Обобщение основных методов генной инженерии, позволяющих провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний. Синтез инсулина, соматотропина и интерферонов.
Аннотация к работе
ФГБОУ ВПО «Волгоградский государственный социально-педагогический университет» Кафедра ботаники и методики преподавания биологии Реферат на тему: Получение инсулина, соматотропина, интерферонов на основе методов генетической инженерииГенетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Генная инженерия методами in vitro или in vivo решает задачи введения в геном реципиентной клетки одного или нескольких (обычно чужеродных) генов либо создания в геноме новых типов регуляторных связей. Простота устройства плазмид и легкость, с которой они проникают в бактерии, используются генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов.[4, 13] При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Эти ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации ДНК при делении клетки, репарации повреждений, в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки.Генная инженерия - это метод биотехнологии, который занимается исследованиями по перестройке генотипов. Генотип является не просто механическая сумма генов, а сложная, сложившаяся в процессе эволюции организмов система. Генная инженерия позволяет путем операций в пробирке переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Перенос генов дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим. Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, т.е. содержащих чужой ген, плазмид.
План
Содержание
Введение
Методы генной инженерии
Ферменты генетической инженерии
Получение инсулина
Получение соматотропина
Производство интерферонов
Заключение
Литература
Приложения
Введение
Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Годом рождения генетической инженерии считается 1972 год, когда в лаборатории Берга была получена in vitro первая рекомбинантная молекула ДНК путем объединения линейных фрагментов ДНК с помощью искусственно созданных липких концов.
Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства.
Генетическую инженерию можно рассматривать как состоящую из двух разделов - генной и геномной инженерии.
Генная инженерия методами in vitro или in vivo решает задачи введения в геном реципиентной клетки одного или нескольких (обычно чужеродных) генов либо создания в геноме новых типов регуляторных связей. В таких случаях видовая принадлежность реципиентных организмов не меняется, но появляются несвойственные им признаки.
Перед геномной инженерией стоят задачи более глубокого вмешательства в геном, вплоть до создания новых видов организмов.
Генная инженерия не является наукой в широком смысле, но является инструментом биотехнологии, используя исследования таких биологических наук, как молекулярная биология, цитология, генетика, микробиология. [11, 12]
В настоящее время генная инженерия добилась огромных успехов. Методами генетической инженерии созданы штаммы бактерий, дрожжей, линии клеток с высокой эффективностью продуцирующих биологически активные белки человека и животных. Это позволяет получать эукариотические полипептиды в огромных по сравнению с недавним прошлым количествах, что упрощает процедуру их очистки вплоть до индивидуального состояния. Работы по созданию штаммов - продуцентов имеют важное значение для медицины и ветеринарии и революционизируют бурно развивающуюся отрасль промышленности - биотехнологию. Чрезвычайно интересны исследования по созданию трансгенных животных и растений, содержащих и экспрессирующих чужеродную генетическую информацию. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона. Полученные животные обладали ярко выраженной акромегалией.
Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний. [11, 12]
Методы генной инженерии
Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, т.е. содержащих чужой ген, плазмид. Плазмиды представляют собой кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, состоящие из нескольких пар нуклеотидов. Плазмиды являются автономными генетическими элементами, реплицирующимися (т.е. размножающимися) в бактериальной клетке не в то же время, что основная молекула ДНК. Хотя на долю плазмид приходится лишь небольшая часть клеточной ДНК, именно они несут такие жизненно важные для бактерии гены, как гены лекарственной устойчивости. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам. [1, 11]
Большая часть таких препаратов - антибиотиков используется в качестве лекарств при лечении ряда заболеваний человека и домашних животных. Бактерия, имеющая разные плазмиды, приобретает устойчивость к различным антибиотикам, к солям тяжелых металлов. При действии определенного антибиотика на бактериальные клетки плазмиды, придающие устойчивость к нему, быстро распространяются среди бактерий, сохраняя им жизнь. Простота устройства плазмид и легкость, с которой они проникают в бактерии, используются генными инженерами для введения в клетки бактерий генов высших организмов.[4, 13]
Мощным инструментом генной инженерии являются ферменты - рестрикционные эндонуклеазы, или рестриктазы. Рестрикция буквально означает «ограничение». Бактериальные клетки вырабатывают рестриктазы для разрушения инородной, в первую очередь фаговой ДНК, что необходимо для ограничения вирусной инфекции. Рестриктазы узнают определенные последовательности нуклеотидов и вносят симметричные, расположенные наискось друг от друга, разрывы в цепях ДНК на равных расстояниях от центра участка узнавания. В результате на концах каждого фрагмента рестриктированной ДНК образуются короткие одноцепочечные «хвосты» (их еще называют «липкими» концами).
