Процессы переноса в биологических объектах. Электрогенез в клетках, потенциал покоя и действия. Механизм формирования ЭКГ человека. Моделирование пассивных электрических свойств тканей организма. Лазер, его применение для оценки размеров эритроцитов.
Аннотация к работе
ПРАКТИКУМ ДЛЯ ВУЗОВ ¦ниш Учебное пособиедля студентов высшихучебныхзаведений Практикум по биофизике: Учеб. пособие для студ. высш. Основная особенность книги - единый блок лабораторных и практических занятий, направленных наизучение физических ме тодовисследованиясвойств ихарактеристикбиологических объектов для дальнейшего использования полученных результатов в медицине.Антонова, включающего в себя учебник “Биофизика” и данный" практикум. Учебный комплекс “Биофизика” предназначен для студентов медицинских и фармацевтических ВУЗОВ, а также для студентов других специальностей высшей школы, изучающих курс “Биофизика”. Практикум состоит из семи глав, тематика части из которых (главы 1, 2, 4) отражена в учебнике “Биофизика”. Каждая работа содержит указания по подготовке к работе, необходимый теоретический ма/гериал, порядок выполнения работы, методы обработки результатов» контрольные вопросы. В практикум включены 33 работы, 17 из них выполняются в лабораториях на измерительных и медицинских приборах, остальные выполняются на персональных компьютерах в системе Win.cl.ows.Математически поток ионов описывается уравнением Нернста-Планка: 1М =-пкт (ас/ах)-ис%? (аср/ах), (1) где и-подвижность иона, И-газовая постоянная, Т - абсолютная температура, с-концентрация ионов, г - заряд иона в элементарных единицах заряда, Г - ПОСТОЯННАЯФАРАДЕЯ, &с/йх и с1ф/с1х-градиенты концентрации и потенциала. Таким образом, в начальный мо мент поток ионов К из клетки наружу 1нар определяется только диффузией: 1нар= =-икт (ас/ах). Тогда1М = 0 , т.е. всостоянии п о к о я (когда клетка не возбуждена) ток через мембрану не идет. Возникающая при этом разность потенциалов на мембране является потенциалом покоя ф™к, величину которого можно оценить по формуле Нернста: ~ПОК =--------1П [Е ]вн нар Что покажет вольтметр (клетка находится в состоянии покоя) вслучае замены аксоплазмы на межклеточную жидкость, а межклеточной жидкости на аксо плазму?В работе демонстрируются графики изменения Афм при различных внешних электрических воздействиях на мембрану. Покадрово вдинамике обсуждаются особенности графического построения потенциала действия аксона (кадр 13). Подробно показаны изменения Ма и К токов при деполяризации и реполяризации мембраны (кадр 14). Показаны как от дельные составляющие мембранного тока, так и суммарный ток через мембрану. Нарисуйте ионные токи через мембрану аксона, если потенциал на мембране равен 30 МВ и...: а) тетродотоксином заблокированы Ма -каналы; б) тетраэтиламмонием заблокированы К -каналы.В математике показывается, что вэтом случаедифференциальное уравнение (ПЗ) описывает затухающие колебания, а его решение имеет вид: у(1) = А2е Тасо8(ой 4-<р2), ГДЕ / т3= 2/(УЮ, а = Ч М В - 1 У (УК)2/4- Таtrialразом, практически всегдадискриминант В характеристического уравнения для к отрицателен, то есть уравнение (ПЗ) и система (Ш) описывают затухающие колебания. Фармакокинетическая модель описывает кинетику (изменение во времени) распределения введенных в организм препаратов (лекарств, индикаторов). Фармакокинетическая модельпозволяетвпределах определенных Допущений найти измененияконцентрации препарата во времени при различных способах его введения в организм, рассчитать оптимальное соотношение между параметрами ввода и вывода препарата для обеспечения необходимого терапевтического эффекта. Составление дифференциальных уравнений, описывающих изменение во времени концентрации лекарства в крови.Результаты измерений необходимо подвергнуть тщательному анализу и провести необходимую математическую обработку. Только после этого возможно сформулировать выводы относительно величин, представляющих интерес. На предстоящем практическом занятии Вы познакомитесь с од ним из методов обработки и графическим представлением экспериментальных данных - методом гистограмм, широко ис пользуемым в практике медицинских исследований.Многиепроцес сыв организмеявляютсяпериодическими»колебательнымипроцессам»; изменение биоэлектрической активности сердца, модаа,®пульсацииарте риальногодавления, биологическиеритмывотдельныхорганахжворга низме в целом. Знание характеристик, методики регистрации колебательных процессов и умение их анализировать могут быть жепользоважыстудеитамй какнаобщеобразовательныхкафедрах, такиприизученииспециальных дисциплин, например, при анализе энцефаллограмм, при изучении изменения гемодинамических показателей сердца и вомногихдругих случаях.
Список литературы
I*Антонов В«Ф, и др, Биофизика, —М.: Владос, 2000.
2. Марголис Л.Б., Бергельсон ЛД. Липосомы и их взаимодействие с клетками. —М.: Наука, 1986.
Подготовка к работе
При подготовке к лабораторному занятию изучить по реко мендованнойлитературе шуметь объяснитьследующие вопросы: 1. Жидкостно-мозаичная модель строения биологических мембран. Нарисовать и объяснить схему строения, объяснить роль фосфолипидного бисло^»
2. Основные функции биологических мембран. Объяснить основныефункции ираскрытьзначение селективной проницаемости биологической мембраны для жизнедеятельности, привести примеры.
