Возбудители и течение нутталиоза лошадей. Технология получения нутталийного гамма-глобулина как стандартного реагента при постановке серологических реакций для прижизненной диагностики нутталиоза. Условия иммунизации животных нутталийным антигеном.
Аннотация к работе
Разработана технология получения нутталийного гамма-глобулина как одного из компонентов диагностикума для постановки серологических реакций на нутталиоз лошадей.Название паразиту - Nuttallia equi присвоили лишь в 1910 г. ученые Nuttall и Strickland, подтвердив название, данное паразиту ученым Franca в 1909 г. Нутталиоз лошадей наносит значительный экономический ущерб в виде снижения массы тела, уменьшения приплода и его слабой жизнеспособности, ослабления половой активности и снижения качества спермы, сдерживания продуктивности, препятствии в улучшении породных качеств животных, смертности. Диагностика нутталиоза проводится на основании учета эпизоотологического состояния местности, наличия специфических биологических переносчиков - иксодовых клещей рода Dermacentor, сезона года, клинических признаков и результатов микроскопического и серологического исследования. Однако, своеобразная, малая форма возбудителя в виде нескольких точек при нутталионосительстве, наличие в крови здоровых животных некоторых включений (тельца Жолли и др.), трудно отличимых от нутталий, зачастую затрудняют диагностику нутталиоза и, особенно, нутталионосительства, которое длится после клинического выздоровления до 15-18 лет и которое служит постоянным источником для заражения кровососущих клещей и распространения заболевания среди здоровых, особенно племенных лошадей. Вопрос применения серологических диагностических тестов при кровепаразитозах, в том числе при нутталиозе издавна интересовал исследователей, так как этим методом помимо клинически выраженной болезни можно безошибочно выявить скрытое паразитоносительство.Разработанная нами схема технологического процесса получения сухой гамма-глобулиновой фракции к нутталийному антигену выглядит следующим образом: Первая стадия. Гипериммунные сыворотки крови получали иммунизацией кроликов (массой не менее 2,5кг) нутталийным антигеном по модифицированной нами методике. Иммунизацию кроликов проводили антигеном в дозе 1,5 мг в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в соотношении 1:1 в подушечки четырех лапок по 0,25 см3 в каждую. При достижении титра преципитирующих антител не ниже 1 мг/мл в РКП или 1:25000 в ИФА от кроликов брали кровь из краевой ушной вены спирт-ксилольным методом по 40 мл трехкратно, с интервалом в 72 ч. Нутталийный гамма-глобулин представляет собой лиофилизированную гамма-глобулиновую фракцию, выделенную из гипериммунной сыворотки крови кроликов к нутталийному антигену и предназначен для использования при постановке иммуноферментного анализа для прижизненной диагностики нутталиоза однокопытных.
Вывод
Разработанная нами схема технологического процесса получения сухой гамма- глобулиновой фракции к нутталийному антигену выглядит следующим образом: Первая стадия. Получение корпускулярного нутталийного антигена из крови лошадей и ослов, экспериментальным путем зараженных нутталиями и спленэктомированных с целью усиления паразитемии.
Вторая стадия. Получение гипериммунных сывороток крови к нутталийному антигену путем иммунизации лабораторных животных нутталийным антигеном.
Третья стадия. Выделение гамма-глобулиновой фракции из гипериммунной сыворотки крови путем высаливания, ее концентрация.
Четвертая стадия. Составление серии нутталийного гамма-глобулина, расфасовка и этикетирование ампул.
Пятая стадия. Упаковка, маркировка и хранение гамма-глобулина.
Гипериммунные сыворотки крови получали иммунизацией кроликов (массой не менее 2,5кг) нутталийным антигеном по модифицированной нами методике. Иммунизацию кроликов проводили антигеном в дозе 1,5 мг в смеси с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ) в соотношении 1:1 в подушечки четырех лапок по 0,25 см3 в каждую. Через 21 день кроликов реиммунизировали той же дозой антигена с ПАФ в бедренные мышцы обеих лапок по 0,5 см3 смеси в каждую.
Начиная с 7-го дня после второй иммунизации вели ежедневный контроль за титром преципитирующих антител реакцией количественной преципитации (РКП) или иммуноферментным анализом (ИФА). При достижении титра преципитирующих антител не ниже 1 мг/мл в РКП или 1:25000 в ИФА от кроликов брали кровь из краевой ушной вены спирт-ксилольным методом по 40 мл трехкратно, с интервалом в 72 ч.