Весь процесс получения бактерий, называемый клонированием, состоит из последовательных стадий: 1. Рестрикция - разрезание ДНК донора рестриктазой на множество различных фрагментов, но с одинаковыми «липкими» концами. Такие же концы получают при разрезании плазмидной ДНК той же рестриктазой.
2. Лигитирование - включение фрагментов ДНК донора в плазмиды благодаря «сшиванию липких концов» ферментом лигазой.
3. Трансформация - введение рекомбинантных плазмид в бактериальные клетки, обработанные специальным образом - так, чтобы они на короткое время стали проницаемыми для макромолекул. Однако плазмиды проникают лишь в часть обработанных бактерий. Трансформированные бактерии вместе с плазмидой приобретают устойчивость к определенному антибиотику. Это позволяет их отделить от нетрансформированных бактерий, погибающих на среде, содержащей этот антибиотик. Для этого бактерии высеивают на питательную среду, предварительно разведя так, чтобы при рассеве клетки находились на значительном расстоянии друг от друга. Каждая из трансформированных бактерий размножается и образует колонию из многих тысяч потомков - клон.
4. Скрининг - отбор среди клонов тех бактерий, которые несут нужный ген человека. Для этого все бактериальные колонии накрывают специальным фильтром. Когда его снимают, на нем остается отпечаток колоний, так как часть клеток из каждого клона прилипает к фильтру. Затем проводят молекулярную гибридизацию. Фильтры погружают в раствор с радиоактивно меченым зондом. Зонд - это полинуклеотид комплементарной части искомого гена. Он гибридизуется лишь с теми рекомбинантными плазмидами, которые содержат нужный ген. После гибридизации на фильтр в темноте накладывают рентгеновскую фотопленку и через несколько часов ее проявляют. Положение засвеченных участков на пленке позволяет найти среди множества клонов трансформированных бактерий те, которые имеют плазмиды с нужным геном. [13]
На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.
Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания. [5]
Не всегда удается вырезать нужный ген с помощью рестриктаз. Поэтому в ряде случаев процесс клонирования начинают с целенаправленного получения нужного гена. Для этого из клеток человека выделяют и-РНК, являющуюся транскрипционной копией этого гена, и с помощью фермента - обратной транскриптазы синтезируют комплементарную ей цепь ДНК. Затем и-РНК, служившая матрицей при синтезе ДНК, уничтожается специальным ферментом, способным гидролизовать цепь РНК, спаренную с цепью ДНК. Оставшаяся цепь ДНК служит матрицей для синтеза обратной транскриптазой, комплетентарной второй цепи ДНК.
Получившаяся двойная спираль ДНК носит название к-ДНК (комплементарная ДНК). Она соответствует гену, с которого была считана и-РНК, запущенная в систему с обратной транскриптазой. Такая к-ДНК встраивается в плазмиду, которой трансформируют бактерии и получают клоны, содержащие только выбранные гены донора.
Чтобы осуществить перенос генов, необходимо выполнить следующие операции: · Выделение из клеток бактерий, животных или растений тех генов, которые намечены для переноса.
