Розробка та напрямки вивчення експресуючих кДНК-бібліотеки пухлин щитовидної залози і меланоми. Гетерологічне скринування ідентифікованих антигенів, загальна характеристика, а також імунологічні і біохімічні дослідження найімунореактивніших із них.
Аннотация к работе
Пошук і характеристика пухлиноасоційованих антигенів раку щитовидної залози та меланоми людиниУ даній роботі використано найдосконаліший на сьогодні варіант імунологічної детекції пухлиноасоційованих антигенів (ПАА) - SEREX (serological analysis of recombinant expression CDNA libraries) для ідентифікації їх у злоякісних пухлинах щитовидної залози людини та меланоми (Chen et al., 1997). Роботу проведено в рамках наукової тематики відділу структури та функцій нуклеїнових кислот Інституту молекулярної біології та генетики НАН України за бюджетними темами: №2.28.2.8 - «Ідентифікація та характеристика пухлинних антигенів раку щитовидної залози людини» (номер державної реєстрації 0198U001167, 1998-2000 рр.), №2.2.4.10. Метою дослідження був пошук і характеристика антигенів асоційованих з раком щитовидної залози та меланомою людини. Обрати та налагодити метод для пошуку антигенів, асоційованих з раком щитовидної залози і меланоми. Вперше в світі використано його для ідентифікації антигенів, асоційованих з раком щитовидної залози та ідентифіковано 45 імунопозитивних клонів, які містять КДНК антигенів і кодуються 33 генами.Підготовка сироваток для ауто - та гетерологічного скринування полягала в афінному очищенні від антитіл проти білків E.coli і фага л на носіях, з якими були ковалентно звязані бактеріальні та фагові білки (Y1090 і BNN97, 5-3Prime, США). Для ідентифікації клонів, які експресують IGG людини, фільтри інкубували з антитілами проти IGG людини, міченими пероксидазою хрону (HRP) у розведенні 1:1000 (Sigma, США) та барвника DAB за стандартною методикою. Рівнень антитіл у сироватках досліджували методом дот-блот аналізу з використанням афінно очищених сироваток крові та антитіл проти Fc-фрагмента IGG людини, мічених пероксидазою хрону (HRP), у розведенні 1:1000 (Sigma, США), та барвника DAB за стандартною методикою. Коли зявлялися зони лізису до поверхні чашок Петрі прикладали нітроцелюлозний фільтр, який, після 12 годинного пасивного перенесення білків, використовували для визначення сироваток, які містили аутоантитіла проти певних клонів за методикою, використаною для скринування бібліотек. Білок виявлено й іншими групами, які використовують метод SEREX, у пухлинах шлунка, молочної залози, семіномі та при лімфомі Ходжкіна. а-Катенін раніше було ідентифіковано як аутоантиген при меланомі, раку нирок, молочної залози, товстого кишечнику та сімяників. a-і b-катеніни беруть участь в опосередкованій кадерином клітинній адгезії.У дисертації методом SEREX вперше було досліджено антигени, асоційовані з раком щитовидної залози та меланоми людини, які викликають появу аутоантитіл у сироватках крові онкологічних хворих. При імуноскринуванні одержаних бібліотек ідентифіковано 55 клонів, проти яких в аутологічних сироватках крові хворих було виявлено антитіла. Одержано у гомогенному стані рекомбінантний фрагмент антигену Кі-67 і показано, що рівень антитіл проти нього є достовірно вищим у сироватках крові хворих на меланому, рак щитовидної залози, молочної залози та легенів порівняно із здоровими донорами. Identification of tumor associated antigens in thyroid cancer by SEREX methodology // Conference on Genetics & Molecular Biology for Students & Young Scientists devoted to 100th anniversary of genetics. Identification of tumor-associated antigens by SEREX methodology // Conference for students, PHD students and young scientists on molecular biology and genetics dedicated to the establishment of Ukrainian Society for molecular biology.
План
Основний зміст
Вывод
У дисертації методом SEREX вперше було досліджено антигени, асоційовані з раком щитовидної залози та меланоми людини, які викликають появу аутоантитіл у сироватках крові онкологічних хворих. Досліджено структурно-функціональні особливості найбільш імунореактивного з них - фрагмента ядерного антигену Кі-67.
1. З тканин раку щитовидної залози людини та меланоми створено пять КДНК експресуючих бібліотек з титром (1,2 - 3)·106 колонієутворюючих одиниць.
2. При імуноскринуванні одержаних бібліотек ідентифіковано 55 клонів, проти яких в аутологічних сироватках крові хворих було виявлено антитіла. При секвенуванні КДНК одержаних клонів встановлено, що вони є фрагментами 33 генів, 7 з яких раніше ідентифіковано методом SEREX.