При низких титрах антител (менее 1 мг/мл в РКП и ниже 1:25000 в ИФА) проводили дополнительную иммунизацию. Через 15 дней после реиммунизации проводили цикл внутривенных инъекций. Антиген в дозе 1,5 мг на кролика вводили двукратно с интервалом в 24 ч в центральную ушную вену. Во избежании аллергической реакции за 2 ч. до внутривенного введения кроликов сенсибилизировали малыми дозами антигена (25 мкг). Контроль за титром антител осуществляли в РКП или в ИФА. Собирали сыворотки отдельно от каждого иммунизированного кролика.
Затем из гипериммунной сыворотки крови путем высаливания сульфатом аммония (50 %) выделяли гамма-глобулиновую фракцию по общепринятой методике. Выделенный гамма-глобулин растворяли в минимальном количестве дистиллированной воды и обессоливали на колонке с сефадексом G-50 или диализом против проточной воды (12 ч.), дистиллированной воды (24 ч) и физиологического раствора (24 ч).
После обессоливания гамма-глобулин концентрировали в диализных трубках на полиэтиленгликоле (ПЭГ) -600 до содержания белка 10 мг/мл.
Каждую серию гамма-глобулина одновременно расфасовывали в ампулы по 2 см3 с содержанием белка 10 мг/ см3. Подвергали лиофильной сушке и запаивали под вакуумом. Ампулы этикетировали с указанием: наименования препарата, количества доз, даты изготовления, срока годности, номера серии.
Нутталийный гамма-глобулин представляет собой лиофилизированную гамма- глобулиновую фракцию, выделенную из гипериммунной сыворотки крови кроликов к нутталийному антигену и предназначен для использования при постановке иммуноферментного анализа для прижизненной диагностики нутталиоза однокопытных. Хранится в темном сухом помещении при температуре 2-10 С до 18 месяцев.
Полученный нутталийный гамма-глобулин испытывали в антиген выявляющем варианте ИФА с сыворотками крови спонтанно и экспериментально зараженных нутталиозом животных по методу A.Voller (1976), коньюгацию кроличьего JGG с пероксидазой и хрена Олайнского производства с показателем чистоты 2,7-3,2 производили по методу P.K.Nagane et all (1974).
Готовили карбонатно-солевой буферный раствор (РН 9,6) (КСБ) следующим образом: 0,1 М растворы натрия углекислого и натрия двууглекислого на физиологическом растворе, затем к натрию углекислому приливали натрий двууглекислый до РН 9,6.
Приготовление фосфатно-солевого буферного раствора (РН 7,2-7,4) содержащего 0,05 % твин -80 (ФСБ-Т) проводили следующим образом: 0,01 М раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного приливали к двузамещенному натрию фосфорнокислому до РН 7,2-7,4. К фосфатно-солевому буферному раствору добавляли твин -80 из расчета 0,5 см3 на 1000 см3 буфера (0,05 %).
Субстратно-индикаторную смесь готовили следующим образом: 70 мг 5- аминосалициловой кислоты растворяли в 100 см3 дистиллированной воды при 70 ОС, доводили РН до 6,0 0,1 М КОН и добавляли 0,16 см3 3%-ного раствора перекиси водорода.
Исследуемые сыворотки крови разводили КСБ 1:25.
Содержимое ампул с нутталийным гамма-глобулином растворяли 1:5000 в ФСБ-Т.
Разведение антител диагностических против иммуноглобулинов кролика, меченных пероксидазой (конъюгат) готовили согласно наставления по применению.
В лунки полистироловых иммунологических планшет вносили по 0,2 см3 раствора исследуемых сывороток крови, закрывали крышкой и инкубировали 18 ч при 4 0С или 3 ч при 37 0С. Затем планшеты промывали ФСБ-Т трижды и в лунки вносили раствор гамма- глобулина до 0,2 см3. Инкубировали 1 ч при 37 0С и промывали ФСБ-Т трижды, после чего в лунки вносили раствор антивидового кроличьего конъюгата по 0,2 см3. Инкубировали 1 ч при 37 0С и четыре-пять раз отмывали ФСБ-Т. Затем в лунки планшет вносили по 0,2 см3 субстратно-индикаторной смеси.
Останавливали реакцию через 20-40 мин добавлением в каждую лунку 0,05 см3 серной кислоты, приготовленной путем растворения 2 см3 концентрированной серной кислоты в 10 см3 дистиллированной воды.
Учет результатов реакции проводили визуально.
При наличии специфических нутталийных антигенов субстрат окрашивается в темно-коричневой дает. Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраски или имеющие слабое пожелтение.
Приготовленный нами гамма-глобулин к нутталийному антигену испытывался на чувствительность с заведомо позитивными нутталийными и заведомо отрицательными сыворотками в антигенвыявляющем варианте ИФА.