· Создание специальных генетических конструкций, в составе которых намеченные гены будут внедряться в геном другого вида.
· Внедрение генетических конструкций сначала в клетку, а затем в геном другого вида и выращивание измененных клеток в целые организмы.[4,10]
Ферменты генетической инженерии
Генетическая инженерия - потомок молекулярной генетики, но своим рождением обязана успехам генетической энзимологии и химии нуклеиновых кислот, так как инструментами молекулярного манипулирования являются ферменты. Если с клетками и клеточными органеллами мы подчас можем работать микроманипуляторами, то никакие, даже самые мелкие микрохирургические инструменты не помогут при работе с макромолекулами ДНК и РНК. Что же делать? В роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания" выступают ферменты.
Только они могут найти определенные последовательности нуклеотидов, "разрезать" там молекулу или, наоборот, "заштопать" дырку в цепи ДНК. Эти ферменты издавна работают в клетке, выполняя работы по репликации ДНК при делении клетки, репарации повреждений, в процессах считывания и переноса генетической информации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача генного инженера - подобрать фермент, который выполнил бы поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным участком нуклеиновой кислоты.
Следует отметить, что ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены видовой специфичности, поэтому экспериментатор может сочетать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в избранной им последовательности. Это позволяет генной инженерии преодолевать установленные природой видовые барьеры и осуществлять межвидовое скрещивание.
Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп: - ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);
- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК. [10, 11]
Получение инсулина
Всем широко и печально известна такая болезнь, как сахарный диабет, когда организм человека утрачивает способность вырабатывать физиологически важный гормон инсулин. В результате в крови накапливается сахар и больной может погибнуть. Инсулин вырабатывается бета - клетками островков Лангерганса поджелудочной железы.[9] Попытки извлечь его из поджелудочной железы долгое время оставались тщетными, так как этот гормон является полипептидом и разрушается трипсином, содержащимся в ткани вырезанной из организма поджелудочной железы.
Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. В 1922 году инсулин, выделенный из поджелудочной железы животного, был впервые введен десятилетнему мальчику, больному диабетом. Результат превзошел все ожидания, и уже через год американская фирма «Eli Lilly» выпустила первый препарат животного инсулина.[12]
Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. Так, в 1979 году из 6 млн. больных во всем мире только 4 млн. получали инсулин. Без лечения инсулином больные умирали. А если учесть, что среди больных диабетом немало детей, становится понятным, что для многих стран это заболевание превращается в национальную трагедию. Более того, многолетнее применение животного инсулина приводило к необратимому поражению многих органов пациента изза иммунологических реакций, вызываемых инъекцией чужеродного человеческому организму животного инсулина.
В 1978 году исследователи из компании "Генентек" впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки (E. coli).
Генные инженеры в качестве первой практической задачи решили клонировать ген инсулина. Клонированные гены человеческого инсулина были введены с плазмидой в бактериальную клетку, в результате E.coli приобретает способность синтезировать белковую цепь, состоящую из галактозидазы и инсулина. Синтезированные полипептиды отщепляют от фермента химическим путем, затем проводят и очистку который природные микробные штаммы никогда не синтезировали. Начиная с 1982 года фирмы США, Японии, Великобритании и других стран производят генноинженерный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. [1]
Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Одним из методов получения генноинженерного инсулина является раздельное (разные штаммы-продуценты) получение обеих цепей с последующим фолдингом молекулы (образование дисульфидных мостиков) и разделением изоформ. (Приложение 1)
Другой метод получения инсулина - синтез проинсулина в клетках E.Coli, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. (Приложение 2.) После очистки полученного проинсулина его расщепили трипсином и карбоксипептидазой и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы. [7]
При обоих подходах возможно как индивидуальное получение исходных компонентов (А- и В-цепи или проинсулин), так и в составе гибридных белков. Помимо А- и В-цепи или проинсулина, в составе гибридных белков могут присутствовать: - белок носитель, обеспечивающий транспортировку гибридного белка в периплазматическое пространство клетки или культуральную среду;
- аффинный компонент, существенно облегчающий выделение гибридного белка.