3. При гетерологічному скринуванні показано, що рівень аутоантитіл проти Кі-67 антигену, репресорного білка та АТР-ази підвищений у хворих при всіх досліджених видах раку, що дає змогу розглядати їх як потенційні маркери злоякісного росту.
4. Одержано у гомогенному стані рекомбінантний фрагмент антигену Кі-67 і показано, що рівень антитіл проти нього є достовірно вищим у сироватках крові хворих на меланому, рак щитовидної залози, молочної залози та легенів порівняно із здоровими донорами.
5. Показано, що рекомбінантний фрагмент Кі-67 антигену здатний взаємодіяти з ДНК про - та еукаріотичного походження в умовах in vitro.
6. Одержані моно - та поліклональні антитіла проти рекомбінантного фрагмента Кі-67. Моноклональні антитіла Кі-67-1 і Кі-67-2 можна використовувати як маркер S-фази, профази та метафази клітинного циклу або для визначення мітотичного індексу тканин.
Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації
1. Роднин Н.В., Тихонкова И.А., Немазаный И.А., Горлова Л.Н., Комисаренко И.В., Пальчевский С.С., Кухаренко А.П., Дробот Л.Б., Мацука Г.Х., Филоненко В.В., Гут И.Т. Серологическая идентификация антигенов, вызывающих аутоиммунную реакцию при раке щитовидной железы человека // Експериментальна онкологія. - 2000. - Т. 22, №3. - C.135-138. Особистий внесок: створення та скринінг КДНК бібліотек раку щитовидної залози, підготовка статті до друку.
2. Роднін М.В., Тихонкова І.О., Філоненко В.В., Дробот Л.Б. Мацука Г.Х., Гут І.Т. Пошук та характеристика антигенів меланоми за допомогою методу SEREX // Біополімери і клітина. - 2000. - T. 16, №5. - C. 339-344. Особистий внесок: створення та скринінг КДНК бібліотеки меланоми, клонування, очистка Кі-67, гетерологічний скринінг, підготовка статті до друку.
3. Rodnin N.V., Tykhonkova I.O., Kyyamova R.G., Garifulin O.M., Gout I.T., Filonenko V.V. Identifivation of tumor-associated antigens in human thyroid papillar carcinoma // Біополімери і клітина. - 2003. - T. 19, №6. - C. 541-548. Особистий внесок: створення та скринінг КДНК бібліотеки раку щитовидної залози, підготовка статті до друку.
4. Кіямова Р.Г., Роднін М.В., Гаріфулін О.М., Тихонкова І.О., Корольова К.П., Малець М.С., Гут І.Т., Філоненко В.В. Алогенний скринінг пухлинних антигенів з КДНК бібліотек раку щитовидної залози // Біополімери і клітина-2004. - Т. 20, №1-2. - С. 151-157. Особистий внесок: скринінг КДНК бібліотеки раку щитовидної залози, секвенування та ідентифікація позитивних клонів.
5. Тихонкова І.О., Лізогубов В.В., Хожаєнко Ю.В., Довгопола О.О., Коровін С.І., Овчаренко Г.В., Усенко В.С., Роднін М.В., Філоненко В.В. Дослідження структурно-функціональних властивостей імуногенного фрагмента Кі-67 антигену та отримання проти нього полі - та моноклональних антитіл // Біополімери і клітина. - 2005. - Т 21, №2. - С. 180-183. Особистий внесок: очистка рекомбінантного фрагмента Кі-67, дослідження його звязувальної активності, одержання полі - та характеристика моноклональних антитіл, підготовка статті до друку.
6. Lyzogubov V., Khozhaenko Y., Usenko V., Antonjuk S., Ovcharenko G., Tikhonkova I., Filonenko V. Immunohistochemical analysis of Ki-67, PCNA and S6K1/2 expression in human breast cancer // Experimental oncology. - 2005. - Vol. 27, №2. - P 141-144. Особистий внесок: характеристика моноклональних антитіл.
7. Tykhonkova I.O. Identification of tumor associated antigens in thyroid cancer by SEREX methodology // Conference on Genetics & Molecular Biology for Students & Young Scientists devoted to 100th anniversary of genetics. - Львів (Україна). - 2000. - Р. 27. Особистий внесок: характеристика позитивних клонів з тироїдної КДНК бібліотеки підготовка тез, виступ на конференції.
8. Тихонкова I.O. Пошук та характеристика антигенів меланоми методом SEREX // Укр. біохім. журн. - 2000.-Т. 72, №6. - С. 142. Особистий внесок: клонування Кі-67, гетерологічний скринінг, підготовка тез, виступ на конференції.
9. Rodnin N.V., Tykhonkova I.A., Filonenko V.V., Gout I.T., Matsuka G. Kh. Serological identification of autoimmune reactive antigens at human thyroid cance & melanoma // 2nd Congress of oncologists of the CIS countries Kyiv (Ukraine). - Experimental Oncology. - 2000. - Vol. 22, №3. - Р.165. Особистий внесок: гетерологічне скринування позитивних клонів.