Результаты изучения чувствительности антиген выявляющего варианта ИФА при нутталиозе лошадей, где в качестве стандартного реагента использован приготовленный нами нутталийный гамма-глобулин приведены в таблице 1.
Из таблицы 1 видно, что наивысший титр регистрировался при разведениях позитивной сыворотки в соотношении 1:640. Реакция была положительной в случае исследования позитивных нутталийных сывороток и отрицательной при исследовании негативной сыворотки здоровых животных, что показывает на объективность теста и возможности использования нутталийного гамма-глобулина в ИФА для прижизненной диагностики нутталиоза однокопытных.
Обсуждение результатов
Таким образом, в результате проведенных исследований приготовлены вначале нутталийная сыворотка, затем нутталийный гамма-глобулин, пригодный в качестве стандартного реагента при постановке серологических реакций (ИФА) для прижизненной диагностики нутталиоза и для использования в качестве идиотипа при наработке антиидиотипических антител.
Противопоказаний к применению нутталийного гамма-глобулина не выявлено.
При конструировании диагностикума для серологической диагностики нутталиоза важным компонентом является гамма-глобулин, выделенный из гипериммунных сывороток, полученных в результате иммунизации лабораторных животных нативным нутталийным антигеном. нутталиоз диагностика иммунизация глобулин
2. Петровский В.В., Абрамов И.В. Нутталиоз лошадей//В кн. Протозойные болезни сельскохозяйственных животных. Под редакцией Н.И. Степановой. -М., «Колос», С.73-79.
3. Splitter E.J., Twiehus M.J., Castro E.R. Anaplasmosis in sheep in the United states (Manhatten Kansas), // J. Am. Vet. Med. Ass. - 1955. - Vol. 127. - № -P. 244-245.
4. Степанова Н.И. Иммунитет и серологическая диагностика анаплазмозов и тейлериозов рогатого скота: Автореф. дисс. докт. вет. наук. - М., 1971.49 с.
5. Георгиу Х. Экспериментальный анаплазмоз овец (симптомокомплекс, иммунологические реакции): Автореф. дисс. канд. вет. наук. - М., 1980. 25 с.
6. Георгиу Х. Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РНГА и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталиоза лошадей: Автореферат дисс. докт. биол. наук. - М., 1997. 50 с.
7. Сулейменов Т.Т. Некоторые иммунобиологическое особенности A. ovis и совершенствование серодиагностики анаплазмоза. Дисс. канд. биол. наук. - Алма- Ата, 1986. 130 с.
8. Шабдарбаева Г.С. Гемопаразитоценоз овец и иммунобиологические свойства антиидиотипических антител и диагностикумов при спонтанном и экспериментальном анаплазмозе овец. Дисс.канд.биол.наук. -Алма-Ата, 1990. 139 с.
9. Раисова К.Т. Нутталиоз лошадей (эпизоотология, диагностика): Автореф. дисс. канд. биол. наук. - Алма-Ата, 1989. 20 с.
11. Carlier , Wery M. Methodes actualles de diagnosti immunologugue en parasitologie // Ann. Biol. Clin. - 1983. - 41. -6. - p. 435-444.
12. Butler J.E., Feidbush T.L., Me Givern P.L., Stewardw. The enzimelinred immunosorbent assay (ELISA): a measure of antibody concentrion of affinity. // - 1978. - № 15. - р. 131-135.
13. Carlier Y., Yang J., Bout., Capron A. The use of excretory-secretory antigen for of ELISA specific serodiagnos of visceral larva migrans // Biomedicine. - 1982. - 36.- p. 39-40.
14. Noguera -Oueoros A. Lutsche C., Capron M., Dessaint I.P., Capron A. Delection and quantification of circulationg antigen in antibody // Clin. And Exp. Immunol. -1986/65. -№ 2. -Р. 223-231.
15. Маканова А.Г. Биологические особенности личинок родов Gastrophilus, Rhinoestrus и иммунодиагностика ларвальных энтомозов лошадей.: Автореф. дисс. канд.биол.наук. -Алма-Ата, 1989. 21 с.
16. Аязбаев Д.М. Иммунологические аспекты паразитохозяинных отношений при эстрозе овец и меры борьбы.: Дисс. канд. биол.наук. -Алма-Ата, 1990. 118 с.
17. Алпаев Н.С. Иммунологические особенности личинок верблюжьего овода и паразитохозяинные отношения при цефалопинозе.: Дисс. канд. биол. наук. - Алма- Ата, 1992. 111 с.