3. Строение и применение модельных мембран — липосом. Нарисовать и объяснить схему строения, объяснить, как формируются липосомы, привести примеры их применения.
4. Осмотический методисследования проницаемости биологических мембран для различных веществ. Объяснить, как происходит водный обмен между клеткой и межклеточной жидкостью в гипотоническом, гипертоническом и изотоническом водных растворах веществ, непроникающих через мембрану, как меняются при этом размеры клеток.
5. Метод турбидиметрии. В чем состоит Явление рассеяния света? Уметь написать закон и начертить график ослабления интенсивности света при прохождении через рассеивающую среду в зависимости от толщины слоя. Объяснить, что такое коэффициент рассеяния, как он связан с оптической плотностью, от каких параметров он зависит? Как изменяется коэффициент рассеяния и оптическая плотность суспензии клеток при изменении размеров клеток и при изменении концентрации суспензии?
6. Порядок выполнения работы. Объяснить порядок измерений оптической плотности на ФОТОЭЛЕКТРОКОЛОРИМЕТРЕ. Ка кой вывод о проницаемости липидного бислоя для KCL, NACL и HGO можно сделать на основе исследовании суспензии липосом, проведенных в лабораторной работе?
6
Теоретические сведения
1. Согласно жидкостно-мозаичной модели строения биологических мембран (Сингер и Никольсон — 1972 год) структурную основу биологическоймембраны составляет двойной слой фосфолипидов, инкрустированный белками (рис. 1).
Рис, 1. Жидкостно-мозаичная модель мембраны
Различают интегральные белки (1) и поверхностныеили периферические (2).
В воде происходит самосборка двойного молекулярного фосфолипидного слоя вследствие того, что энергетически более выгодным является расположение полярной гидрофильной “головы” фосфолипидной молекулу наружу в сторону воды, а ее гидрофобного неполярного хвоста —внутрь слоя.
2. Различают три основные функции биологических мембран: 1) Механическая — обеспечиваетпрочностьи автономность клеток и внутриклеточных структур.
2) Матричная — обеспечивает определенное взаимное рас положение и ориентацию мембранных белков, обеспечивает их оптимальное взаимодействие (например, взаимодействие мембранных ферментов).
3) Барьерная — обеспечивает селективный, регулируемый, пассивны^ и активный обмен веществ клетки с окружающей средой (селективный —значит избирательный: одни вещества переносятся через биологическую мембрану, а другие — нет; регулируемой — проницаемость мембраны для определенных веществ меняется, в зависимости от функционального состояния клетки; активный — перенос от мест с меньшей кместам с большей концентрацией).
7
Вследствие активного переноса веществ и селективной проницаемости мекбраны создаются и поддерживаются градиенты концентраций — разные концентрации веществ внутри клетки и во внеклеточной среде, играющие огромную роль в жизнедеятельности. Например, градиенты концентраций ио нов калия и натрия на клеточных мембранах — необходимое условий генерации нервного импульса.
3, Липосомы — модельные везикулярные мембраны (везикула — пузырек). Липосомы образуются из суспензии фосфо липидов вводе. В воде происходит самосборка бимолекулярной фосфолитздной мембраны. При этом мембрана стремится принять сферическую форму с наименьшей поверхностной энергией (рис. 2).
При самосборке получаются в основном крупные много слойные липосомы (рис. 3), их
Рис. 2, Липосома (сферическая форма отличаемся от сферической. форма)
Однослойные липосомы можно получить воздействием на суспензию многослойных липосом ультразвуком. В на стоящее время разработано множество других методов по лучения однослойных липосом диаметром от 20 нм до микрометров и даже миллиметров. В настоящей работе предлагаются для исследования однослой ные липосомы, получейшме ме
Рис. 3. Многослойная липосома тодом обращения фаз* со сред ним диаметром 350 нм. Липосомы широко применяются не только как модельные объекты в научных исследованиях, но ж находят непосредственное практическое применение, напри мер , практикуется введение в организм лекарственных веществ, помещенных внутрьлипосом.
8
4. Осмотический метод изучения проницаемости биологических мембр"ан основан на наблюдении изменения объема клеток при помещении их врастворы исследуемых веществ.
Осмос — преимущественное движение молекул раствори теля через полупроницаемую мембрану (непроницаемую для растворенного вещества и проницаемую для растворителя) из мест с меньшей концентрацией растворенного вещества в ме ста с большей концентрацией. Осмос играет большую роль во многих биологических явлениях. Явление осмоса обусловливает гемолиз эритроцитов в гипотонических растворах. Ос мос используется в терапии, например, действие некоторых сильных слабительных основано на создании в желудочном тракте повышенной концентрации растворенного вещества и осмоса в него воды.
Клетки животных и растений содержат растворы солей и других осмотически активных веществ (для которых проницаемость биологической мембраны меньше, чем для воды).
Если клетку поместить вгипотонический раствор (рис. 4а), то объем клетки увеличивается за счет осмоса воды в клетку. а б в
Рис. 4 Изменения размеров клеток при осмосе (Стрелки показывают направление осмоса)
В гипертоническом растворе объем клетки уменьшается вследствие осмоса воды из клетки (рис. 46).
