.ckpgene.ru/left/protochnaya_citometriya/