При этом оба эти компонента могут одновременно присутствовать в составе гибридного белка. Кроме этого, при создании гибридных белков может использоваться принцип мультимерности, (то есть, в гибридном белке присутствует несколько копий целевого полипептида), позволяющий существенно повысить выход целевого продукта. [3]
В Великобритании с помощью E.coli синтезированы обе цепи человеческого инсулина, которые затем были соединены в молекулу биологически активного гормона. Чтобы одноклеточный организм мог синтезировать на своих рибосомах молекулы инсулина, необходимо снабдить его нужной программой, то есть ввести ему ген гормона.
В Институте РАН получен рекомбинантный инсулин с использованием генноинженерных штаммов E.coli. Из выращенной биомассы выделяется предшественник, гибридный белок, экспрессируемый в количестве 40% от всего клеточного белка, содержащий препроинсулин. Превращение его в инсулин in vitro осуществляется в той же последовательности, что и in vivo - отщепляется лидирующий полипептид, препроинсулин превращается в инсулин через стадии окислительного сульфитолиза с последующим восстановительным замыканием трех дисульфидных связей и ферментативным вычленением связывающего С-пептида. После ряда хромотографических очисток, включающих ионообменные, гелевые и ВЭЖХ, получают человеческий инсулин высокой чистоты и природной активности. [6]
Можно использовать штамм со встроенной в плазмиду нуклеотидной последовательностью, экспрессирующей гибридный белок, который состоит из линейного проинсулина и присоединенного к его N-концу через остаток метионина фрагмента белка А Staphylococcus aureus.
Культивирование насыщенной биомассы клеток рекомбинантного штамма обеспечивает начало производства гибридного белка, выделение и последовательная трансформация которого in tube приводят к инсулину.
Возможен и другой путь: получается в бактериальной системе экспрессии слитой рекомбинантный белок, состоящий из проинсулина человека и присоединенного к нему через остаток метионина полигистидинового "хвоста". Его выделяют, используя хелатную хроматографию на колонках с Ni-агарозой из телец включения и расщепляли бромцианом.
Выделенный белок является S-сульфонированным. Картирование и масс-спектрометрический анализ полученного проинсулина, очищенного ионнообменной хроматографией на анионите и ОФ (обращеннофазовой) ВЭЖХ (высокоэффективной жидкостной хроматографией), показывают наличие дисульфидных мостиков, соответствующих дисульфидным мостикам нативного проинсулина человека.[3,11]
В последнее время пристальное внимание уделяется упрощению процедуры получения рекомбинантного инсулина методами генной инженерии. Так, например, можно получить слитой белок, состоящий из лидерного пептида интерлейкина 2 присоединенного к N-концу проинсулина, через остаток лизина. Белок эффективно экспрессируется и локализуется в тельцах включения. После выделения белок расщепляется трипсином с получением инсулина и С-пептида.