В изотоническом растворе объем клетки не меняется, так как не происходит осмоса (ряс. 4в).
Помещая клетки: в растворы различных веществ (гипертонические или гипотонические по отношению к внутриклеточной жидкости), по наличиюили отсутствию осмотического эффекта, приводящего кизменению размеров клеток, можно сделать вывод о непроницаемости шли проницаемости мембраны
9 для растворенного вещества и для воды. Если наблюдается осмотический эффект, мембрана непроницаема (или плохо проницаема) для растворенного вещества и хорошо проницаема для растворителя.
Рис. 5 Изменение интенсивности света при рассеянии
Изучение рассеивающей среды, основанное на исследова ниирассеянного света: его интенсивности 1р, спектра, поляризации и т.д. называется нефелометрией (от греческого нефе-лос — обдако). Нефелометрия дает возможность определять концентрацию, размер, форму диспергированных частиц в дисперсных системах.
Турбидиметрия ^ЙГЫСЙЗ — мутный) основана на измерении интенсивности прошедшего света 1 = 10 — 1РЭОСЛАБЛЕННОГО вследствие рассеяния» Характеристикой светорассеяния в этом методе служит коэффициент рассеяния а (рис. 5) илш оптическая плотность суспензии: 30-11 — - 0,48 а1
1о
I
Коэффициент раtrialия, а следовательно, и оптическая плотность зависят от размера частиц и их формы, от длины волны света, от конtrialации частиц»
Коэффициент рассеяния и оптическая плотность прямо пропорциональны концентрации: суспензии а: В « А • д, где А — коэффициент9не зависящий от концентрации» Установлено, что с увеличением длины волны %коэффициент рассеяния и оптическая плотность среды уменьшаются»
10
Зависимость коэффициента рассеяния от размеров частиц сложная. Если диаметр рассеивающих частиц значительно меньше длины волны, то при увеличении размера частиц рас сеяние увеличивается. Это наблюдается, например, при набухании малых лидосом диаметром 20—40 нм. Однако для частиц, размеры которых сравнимы с длиной волны, увеличение размеров дриводит к уменьшению рассеяния, а уменьшение размеров — к увеличению рассеяния.
Для суспензии лидосом диаметром 300—400 нм дри их набухании наблюдается уменьшение коэффициента рассеяния и соответственно оптической плотности. Принято считать, что для липосом такого размера оптическая плотность В обратно пропорциональна их объему: в - - , К
V где К —некоторый коэффициент, не зависящий от объема.
Выполнение работы
Перед началом выполнения работы повторите методику определения оптической плотности при помощи колориметра-турбидиметра.
Задания 1 и 3 выполняются с фиолетовым светофильтром (см. задание 2).
Задание 1» Провести исследование изменения во времени оптической плотности суспензии липосом, помещенных в гипотонический и гипертонический растворы.
Подготовьте таблицу для записи экспериментальных данных: I,мин. О 1 2 3 ... ... ’ ” 0
1) Налейте в измерительную кювету 2 мл (до нижней метки на боковой стенке кюветы) суспензии липосом, приготовленных на водном растворе КС1концентрацией 20 ммоль/л.
2) Долейте в кювету6 млдистиллированной воды(до второй снизу метки), быстро размещайте стеклянной палочкой и поместите вфотоэлектроколориметр.
3) Найдите зависимость оптическойплотности от времени и полученные дайные занесите в таблицу. Измерения производятся до установления постоянной во времени оптической плотности.
Б. В гипертоническом растворе.
4) Долейте в ту же кювету с суспензией липосом (разведен ной водой при выполнении задания А) 2 мл (до верхней метки на боковой стенке измерительной кюветы) раствора ЫАС1концентрацией 0,5 моль/л и, быстро размешав стеклянной палочкой, Поместите кювету вфотоэлектроколориметр.
5)Снимите зависимость оптическойплотности суспензии от времени и полученныеданные занесите в таблицу. Измерения производятся до установления постоянной во времени оптической плотности.
6) По полученным данным найдите зависимость относи тельного изменения объема 4Х от времени, где ДУ = У —У0, V —’объем липосом вданный момент времени, У0 — объемлипосом"при первом измерении, в момент времени 1= 0 (см. задачу).
Постройте график “У = Д*)
Д
....
ЩТАРТОАЖЧВСОТЙ 0 растворы
Ш
На основе полученных результатов сделайте вывод о проницаемости липосом для Н20 й для ионов К , СП» Ма .
Задача. Примем, что оптическая плотность липосом больших размеров, соизмеримых с длиной волны (в нашем случав средний диаметр липосом «350 нм) обратно пропорционален объему липосом: в - , где К —коэффициент не,зависящий от объема.
Докажите, что относительное изменение объема липосом А? т
0 0, где АО= Б — В0, В — оптическая плотность в данный мо мент времени, а В0 — значение оптической плотности, полученной в первом измерении для 1;—0.
Решение задачи. Если О= у »то 1ПВ= 1ПК — 1ПУИ ) = с!( ПК — ЬУ)
1
1
1 откуда <Ш ЙУ в V и dv _ СЮ
V ~ "Б"
(а( ПК) = о).
1
Приближенно для небольших изменений объема ДУИ оптической плотности ДБМОЖНО принять
ДУ ДБ
У0 о 0
Относительное увеличение объема липосом равно относи тельному уменьшению оптической плотности, аотносительное уменьшение объема липосом равно относительному увеличению оптической плотности.
