Використання модифікованого методу Seglen у процесі виділення гепатоцитів. Можливий вплив речовин і ацетамінофену на активність АЛТ в інкубаційному середовищі гепатоцитів. Дослідження антиоксидантної активності синтетичних потенційних інгібіторів JNK.
Аннотация к работе
Проведено дослідження JNK-інгібуючої активності синтезованих речовин - похідних 4-N-ариламінозаміщених хіназолінів на тлі введення активатора JNK ацетамінофену in vitro. Встановлено, що речовина 006 (6,7-диметокси-4-N-(4-ціанофеніл)амінохіназолін) зменшує вміст фосфорильованої JNK, тобто попереджає її активацію.С-jun N-кінцеві кінази (JNK) - ферменти, що беруть участь у передачі сигналів від клітинної мембрани до ядра та апарату генної транскрипції та відіграють ключову роль у розвитку багатьох захворювань людини, зокрема, різних видів пухлин, сер-цево-судинних розладів, діабету, шизофренії, порушень імунітету [9, 10]. Отримані експериментальні докази підтверджують наявність тісного звязку між активацією JNK та розвитком патологічних станів, повязаних з інсулі-норезистентністю клітин, таких як ожиріння, атеросклероз, цукровий діабет [10]. При виконанні експериментів дотримувались «Загальних етичних принципів експериментів на тваринах» (Україна, 2001), гармонізованих із «Європейською конвенцією про захист хребетних тварин, які використовуються для експериментальних та інших наукових цілей» (Страсбург, 1985). Середовище інкубації гепатоцитів містило активатор JNK ацетамінофен (АРАР) у концентрації 2,5 ММ та досліджувані речовини в концентраціях 25, 50 або 100 МКМ, або тільки досліджувані речовини. На першому етапі досліджень визначали вплив досліджуваних речовин на активність АЛТ у культуральному середовищі гепатоцитів, а також їх дію на досліджуваний показник у присутності гепатотоксину APAP.Таким чином, проведені дослідження показали: застосування специфічного інгібітора JNK антрапіра-золону SP600125 зменшує активність АЛТ у середовищі інкубації гепатоцитів з АРАР [6]. • Сполука 006 зменшує активність АЛТ в інкубаційному середовищі гепатоцитів на тлі дії АРАР та зменшує вміст р-JNK на тлі введення АРАР. Отримані дані свідчать про те, що деякі з досліджуваних речовин (001, 002 і 005) виявляють антиоксидантні властивості, тоді як речовини 003, 004 і 006 таку активність не виявляють. Слід також зазначити, що максимальну антиоксидантну активність речовини 001 і 002 виявляють у концентрації 25 МКМ, а при збільшенні концентрації досліджуваної речо-винивпробіданаактивністьзменшується.Такимчи-ном, досліджувані речовини 001 і 002 за дослідже-ноюознакоювиявляютьантиоксидантнуактивність при низьких концентраціях, а в більших - відіграють роль прооксидантів (табл. Враховуючи той факт, що речовини 001 і 002 виявляють антиоксидантну активність, зменшення активності АЛТ у культуральному середовищі гепатоцитів при інкубації клітин з даними речовинами (табл.
Вывод
Таким чином, проведені дослідження показали:
застосування специфічного інгібітора JNK антрапіра-золону SP600125 зменшує активність АЛТ у середовищі інкубації гепатоцитів з АРАР [6].
УТОЙЖЕЧАСЗМЕНШЕННЯАКТИВНОСТІАЛТМОЖЕБУТИ повязане з безпосередньою дією досліджуваних ре-човиннаплазматичнумембранусвіжовиділенихклі-тин, а саме, з її стабілізацією.
• Сполуки001,002і005виявляютьантиоксидант-ні властивості, сполуки 003, 004 і 006 не виявляють антиоксидантної активності.
• Сполука 006 зменшує активність АЛТ в інкубаційному середовищі гепатоцитів на тлі дії АРАР та зменшує вміст р-JNK на тлі введення АРАР. Урезультатібіологічнихдослідженьinvitroвста-
Відомо,ЩОАКТИВАЦІЯJNK(котравідбуваєтьсяпри інкубації з АРАР) супроводжується розвитком окси-дативного стресу і у подальшому активацією перекисного окиснення.
Тому наступним етапом наших досліджень було вивченняантиоксидантноїактивностідосліджуваних речовин. Отримані результати наведені в табл. 4. новлено,щоречовина006(6,7-диметокси-4-N-(4-ціанофеніл)амінохіназолін) здатна суттєво впливати на активність JNK-кіназ та є перспективною сполукою для подальших досліджень in vivo.
ПЕРЕЛІК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ ІНФОРМАЦІЇ
Отримані дані свідчать про те, що деякі з досліджуваних речовин (001, 002 і 005) виявляють антиоксидантні властивості, тоді як речовини 003, 004 і 006 таку активність не виявляють. Слід також зазначити, що максимальну антиоксидантну активність речовини 001 і 002 виявляють у концентрації 25 МКМ, а при збільшенні концентрації досліджуваної речо-винивпробіданаактивністьзменшується.Такимчи-ном, досліджувані речовини 001 і 002 за дослідже-ноюознакоювиявляютьантиоксидантнуактивність при низьких концентраціях, а в більших - відіграють роль прооксидантів (табл. 4).