10. Filonenko V.V., Tykhonkova I.O., Rodnin N.V., Drobot L.B., Gout I.T., Matsuka G. Kh. Serological identification of tumor-associated antigens at human thyroid cancer & melanoma // 3rd Parnas Conference Mechanisms of cellular signal transduction and communication. - Lviv (Ukraine). - 2000. - Р. 61. Особистий внесок: характеристика позитивних клонів.
11. Filonenko V.V., Rodnin N.V., Tykhonkova I.A., Kiyamova R.G., Garifulin O.M., Usenko V.S., Lyzogubov V.V., Gout I.T. Identification of tumor-associated antigens by SEREX methodology //International Symposium Intracellular signaling in plant and animal systems. - Kyiv (Ukraine). - 2001. - Р. 60. Особистий внесок: порівняння даних одержаних при скринінгу бібліотек з раку щитовидної залози і меланоми.
12. Tykhonkova I.A., Rodnin N.V., Filonenko V.V., Gout I.T. Identification of tumor-associated antigens by SEREX methodology // Conference for students, PHD students and young scientists on molecular biology and genetics dedicated to the establishment of Ukrainian Society for molecular biology. - Kyiv (Ukraine). - 2001. - Р.172. Особистий внесок: скринування бібліотек, характеристика клонів, підготовка тез, виступ на конференції.
13. Тихонкова И.А., Роднин Н.В., Гут И.Т., Филоненко В.В. Идентификация опухолеассоциированых антигенов рака щитовидной железы человека методом SEREX // XIV Зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва (Россия). - 2002. - С. 21. Особистий внесок: секвенування позитивних клонів.
14. Tykhonkova I.A., Rodnin V.V., Filonenko V.V., Gout I.T. Identification of tumor-associated antigens by SEREX methodology // 6th John Humphrey advanced summer programme in immunology. - Pushchino (Russia). - 2002. - Р. 140. Особистий внесок: скринування бібліотек, підготовка тез, виступ на конференції.
15. Kyjamova R., Garrifulin O., Rodnin N., Tykhonkova I., Usenko V., Lysogubov V., Pogrebnoy P., Kikot V., Filonenko V., Gout I., Matsuka G. Identification of colon and thyroid tumor antigens // Укр. біохім. журн. - Т. 74 спеціальний випуск Матерали VIII Українського біохімічного зїзду Чернівці (Україна).- №4б (додаток 2). - 2002. - С. 36. Особистий внесок: вторинний скринінг, секвенування клонів, порівняння послідовностей з електронними базами даних.
16. Тихонкова И.А., Роднин Н.В., Филоненко В.В. Поиск опухолеассоциированых антигенов при раке щитовидной железы человека методом SEREX // Международная научная конференция «Современное состояние проблем и достижений в области генетики и селекции». - 2003. - Алматы (Казахстан). - С. 167-168. Особистий внесок: характеристика найперспективніших клонів.
17. Tykhonkova I.O., Rodnin M.V., Filonenko V.V. Search and characterization of the tumor-associated proteins from thyroid papillar carcinoma by SEREX methodology // Conference for young scientists, PHD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix and 30 anniversary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine. - Kyiv (Ukraine). - 2003. - Р. 268. Особистий внесок: створення КДНК бібліотеки з папілярної аденокарциноми.
18. Kyyamova R., Rodnin M., Garifilin O., Tykhonkova I., Gryshkova V., Gout I., Filonenko V. Identification of novel tumor-associated antigens with the use of SEREX-methodology // First (Inaugural) Ukrainian Congress for Cell Biology. - Lviv (Ukraine). - 2004. P.139. Особистий внесок: вторинний скринінг імунопозитивних клонів, секвенування їх, порівняння послідовностей з електронними базами даних.
19. Tykhonkova I.O., Rodnin M.V., Ovcharenko G.V., Dovgopola O.O., Lizogubov V.V. Filonenko V.V. The studies of immunological and structural-functional properties of Ki-67 nuclear antigen fragment // Укр. біохім. журн. - 2005. - Т. 77, №2 спеціальний випуск. - 5th Parnas conference molecular mechanisms of cellular signaling. - Р. 248. Особистий внесок: дослідження ДНК - звязувальної активності.
20. Lyzogubov V., Tytarenko R., Usenko V., Ovcharenko G., Rodnin N., Tihonkova I., Filonenko V. Immunohistochemical analysis of S6K1/1 subcellular localization and ribosomal protein S6 phosrhorylation in human breast cancer // Укр. біохім. журн. - - 2005. - Т. 77, №2 спеціальний випуск. - 5th Parnas conference molecular mechanisms of cellular signaling. Київ (Україна).-Р. 206. Особистий внесок: характеристика моноклональних антитіл проти Кі-67.