Задание 2. Исследовать зависимости оптической плотности суспензии липосом от длины волны.
18
Измерьте оптическую плотность суспензии липосом, оставшуюся после выполнения задания 1 при различных светофильтрах. Данные занесите втаблицу: Светофильтр _________ ____ ________ ____________________ ____________
X, нм
Р ________
Постройте график зависимости В = ?(X): В 4
X,нм
На основе данных, полученных при выполнении задания 2, дайте обоснование выбора светофильтров в заданиях 1и 3.
Задание 3. Исследовать зависимость оптической плотности суспензиилипосом от ее концентрации.
Подготовьте таблицу: п п0/8 п0/4 по/2 по 0
1. Отлейте от суспензии, использованной в задании 2, 1/2 объема (5 мл).
2. Долейте в крвету до верхней метки изотонический раствор (ОД моль/л ]?С1).
3. Измерьте оптическую плотность при концентрации липосом в суспензии п0/2 (с фиолетовым светофильтром).
Аналогичнопроведитеизмерения оптическойплотностису-сцензии липосом при концентрациях суспензии и0/4 и п0/8. Данные занесите в таблицу.
Постройте график зависимости В ~ ?(п), В 4 Толщинакюветы
Длина волны п X-..*
14
Задача. Принимая, что оптическая плотность суспензии , прямо пропорциональна ее концентрации
В А • п, где А —коэффициент, не зависящий от п, докажите, что относительное изменение концентрации
Ап АВ
После окончания работы тщательно промойте измерительную кювету дистиллированной водой.
1*2«Изучениеактивного транспорта ионов вэксперименте
Акtrialй транспорт вещества — перенос их от мест с меньшим значением к местам с большим значением электрохимического потенциала — играет важную роль в жизненных процессах. Активный перенос ионов калия и натрия — необходимое условие для генерации биопотенциалов. Активный транс порт протонов играет важную роль в биоэнергетических процессах, аионов калия *— впроцессах мышечного сокращения.
Цель работы: 1. Наблюдение активного транспорта ионов натрия через кожу лягушки.
2. Изучение зависимости активного транспорта ионов натрия от ингибирования обмена веществ.
Литература: Антонов В.Ф. и др. Биофизика. — Владос, 2000.
Изучить по рекомендованному учебнику следующие вопросы: 1. Электрохимический потенциал.
2. Пассивный и активный транспорт. 3. Уравнение Теорелла.
4. Закон Фика.
15
5. Опыт Уссинга.
6. Виды ионных насосов, их роль в функционировании живого организма.
Теоретические сведения
Активный транспорт веществ. Активный транспорт — это перенос вещества из мест с меньшим значением электро химического потенциала в места с его большим значением (рис. 1).
М-1 ^ М2
^1 т 2 • •
¦1"т^Г шттшвтшт^ ^ шшшттшшшт1шшт‘ направление активного транспорта
Рис. 1 Схема активного транспорта
Активный транспорт в мембране сопровождается ростом ЭНЕРГИИГИББСА, оннеможет идти самопроизвольно, атолько в сопряжении с процессом гидролиза аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), то есть за счет затраты энергии, запасенной в макроэргических связях АТФ.
Опыт Уссинга. Существование активного транспорта ве ществчерез биологические мембранывпервыебылодоказано в ОПЫТАХУССИНГА(1949 г.) напримере переносаионовйатрия че рез кожу лягушки (рис. 2).
Экспериментальная КАМЕРАУССИНГА, заполненная нормальным раствором Рингера, была разделена на две части свеже изолированной кожей лягушки. На рис. 2 слева — наружная мукозная поверхность кожи, справа —внутренняя серозная. Наблюдалисьпотокиионовнатриячерез кожу лягушки: слева направоот наружнойквнутреннейповерхностии справанале во от внутренней к наружной поверхности.
Из уравнения Теорелла, описывающего пассивный транс порт, следует уравнение Уссинга-Теорелла для отношения этих потоков в случае пассивного транспорта: 16
Накоже лягушки, разделяющей раствор Рингера, возникает разность потенциалов (срвн — Фдар) — внутренняя сторона кожи имеет положительный пртенциал по отношению к наружной). В установке Уссинга (рис* 2) имелся блок компенсации напряжения, с помощью которого устанавливалась разность потенциалов на коже лягушки, равная нулю, что контролировалось вольтметром.
А 151
*
)
Рис. 2. Схема опытов Уссинга (А—амперметр, Vt~ вольтметр, Б —батарейка, П— потенциометр) trial того, поддерживалась одинаковая концентрация ио нов с наружной и внутренней стороны Снар = Свн.
При этих условиях, если бы перенос натрия через кожу лягушки определялся только пассивным транспортом, то согласно уравнению Уссинга-Теорелла потоки ]ш?вн и Зт>нар были бы равны друг другу: ^т,вн =а ^т,нарв
Суммарный поток через Мембрану был бы равен нулю. Однако обнаружено с помощью амперметра, что в условиях trial (отсутствие градиентов электрического потенциала и концентрации) через кожу лягушки течет электрический ток I, следовательно происходит односторонний перенос заряжен ныхчастиц. Установлено, чтоток через кожу течет отвнешней среды к внутренней.