Полученные инсулин и С-пептид очищались ОФ ВЭЖХ. При создании слитых конструкций весьма существенным является соотношение масс белка носителя и целевого полипептида. С-пептиды соединяются по принципу "голова-хвост" с помощью аминокислотных спейсеров, несущих сайт рестрикции Sfi I и два остатка аргинина в начале и в конце спейсера для последующего расщепления белка трипсином. ВЭЖХ продуктов расщепления показывает, что отщепление С-пептида проходит количественно, а это позволяет использовать способ мультимерных синтетических генов для получения целевых полипептидов в промышленном масштабе. [3]
Получение соматотропина
Соматотропин - гормон, секретируемый передней долей гипофиза. Он стимулирует синтез белка в органах и тканях и рост молодого организма. Недостаток этого гормона в детском и подростковом возрасте приводит к гипофизарной карликовости. Телосложение у таких людей относительно пропорционально, однако кисти и стопы малы, пальцы тонкие, окостенение скелета запаздывает, половые органы недоразвиты. Такие люди плохо переносят инфекционные и другие болезни и поэтому часто умирают молодыми. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. [9, 11]
Соматотропин обладает хорошо выраженной видовой специфичностью. Препараты, полученные из гипофиза быка или свиньи, мало влияют или совсем не влияют на рост обезьяны и человека. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы.[5]
Фирмой Genentech Inc.(США) в 1980 году был сконструирован "квазисинтетический" ген соматотропина, построенный из синтетического фрагмента ДНК, кодирующего 23 аминокислоты N-концевой части гормона и фрагмента к ДНК, несущего информацию об остальной части молекулы соматотропина. Введение его в плазмиду, содержащую бактериальный промотор (регуляторный элемент, контролирующий транскрипцию гена) и сигнал инициации трансляции, обеспечивало эффективную экспрессию гена и приводило к синтезу гормона роста. [10]
Несмотря на большой прогресс, достигнутый в исследовании соматотропных гормонов человека и животных, механизм их действия на молекулярном уровне изучен недостаточно. Отсутствие данных о точной пространственной структуре гормонов этой группы затрудняет исследования их взаимодействия с рецепторами, ограничивает возможности изучения структурно-функциональных взаимоотношений различных участков полипептидной цепи, не позволяет в полной мере использовать достижения белковой инженерии для создания аналогов соматотропинов.
Рекомбинантный соматотропин, получивший название соматрем, стал вторым биосинтетическим фармацевтическим препаратом. Гормон, синтезированный в генетически сконструированных клетках кишечной палочки, отличается от гормона, выделенного из гипофиза, дополнительным остатком метионина на NH2 - конце молекулы
На первом этапе клонировали двунитевую ДНК-копию МРНК и расщеплением рестрикционными эндонуклеазами получили последовательность, которая кодирует всю аминокислотную последовательность гормона, за исключением первых 23 аминокислот. Затем клонировали синтетический полипептид, соответствующий аминокислотам от 1-й до 23-й. Далее два фрагмента объединяли, затем «подстроили» к паре промоторов и участку связывания рибосом. Конечный выход гормона составил 2,4 млг на 1 мл культуры E.coli (100000 молекул гормона на клетку). СТГ, синтезированный в бактериях, обладал нужной молекулярной массой и не связан с каким-либо бактериальным белком, от которого его необходимо было отщеплять.
Изменяя аминокислотную последовательность СТГ посредством модификации кодирующего его гена, в бактериальных клетках можно синтезировать аналоги гормона, очень важные для изучения активных участков молекулы и этиологии карликовости на молекулярном уровне.
Используя методы рекомбинантных ДНК, можно синтезировать и другие факторы роста, и факторы дифференцировки тканей, выделив вначале их МРНК, затем получив соответствующие гены. Это относится к соматомедину А, стимулирующему фиксацию серы в хряще, образование которого индуцируется соматотропином. [1,4]
В 1982 году выделен и синтезирован полипептид, содержащий из 44 аминокислотных остатков, обладающий полной биологической активностью гипоталамического ризилинг-фактора соматотропина (СТГ-РФ). Введение СТГ-РФ способно компенсировать недостаток соматотропина. Применение СТГ-РФ возможно не только для лечения гипофизарной карликовости, но и при некоторых формах диабета и для ускорения регенерации тканей у людей, получивших сильные ожоги.
Весь технологический цикл состоит из пяти функционально различных этапов: 1) ферментация;
2) первичная очистка белка;
3) хроматографическая очистка;
4) изготовление лекарственной формы;
5) анализ качества субстанции и лекарственной формы соматогена.