Враховуючи той факт, що речовини 001 і 002 виявляють антиоксидантну активність, зменшення активності АЛТ у культуральному середовищі гепатоцитів при інкубації клітин з даними речовинами (табл. 3) можна пояснити їх безпосередньою стабілізуючою дією на плазматичну мембрану.
Таким чином, отримані результати дозволяють зробити припущення, що саме речовина 006 може
1. Кост Е. А. Справочник по клиническим лабораторным методам исследования / Е. А. Кост. - М.: Медицина, 1975. - 360 с.
2. Строев Е. А. Практикум по биологической химии / Е. А. Строев, В. Г. Макарова. - М.: Высш. шк., 1986. - 231 с.
3. Bessems J. G. Paracetamol (acetaminophen)-induced toxicity: molecular and biochemical mechanisms, analogues and protective approaches / J. G. Bes-sems, N. P. Vermeulen // Crit. Rev. Toxicol. - 2001. - № 31. - Р. 55-138.
4. Du K. The gap junction inhibitor 2-aminoethoxy-diphenyl-borate protects against acetaminophen hepatotoxicity by inhibiting cytochrome P450 enzymes and c-jun N-terminal kinase activation / [K. Du, C. D. Williams, M. R. MCGILL et al.] // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2013. - Vol. 273, № 3. - Р. 484-491.
5. Gum S. I. Korean red ginseng extract prevents APAP-induced hepatotoxicity through metabolic enzyme regulation: the role of ginsenoside Rg3, a proto-
panaxadiol / S. I. Gum, M. K. Cho // Liver Int. - 2013. - Vol. 33, № 7. - Р. 1071-1084.
6. Saito C. c-Jun N-terminal kinase modulates oxidant stress and peroxynitrite formation independent of inducible nitric oxide synthase in acetaminophen hepatotoxicity / C. Saito, J. J. Lemasters, H. Jaesch-ke // Toxicol. Appl. Pharmacol. - 2010. - Vol. 246, 8. Solheim A. E. Subcellular distribution of proteolyti-cally generated valine in isolated rat hepatocytes / A. E. Solheim, P. O. Seglen / Eur. J. Biochem. - 1980. - Vol. 107, № 2. - P. 587-596.
9. Vlahopoulos S. JNK: a key modulator of intracellular signaling /S.Vlahopoulos,V.C.Zoumpourlis//Biochemistry Mosc. - 2004. - Vol. 69, № 8. - P. 844-854.
№ 1-2. - Р. 8-17.
7. Seki E. A liver full of JNK: signaling in regulation of cell function and disease pathogenesis, and clinical approaches / E. Seki, D. A. Brenner, M. Karin // Gas-troenterol. - 2012. - Vol. 143, № 2. - P. 307-320.
А. Л. Загайко, В. П. Филимоненко, И. Ю. Капустянский, С. Н. Коваленко, Л. В. Евсеева
ПОИСК ИНГИБИТОРОВ C?JUN N?КОНЕЧНЫХ КИНАЗ ?JNK¤ СРЕДИ 4?N??3?ЦИАНОФЕНИЛ¤АМИНО? И 4?N??4?ЦИАНОФЕНИЛ¤АМИНО?ЗАМЕЩЕННЫХ ХИНАЗОЛИНОВ
Проведено исследование JNK-ингибирующей активности синтезированных веществ - производных 4-N-ариламинозамещенных хиназолинов на фоне введения активатора JNK ацет-аминофена in vitro. Установлено, что вещество 006 (6,7-диметокси-4-N-(4-цианофенил)амино-хиназолин) снижает содержание фосфорилированной JNK, т.е. предупреждает ее активацию. При этом наблюдается снижение активности АЛТ, вызванное ацетаминофеном. Полученные данные свидетельствуют, что защитное действие указанного вещества связано не с антиок-сидантной активностью, а с ингибирующим влиянием на активацию JNK.
А. L. Zagayko, V. P. Fylymonenko, I. Yu. Kapustyanskiy, S. M. Kovalenko, L. V. Yevseyeva
SEARCH FOR C?JUN N?TERMINAL KINASE ?JNK¤ INHIBITORS AMONG 4?N??3?CYANOPHENYL¤ AMINO? AND 4?N??4?CYANOPHENYL¤ AMINO?SUBSTITUTED QUINAZOLINES
The investigation of JNK-inhibitory activity of the synthesized compounds - derivatives of 4-N-aryl-amino-substituted quinazolines with administration of acetaminophen (JNK activator) in vitro was carried out. It was established that the substance 006 (6,7-Dimethoxy-4-N-(4-cyanophenyl)-amino-quinazolin) reduces the content of phosphorylated JNK, i.e. prevents its activation. The decrease of ALT activity is induced by acetaminophen. The data obtained indicate that the protective effect of the substance is associated not with antioxidant activity, but with inhibitory effect on the activation of JNK.