Методом меченых атомов было показано, что поток натрия внутрь больше потока наружу 1т,вп > ^т,НАРВДЛЯ этого вле вый раствор экспериментальной камеры были включены радиоактивные изотопы Ыа22, а в правый — Ыа24. Изотоп Ма22 распадается с излучением жестких у -квантов. Распад Ыа24 сопровождается мягким (3-излучением. Регистрация у и р-излучения показала, что поток Ыа22 больше потока Ш24.
Эти экспериментальные данные неопровержимо свидетельствовали о том, чтоперенос ионов натрия через кожу лягушки не подчиняется уравнению пассивного транспорта. Следовательно, имеет место активный перенос.
Согласно современным представлениям, в биологических мембранах имеются ионные насосы, работающие за счет энергии гидролиза АТФ — специальные системы интегральных белков (транспортные АТФ-азы)*
В настоящее время известны три типа электрогенных ионных насосов, осуществляющих активный перенос ионов через мембрану(рис. 3).
2К АТФ АДФ АТФ АДФ АТФ АДФ а б в
Рис. 3. Виды ионныхнасосов: а—К -Ма -АТФАЗА в цитоплазматических мембранах (К -Ыа -насос); б — -Са2 -АТФАЗА (Са^-насос), в— Н -АТФАЗА
.вэнергосопрягающих мембранах митохондрий, хлоропластов (М -насос, или протонная помпа)
Перенос ионов транспортными АТФ-азаэди происходит , вследствие сопряжения процессов переноса с химическими реакциями за счет энергии метаболизма клеток.
При работе К -Ма -АТФ-азм за счет энергии, освобождающейся пригидролизекаждой МОЛЕКУЛЫАТФ, вклеткуперено ситсядваионакалияиодновременно из клеткивыкачиваются
18 три иона натрия. Таким образом, создается повышенная, до сравнению с межклеточной средой концентрация в клетке ио нов калия и пониженная —натрия, что имеет огромное физиологическое значение.
В Са2 -АТФАЗЕ за счет энергии гидролиза АТФ переносятся два иона кальция, АВН -помпе —два протона.
Выполнение работы
Опыты проводятся на коже лягушки. Кроме этого опыты могутпроводиться на мочевомпузыре лягушки, слизистой желудка и кишечника.
Необходимые приборы и принадлежности: милливольт™ метр типа РН-340 (или ЛПУ-01, или ЛПМ-60), микроамперметр типа М-24 (или М-95), батарея БАС-Г-45, потенциометр, четырехклеммные ключи, 2 каломельных и 2 хлорсеребря-ных электрода, микрокомпрессор, камера Уссинга, препаро вальный инструмент, раствор Рингера для холоднокровных, ванночка для препаровки, стаканчики, глазные пипетки и крупные лягушки.
Задание 1. Монтаж схемы.
На первом этапе выполнения работы собирается электрическая Схема установки всоответствии с рис. 4.
Батареядолжнаподключатьсявцепьтокас помощьютумбле ра. Нормальное положение тумблера — “выключено”. РН-метр включается по схеме работы вольтметра со шкалой ±100 МВ. Шкалумикроамперметранужноотградуироватьна500 микроам-цер. Каломельныеэлектроды должны быть свежезаполненными, акончикиих находитьсявнепосредственнойблизости от кожи.
Параэлектродов должнабытьсимметричной, а разность потенциалов между ними не превышать 2-3 МВ. Токовые электроды представляют собой хлорированные серебряные проволочки. Для того, чтобы избежать значительной поляризации этих электродов, их необходимо перед опытом хлорировать.
Задание 2. Измерение потенциала кожи. Лягушкуобездвиживаюти осторожно с брюшной поверхности вырезают лоскут кожи. Лоскут должен иметь круглую
19 2* батарея микроамперметр н|!|11Н>Ь-----0-"---1 Ч Г Г Р МКА
1 1 ключ
А потенциометр кожа лягушки
1------------0 — -— 1 милливольтметр ключ
Рис. 4.Электрическая схемаустановки для измерения тока короткого замыкания вкоже лягушки форму и быть достаточным,чтобы полностью закрыть отвер стиемежду двумяотделениями камеры. После препаровки лоскут нанесколькоминут помещают в раствор Рингера (для холоднокровных).
Затем приступают к монтажу камеры. Кожу помещают между двумя резиновыми прокладками и вставляют в зазор , находящийся в середине камеры. После установления пре парата кожи, поджимными винтами сдвигают обе частика меры так, чтобыкожа былаплотно фиксирована в централь ной части камеры. Через отверстие в камере заливают раствор Рингера, причем необходимо заливать раствор небольшими порциями сразу в обе части камеры так, чтобы кож а не выгибалась в результате неравномерного заполнения камеры. Необходимо следить за отсутствием пузырей воздуха в камере, особенно в области электродов для отведения потенциала.
Если пузыри обнаружатся, их следует удалить путем плавного покачивания камеры.
После окончания монтажа камеры и заполнения ее включают милливольтметр и производят измерение потенциала
20 кожи. Обращают вцимание на полярность потенциала. Записывают значение потенциала кожи втечение 30 минут (через каждые 5 минут) и результаты представляют в виде графика: величина потенциала кожи по оси ординат и время по оси абсцисс.
Как было сказано выше, потенциал кожи создается натрие вымнасосом и, впринципе, его величина должна бытьравной ЭДС натриевого насоса. Однако в действительности транспорт анионов СГ"(рис, 5) шунтирует ЭДС натриевой помпы иреаль ная величина потенциала кожи всегда ниже значения натриевой ЭДС.