Важной особенностью технологического процесса является обеспечение апирогенности при проведении хроматографической очистки белка. [8]
Неотъемлемой составной частью каждого технологического цикла промышленного производства является проведение сложного комплекса анализов качества продукта. В основе объема и номенклатуры этих анализов лежат соответствующие рекомендации ВОЗ.
Производство интерферонов
Впервые интерферон был описан в 1956 году английскими учеными А. Исааком и Е. Линдеманом. Интерфероны (ИФН) - белки, которые синтезируются в разных клетках организма. Их главная функция - защита организма от вирусных инфекций. Кроме того, интерфероны тормозят деление клеток, в том числе опухолевых, влияют на иммунные реакции организма, защищают клетки от радиационного повреждения. По своему действию интерфероны напоминают гормоны. Это вещества с очень высокой активностью. За единицу активности интерферона принято количество интерферона, которое защищает от поражения вирусом 10 млн. клеток. Таким защитным эффектом обладает 1 пикограмм интерферона (10-12г). Способность интерферонов защищать организм от вирусов и тормозить рост опухолей вызывает большой интерес к ним. Интерфероны имеют видовую специфичность, поэтому нельзя использовать интерфероны различного происхождения. В связи с этим интенсивно разрабатывались методы получения человеческого интерферона из клеток культур отдельных тканей человека, а также из микроорганизмов, созданных методами генетической инженерии. В зависимости от клеток-продуцентов интерфероны человека подразделяются на три группы: 1. альфа-интерферон, продуцируемый лейкоцитами человека (лейкоцитарный);
3. гамма-интерферон или иммунный интерферон, продуцируемый гамма-лимфоцитами человека. [13]
Первым из этих соединений на рынок поступил альфа-интерферон, затем бета-интерферон.
ИФН подразделяются на два типа. К первому типу, действующему как ингибиторы репликации вируса и оказывающему преимущественно противовирусный эффект, относятся 22 различных подтипа ИФН-? и один подтип ИФН-?. Ко второму типу, проявляющему иммуномодуляторную активность, относятся ИФН-?.
В клетке интерферон начинает синтезироваться в ответ на определенные возбудители. Основным возбудителем синтеза интерферона являются вирусы, мутагены и специфические антигены, которые могут индуцировать синтез интерферона. Производство интерферона в медицинских целях до недавнего времени основывалось на технологии с использованием клеточных культур. В последние годы эти технологии усовершенствованы: применяют новейшие методы концентрирования и очистки белков, достижения генетической инженерии. [8]
Исторически первым методом получения интерферона можно считать метод П. Кантелы, который основан на культивировании лейкоцитов и очистке интерферона. Отделенные от других кровяных элементов лейкоциты помещают в поддерживающую среду. Синтез интерферона индуцируют 16-20 часов при помощи вируса Сендай (линия Кантелы). Индуцирование синтеза интерферона надо начинать не позднее 24 часов после взятия крови. Так как для получения интерферона методом Кантелы требуется много донорской крови, возможности этого метода ограничены. Фибробластовый интерферон получают от культур диплоидных клеток. Максимальный выход интерферона наблюдается при помощи синтетической двунитчатой РНК. Человеческий лимфобластоидный интерферон получен из лимфоидных клеток инфильтрата плевры больных лимфомой Беркита. Для индуцирования синтеза такого интерферона также используется вирус Сендай. Иммунный интерферон синтезируют В- и Т-лимфоциты. Его получают от кратковременных культур Т- и В-лимфоцитов. Выход этого интерферона ниже, чем альфа- и бета-интерферона.
