Выбор высокоактивной в иммунологическом отношении модели вектора-носителя и клонирование соответствующего гена. Выбор системы экспрессии клонированного гена. Создание универсальных векторов для целевой доставки генов в клетки и ткани организма.
Аннотация к работе
.3 Выбор системы экспрессии клонированного гена, способной обеспечить максимальный выход и функциональную полноценность продуктаКонструирование рекомбинантных противовирусных вакцин предполагает: 1) получение соответствующего фрагмента нуклеиновой кислоты; 2) выбор высокоактивной и хорошо изученной в иммунологическом отношении модели вектора-носителя и клонирование соответствующего гена (или генов); 3) выбор системы экспрессии клонированного гена, способной обеспечить максимальный выход и функциональную полноценность продукта; 4) создание достаточно удобных и по возможности универсальных векторов для целевой доставки генов в клетки и ткани организма.Фрагменты ДНК для встраивания в вектор можно получить непосредственно из хромосомной ДНК, расщепив ее рестриктазами или разрушив случайным образом (например, с помощью ультразвука) на сегменты с примерно одинаковой длиной. Выделение генов с помощью "вырезания" из генома, как правило, состоит из четырех этапов: 1) получение клонотеки фрагментов генома; 2) выявление фрагментов генома, содержащих необходимый ген, и точная локализация гена в данном фрагменте; 3) вырезание гена из фрагмента(ов) с помощью рестриктаз и сшивка участков гена с помощью ДНК-лигазы фага Т4, если эти участки получены из различных фрагментов; 4) амплификация гена в составе векторной молекулы. Как правило, вместе с геном остаются фланкирующие его лишние нуклеотидные последовательности, что мешает дальнейшему использованию этого гена, или же рестриктазы отрезают часть гена, делая его функционально неполноценным. Данный способ включает в себя три этапа: 1) выделение высокоочищенных МРНК, кодирующих индивидуальные структурные белки, либо выделение геномных РНК вирусов; 2) синтез двухцепочечной ДНК (гена) на матрицах РНК; 3) амплификация гена с помощью методов молекулярного клонирования. В одном из вариантов выделение МРНК из инфицированных клеток проводят непосредственно из лизированных клеток (лизис осуществляют в денатурирующих средах в целях предотвращения разрушающего действия нуклеаз на МРНК) с последующей экстракцией фенолом и хлороформом или центрифигурированием лизата через подушку 5,7M CSCL (для освобождения от клеточных ДНК) и заключительной аффинной хроматографией на олиго(DT)-целлюлозе (поли(У)-сефарозе).Суть конструирования рекомбинантных ДНК заключается во встраивании фрагментов ДНК, среди которых находится интересующий нас участок ДНК, в так называемые векторные молекулы ДНК (или просто векторы) - плазмидные или вирусные ДНК, которые могут быть перенесены в клетки про-или эукариот и там автономно реплицироваться. На следующем этапе проводится отбор тех клеток, которые несут в себе рекомбинантные ДНК (с помощью маркерных признаков, которыми обладает сам вектор), и затем индивидуальных клонов с интересующим нас сегментом ДНК (используя признаки или пробы, специфичные для данного гена или участка ДНК). При решении ряда научных и биотехнологических задач конструирование рекомбинантных ДНК требует также создания систем, в которых обеспечивается максимальная экспрессия клонируемого гена. В первом случае 3"-концы фрагментов ДНК, среди которых находится интересующий нас участок ДНК (ген или его сегмент, регуляторный район), с помощью фермента терминальной нуклеотидилтрансферазы наращиваются гомополинуклеотидной последовательностью (например, поли (Т)). Во втором случае "липкие" концы создаются с помощью расщепления молекул ДНК (как векторной, так и содержащей интересующий нас фрагмент) одной из эндонуклеаз рестрикции (рестриктаз).Получение рекомбинантных РНК обычно осуществляют методами ферментативного или химического лигирования РНК. Кроме того, недавно появилась принципиально новая возможность встраивания сегмента РНК в заданное положение других молекул РНК с помощью рибозимов. Ковалентное сшивание отдельных сегментов РНК при получении рекомбинантных молекул, как правило, осуществляют с помощью Т4 РНК-лигазы. Т4 РНК-лигаза закодирована в геноме бактериофага Т4. При этом "стыковка" сегментов осуществляется с помощью олигодезоксирибонуклеотида, комплементарного 3"-концу одного сегмента и 5"-концу другого.Одновременно могут быть отобраны те клетки, которые содержат векторы со встроенными в них чужеродными ДНК (рекомбинантные ДНК). Другой весьма распространенный пример связан с наличием в векторной ДНК наряду с генами, сообщающими клетке устойчивость к антибиотикам, фрагмента лактозного оперона, обеспечивающего образование в клетках-реципиентах активного фермента b-галактозидазы. Если же в ген b-галактозидазы этого вектора встроена чужеродная ДНК таким образом, что этот ген оказался нарушенным, то трансформированные им клетки будут образовывать бесцветные колонии. В этом случае клетки высеваются на среду, лишенную вещества, необходимого для роста данного штамма, и только клетки, содержащие рекомбинантную ДНК с искомым геном, способны расти на этой среде.