Для того, чтобы увеличить потенциал кожи и приблизить его величину к значению ЭДС натриевого канала насоса необходимо, очевидно, уменьшить хлорную проницаемость кожи. Анионы СГ перемещаются до межклеточным пространствам. Для уменьшения хлорного переноса по межклетникам используют способность некоторых веществ “дубить” кожу. Таким дубящим веществом может быть медный купорос.
Для проведения опыта в обе части камеры добавляют раствор медного купороса на растворе Рингера в конечной концентрации 1 ММ. Регистрируют изменение потенциала кожи и убеждаются в увеличении потенциала кожи в присутствии ионов меди.
Включают токовую цепь и компенсируют потенциал кожи до нуля. Измеряют ток компенсации и записывают его значение. Отключают токовую цепь, измеряют потенциал кожи и записывают его значение. Измерения проводят каждые 5 ми нут втечение 40 минут и записывают втаблицу: Время(мин) Потенциал кожи (МВ) Ток короткого замыкания (МКА)
Натриевыйнасос кожи лягушки в значительнойстепени за висит от энергоснабжения клеток кожи и, вчастности, от ко ЛИЧЕСТВААТФ и скорости ее синтеза.
Уменьшение скорости СИНТЕЗААТФ можно добиться исполь зованиемклассическогоразобщителя окислительногофосфори-лирования2,4-динитрофенола. Дляпроведенияопытавобечас ти камеры добавляют 2,4-динитрофенол, разведенный на рас ТВОРЕРИНГЕРА вконечной концентрации 1ММИ наблюдают бы строе падение тока, из чего следует вывод озависимости натриевого активноготока отуровня СИНТЕЗААТФВ клетках кожи.
Угнетение метаболических процессов в клетке может быть достигнуто воздействием низкой температуры. Известно, что понижение температуры на каждые 10°С сопровождается замедлением метаболическихреакций в 2—4 раза.
Для выполнения этого задания готовят новый препарат ко жи, араствор Рингераперед опытом охлаждают в холодильнике до 1- 2°С. Монтируют препарат кожи, заливают камеру охлажденным раствором Рингера и производят измерение то ка короткого замыкания. Убеждаются в значительном падении токакороткогозамыкания по сравнениюснормальной величиной, определенной в задании 3.
Явление диффузии наблюдается вкаждой живой клетке биологических систем; без него невозможно нормальное функционирование живой системы.
Явлению диффузии принадлежит важная роль, наряду с другими явлениями пассивного (фильтрация, осмос) и активного (реабсорбция) транспорта, в процессах, происходящих в основном выделительном органе нашего организма — почках.
На явлении диффузии основана лечебная процедура “диализ”, которая осуществляется на физической модели почки — аппарате “Искусственная почка”.
Поэтому знание явления диффузии необходимо будущему врачу для более глубокого понимация процессов пассивного транспорта веществ через мембранные структуры живых клеток и принципа работы аппарата “Искусственная почка”.
Цель работы: 1. Научиться объяснять законы, описывающие явление диффузии.
2. Научиться объяснять устройство и принцип действия диализатора, являющегося основным узлом аппарата “Искусственная почка”.
3. Изучить процесс диффузии вдиализаторе.
Литература: Антонов В.Ф. и др. Биофизика. —М.: Владос, 2000.
Подготовка к работе
Изучить по рекомендованной литературе и уметь объяснять следующие вопросы: 1. Диффузия воткрытомпространстве. Электрохимический потенциал, градиент электрохимического потенциала, градиент концентрации, градиент электрического потенциала.
23
2. Уравнение Теорелла. Уравнение Нернста-Планка. Закон
Фика.
3. Диффузиячерез мембрану. Закон Фикадля этого случая. Полупроницаемая мембрана.
4. Диализ. Диализатор* Устройство и принцип работы диализатора.
Теоретические сведения
Диффузия заряженных частиц в открытом пространстве — это явление переноса этих частиц из одной части объема в другую в направлении падения электрохимического потенциала р вследствие теплового хаотического движения молекул.
Электрохимический потенциал р — величина, численно равная энергии Гиббса одного моля данного вещества, помещенного вэлектрическое поле. Для слабых растворов р выражается формулой: Р - Но RT&IC ZF ср; р (Дж/моль) (1) где
(р—потенциал электрического поля; z —заряд иона;
F —число Фарадея, равное заряду одного моля одновалентных ионов;
С—концентрация;
R —универсальная газовая постоянная; Т —температура;
|
10 — постоянная, равная энергии моля раствора, при С = =*1 МОЛЬ/ЛИ ф “ 0.
(2) dp/dx определяется тремя градиентами: градиентом электрического потенциала dcp/dx, градиентом концентрации DC/d& и градиентом d^o/dx. dx С dx dx
Диффузия относится к пассивному транспорту веществ, то есть, идет без затраты энергии и приводит к уменьшению и ис
24 чезновениюар/ах (аследовательно, всех трех градиентов) и выравниванию электрохимического потенциала во всем объеме.
Уравнение Теореллаописываетдиффузию заряженных частиц и имеет вид: ар моль где <1т ^ —плотность потока заряженных частиц; и —подвижность частиц;
С—концентрация;
ар /6.x —градиент электрохимического потенциала. Знакминус показывает, что поток направлен в сторону убы вания р.