Первые сообщения о получении альфа-интерферона генноинженерным методом появились в 1980 году. В бывшем СССР альфа-интерферон получен в Институте органического синтеза АН ЛАТССР под руководством Э. Грена. Ген интерферона был синтезирован на матрице МРНК, выделенной из активно синтезирующих интерферон лейкоцитов. Ген был включен в плазмиду, которая была введена в клетки E.coli. Полученные трансформированные клетки продуцировали около 8 -10 ед. интерферона в 1 дм3 бактериальной культуры. Выделенный альфа-интерферон оказался интерфероном нового типа, до этого еще неиндентифицированным. Изучение альфа-интерферона показало, что имеется как минимум 20 генов, отвечающих за различные типы альфа-интерферонов. Получение интерферонов генноинженерным путем очень перспективно, так как из 1дм3 интерферонсинтезирующей культуры микроорганизмов можно получить до 60 мкг лейкоцитарного интерферона. Такое количество препарата можно получить из 100 дм3 крови. Сконструированы также плазмиды, содержащие гены бета- и гамма-интерферонов. [10]
В настоящее время в качестве исходных микроорганизмов используют различные конструкции штаммов Pichia pastoris, Pseudomonas putida и Escherichia coli.
Недостатком использования P. pastoris в качестве продуцента интерферона, является крайне сложные условия ферментации этого типа дрожжей, необходимость строго поддерживать концентрацию индуктора, в частности метанола, в процессе биосинтеза.
Недостатком использования штаммов Ps. putida является сложность процесса ферментации при низком уровне экспрессии (10 мг интерферона на 1 л культуральной среды). Более продуктивным является использование штаммов Escherichia coli.
Известно большое количество плазмид и созданных на их основе штаммов Е. coli, экспрессирующих интерферон: штаммы Е. coli ATCC 31633 и 31644 с плазмидами Z-PBR322 (Psti) HCLF-11-206 или Z-PBR 322(Pstl)/HCLN SN 35-AHL6 (SU 1764515), штамм Е. coli PINF- AP2 (SU 1312961), штамм Е. coli PINF- F-Pa (AU 1312962), штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой p280/21FN штамм E.Coli SG 20050 с плазмидой PINF14 (SU 1703691), штамм E.coli SG 20050 с плазмидой PINF16 (RU 2054041) и др. Недостатком технологий, основанных на использовании этих штаммов, является их нестабильность, а также недостаточный уровень экспрессии интерферона.
Наряду с особенностями используемых штаммов эффективность процесса во многом зависит от используемой технологии выделения и очистки интерферона.
Известен способ получения интерферона, включающий в себя культивирование клеток Ps. putida, разрушение биомассы, обработку полиэтиленимином, фракционирование сернокислым аммонием, гидрофобную хроматографию на фенилсилохроме С-80, РН-фракционирование лизата, его концентрирование и диафильтрацию, ионообменную хроматографию на целлюлозе DE-52, элюирование в градиенте РН, ионообменную хроматографию полученного элюента на целлюлозе СМ-52, концентрирование пропусканием через кассету фильтров и гель-фильтрацию на Сефадексе G-100 (SU 1640996). Недостатком этого способа кроме сложной многостадийной ферментации является многостадийность при получении конечного продукта.
Известен также способ получения интерферона, включающий в себя культивирование штамма E.coli SG 20050/PIF16, в LB-бульоне в колбах в термостатированном шейкере, центрифугирование биомассы, ее промывку буферным раствором и обработку ультразвуком для разрушения клеток. Полученный лизат центрифугируют, промывают 3М раствором мочевины в буфере, растворяют в растворе гуанидин хлорида в буфере, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют, проводят окислительный сульфитолиз, диализ против 8 М мочевины, ренатурацию и окончательную двухстадийную хроматографию на СМ-52 целлюлозе и сефадексе G-50 (RU 2054041).
Недостатками этого способа является его относительно невысокая производительность основных этапов процесса выделения и очистки. В особенности это относится к ультразвуковой обработке продукта, диализу и окислительному сульфитолизу, что приводит к нестабильности выхода интерферона, а также к невозможности использования этого метода для промышленного производства интерферона.