Уравнение Нернста-Планка — это частный случай уравнения Теорелла для однородной среды (|10 ф ?(х), с1|а0/с!х = 0). В этом случае градиент электрохимического потенциала имеет вид: ар = кт ас аср (4)
Л _ _ ах с ах ах
Подставляя (4) в (3), получим уравнение Нернста-Планка: ------ XJCZF ~ х . (5) ас аф
• ах а — - ПСГГ
Закон Фика описывает диффузию незаряженных частиц и является частным случаем уравнения Нернста-Планка при 2*0 или Аф= 0.
Подставляя аф/ах = 0 в (5) получим: ас ах
Так как ПЕТ = В (коэффициент диффузии), имеем: 0Т” * (6а) ас ах
Для потока диффузии Фт закон Фика имеет вид: Ф т"3*Гт *8 = Ч0*8 ас ; [Фт ] = моль/с, (7)
/ ах где 8 —площадь, перпендикулярная направлению потока.
25
Рис. 1 Распределение концентрации вещества в случае полупроницаемой мембраны
Рассмотрим диффузию через мембрану. Закон Фика для этого случая.
На рис, 1представлена биологическая мембрана.
По одну сторону мембраны раствор имеет концентрацию С^, по другую —*С *Толщина мембраны —I. Внутри мембраны концентрации у одной поверхности мембраны и С“ У другой; С* ФС1?и С |* С , так как природа растворов, омывающих мембрану, отличается от природы мембраны.
2
2
Отношение концентраций: с | = с |
С1 с2 ’ где к —коэффициент распределения, который зависит от при роды вещества мембраны, веществ, омывающих мембрану и рода диффундирующих частиц.
Коэффициент распределения к может быть рассчитан следующим образом. После окончания диффузии, при наступлении равновесия выравниваются химические потенциалы в растворе (1ХИМ и в мембране |хх^м ( в случае, когда фм= ФР, ТОЕСТЬАФ —0): Р"ХИМ Нхим»
КТ1ПСР= ц“ КТМСМ, 26
СМФСР, так как |іі^Фцр
|ір- = КТ(/ПСМ - ?ПСР)
Отсюда нтіп ср Следовательно к = - ^ = ехр(ЦР-^)/К Т
Отсюда С5*= КС^ С??= КС2. Если С}1ФС??внутри мембраны создается градиент концентрации: с!См С |-С ^ dx I к(С2- С г)
I
(8)
Подставляя (8) в (6а) получим закона Фика для диффузии \ через мембрану: ^ = (С2-С1) = р(С1-С 2), (9) где р = Б •к/1 —коэффициент проницаемости мембраны. Если р = 0 для какого-то вещества, то мембрана непроницаема для данного вещества. Мембрана называется полупроницаемой, если для одних веществ р = 0, а для других веществ РФ0.
Диализ —это явление избирательной диффузии через полу проницаемую мембрану. Диализ используется для разделения опорная пластина опорная пластина полупроницаемые
Рис. 2. Схема диализатора
27 в растворе высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ, вчастности, для внепочечного очищения крови от токсических веществ (гемодиализ) у больных с острой и хронической почечной недостаточностью.
Диализатор — это основной узел аппарата “Искусственная почка”, предназначенный для однократного применения. Упрощенная модель диализатора пластинчатого типа ДИП-02 представлена на рис. 2«
Принцип работы диализtrial*
В диализаторе полупроницаемая мембрана с одной стороны омывается кровью, а с другой — диализатом (водным раствором, по ионному составу идентичным составу безбелковой плазмы крови).
За счет наличия градиента концентрации токсических веществ между веществом крови и диализатом происходит диффузия низко- и среднем&лекулярных токсических веществ из крови в диализат через полупроницаемую мембрану.
При выравнивании концентраций токсических веществ в кровиивдиализатепроцесс диффузии прекращается, поэтому
Рис. 3. Блоксхема установки
28 для полного очищения крови диализат нужно менять» Полу проницаемая мембрана не пропускает высокомолекулярные вещества (белки и форменные элементы крови), поэтомусодер жание их в крови не изменяется.
Выполнение работы
1. Описание установки и подготовка установки к работе. Блоксхема установки представлена на рис, 3. Рчищаемой жидкостью (вместо крови) служит водный раствор КАС1 ([МАС1] = моль/л), а диализатом —водопроводная вода. Перед началом работы необходимо включить ионометр ЭВ-74 и под готовить диализатор к работе.
Включение иономера. а) При выключенном тумблере “сеть”нажать кнопки: “анионы/катионы”, “РХ”, “-1 4”. б) Ручки “РХ” и “температура” установить в крайнее левое положение. в) Поместить электроды в чистую водопроводную воду и подключить вспомогательный электрод к гнезду “всп”, измерительный — к гнезду “изм”. г) Включить прибор в сеть и дать ему прогреться в течение 30 минут.
2. Подготовка диализатора к работе. а)Сначаладля очищения пространствадиализатав воронку (см. рис. 3) наливается чистая водопроводная вода (200 мл), которая свободно вытекает встеклянную емкость. б) Затем заполняется пространство, по которому должна двигаться кровь, очищаемым раствором КАО с концентрацией 1моль/л. Для этого открывается зажим выводадля очищаемого раствора, поднимается вверх емкость с очищаемым раствором и пропускается 200 мл растворав свободную емкость. После этого зажим закрывается, аемкостьсраствором опускается настол.
3. Калибровка иономера. а) Поместив электроды в раствор КАС1 с концентрацией 1 моль/л ручкой “калибровка”установить стрелку на деление “0” шкалы “-1 4”. б) После этого электроды промыть и поместить в чистую воду.
29
Задание 1. Определение зависимости концентрации МАС1 в диализате от времени.
Сначала измеряется РМА чистой водопроводной воды с по мощью иономера ЭВ-74 по шкале “~-1 4” и заносится в таблицу. Затем в пространство, по которому движется диализат, вливается 200 мл чистой водопроводной воды и начинается процесс диффузии. Вода свободно вытекает из другого отверстия в отдельную чистую емкость и в ней определяется РМА. Затем эта порция воды (диализата) снова вливается в пространство диализата и процесс диффузии продолжается. После вытекания снова измеряется в нем РМА. Эта процедура повторяется 4 раза.
Данные измерений заносятся в таблицу: № измерения коу 2(П) 3(21) 4(31) 5(4!) РЫА
[ЫАС1]диап
По полученным данным РМА проводится расчет концентрации [МАС1] с помощью микрокалькулятора по формуле: 1 ЮРМА
Затем строятся графики зависимостей РЫА = ?(№ измер.) и [КАС1]диал = ?(№измер.). Каждый №измерения —определенный отрезок времени диффузии (11, 21, 31, 41).
Задание 2. РАСЧЕТЗАВИСИМОСТИСДИАЛ= 1(1) ипостроение гра фикаэтой зависимости.
Для выполнения этого задания необходимо использовать решение дифференциального уравнения, полученного в приложении.
-"диал(^) 3 5 ^ " -0,35^ а) Провести расчет, считая С0—1моль/л. Результаты записать в таблицу.
№ измерения 0 2 4 6 8 10 Сдиал(моль/л)
30 б) Построить график зависимости Сдиал = ?(1). Приложение*Математическая модель процесса диффузии через мембрану диализатора.
Составим дифференциальное уравнение для случая диффузии вещества через мембрану диализатора, используя уравнение диффузии (закон Фика)»
<!МАХУ _ <!С
(11 с!х
(1) где т оч — количество вещества КАС1 в очищаемом растворе, 8 —площадь мембраны.
(Вдальнейшем индексы (ЫАС1) и (Н20) опускаем.) Так как <1х===1, где 1—толщина мембраны, а ас - к(с „ - сда„) - уоч удиал можем записать: В •8 *к т лгг т диал
’ ^ ^ ^диал
(2) где Уоч — объем растворителя в очищаемом растворе, Удиал — объем диализата (Н20), к —коэффициент распределения, ШДИАЛ —количество вещества МАС1врастворе диализата. Введем обозначение М0—количество вещества МАС1 в очищаемом растворе перед началомдиализа. Тогда можно записать: т диал 5=3М 0“ т оч.
Подставив это выражение в уравнение (2) получим уравнение модели диализа: йшоч В* Б-к
^ ^ точ (М0—т оч) (3) ^оч ^диал
Решение модели диализа для шоч имеет вид: V V т « М ».:.од—. ж . . уоч ~ удиал у оч
ОЧ у у у где .. Ы»к Уоч 1 ? диал
Л11
У
5
31
Используя решение модели диализа, можем выразить концентрацию вещества вобъеме диализата: п
Чциал - ШДИАЛ
*диал у
= ____^ 0 ______ . и _„-АЦ
?оч ^ *диал и е
Обозначив Мо/Уоч = С — концентрация очищаемого рас твораперед началомдиализа, получим решение модели диализа для Сдиал: 0
Сдиал = 0 04 •(1 - е-А^. у оч ~ удиал диал . "у
4 7
, л т
Подставляя в решение модели для Сдиал числовые значения входящих вформулу величин: Б = 1,1 •10~9м/с; в = 1 м2; /=10-4 м. = 70 мл; Удиал= 150 мл, получим: Сдиал(1)=-0-(1-е-О .8б1). ¦
2. Электрическая активность биологических объектов
2.1. Электрогенез в клетках. Потенциал покоя, потенциалдействия
В работе изучаются методы регистрации и механизмы формирования потенциала покоя и генерации потенциала действия ваксоне.
Одна из важнейших функций биологической мембраны — генерация ипередача биопотенциалов.Это явление лежит вос нове возбудимости клеток, регуляции внутриклеточных процессов, работы нервной системы, регуляции мышечного сокращения, рецепции. В медицине на исследовании электрических полей, созданных биопотенциалами органов и тканей, ос нованыдиагностические методы: электрокардиография, электроэнцефалография, электромиография и другие. Практикуется и лечебное воздействие на ткани и органы внешними электрическими импульсами при электростимуляции.
V
*
Цель работы: 1. Научиться объяснять микроэлектродный метод измерения биопотенциалов.
2. Научиться объяснять в рамках электродиффузионной теории природу потенциала покоя и уметь рассчитать его вели чину по заданным концентрациям ионов, *
3. Научиться объяснять процесс генерации потенциала действия. Уметь начертить его график. Уметь рассчитать величину потенциала реверсии и потенциала действия по заданным концентрациям ионов.
4. Научиться объяснять жизображать графически ионные потоки через мембрану в процессе возбуждения клетки.