В качестве наиболее близкого аналога (прототипа) может быть указан способ получения лейкоцитарного интерферона человека, заключающийся в культивировании рекомбинантного штамма E.coli, замораживании полученной биомассы при температуре не выше -70°С, размораживании, разрушении клеток микроорганизма лизоцимом, удалении ДНК и РНК введением в лизат ДНК-азы и очисткой выделенной нерастворимой формы интерферона отмывкой буферным раствором с детергентами, растворении осадка интерферона в растворе гуанидин гидрохлорида, ренатурации и одностадийной очистке ионообменной хроматографией. В качестве продуцента используют штамм E.coli SS5, полученный с помощью рекомбинантной плазмиды PSS5, содержащей три промотора: Plac, Pt7 и Ptrp, и ген альфа -интерферона с введенными нуклеотидными заменами.
Экспрессия интерферона штаммом E.coli SS5, содержащим эту плазмиду, контролируется тремя промоторами: Plac, Pt7 и Ptrp. Уровень экспрессии интерферона составляет около 800 мг на 1 л клеточной суспензии.
Недостатком способа является низкая технологичность использования ферментативного разрушения клеток, ДНК и РНК микроорганизма и одностадийная хроматографическая очистка интерферона. Это обуславливает нестабильность процесса выделения интерферона, приводит к снижению его качества и ограничивает возможность использования приведенной схемы для промышленного производства интерферона.
Недостатками данной плазмиды и штамма на ее основе являются использование в плазмиде сильного нерегулируемого промотора фага Т7 в штамме Е. coli BL21 (DE3), в котором ген Т7 РНК полимеразы находится под промотором lac оперона и который всегда "течет". Следовательно, в клетке непрерывно происходит синтез интерферона, что приводит к диссоциации плазмиды и снижению жизнеспособности клеток штамма, и в результате - снижение выхода интерферона.
Для получения больших количеств ИФН используют шестидневные однослойные культуры клеток куриного эмбриона или культивируемые лейкоциты крови человека, зараженные определенным видом вируса. Иными словами, для получения ИФН создают определенную систему вирус-клетка.
Из клетки человека изолирован ген, ответственный за биосинтез ИФН. Экзогенный человеческий ИФН получают, используя технологию рекомбинантных ДНК. Процедура выделения КДНК ИФН-ов состоит в следующем: 1) Из лейкоцитов человека выделяют МРНК, фракционируют ее по размерам, проводят обратную транскрипцию, встраивают в сайт модифицированной плазмиды.
2) Полученным продуктом трансформируют Е. coli; образовавшиеся клоны подразделяют на группы, которые идентифицируют.
3) Каждую группу клонов гибридизируют с ИФН - МРНК.
4) Из образовавшихся гибридов, содержащих КДНК и ХРНК, выделяют МРНК, проводят ее трансляцию в системе синтеза белка .
5) Определяют интерферонную противовирусную активность каждой смеси, полученной в результате трансляции. Группы, проявившие интерферонную активность, содержат клон с КДНК, гибридизировавшийся с ИФН - МРНК; повторно идентифицируют клон, содержащий полноразмерную ИФН - КДНК человека. [2] генный инженерия инсулин интерферон
Вывод
Генная инженерия - это метод биотехнологии, который занимается исследованиями по перестройке генотипов. Генотип является не просто механическая сумма генов, а сложная, сложившаяся в процессе эволюции организмов система. Генная инженерия позволяет путем операций в пробирке переносить генетическую информацию из одного организма в другой. Перенос генов дает возможность преодолевать межвидовые барьеры и передавать отдельные наследственные признаки одних организмов другим.
Наиболее распространенным методом генной инженерии является метод получения рекомбинантных, т.е. содержащих чужой ген, плазмид. Разные плазмиды содержат разные гены устойчивости к антибактериальным препаратам. Большая часть таких препаратов - антибиотиков используется в качестве лекарств при лечении ряда заболеваний человека и домашних животных. Методами генетической инженерии созданы штаммы бактерий, дрожжей, линии клеток с высокой эффективностью продуцирующих биологически активные белки человека и животных. Это позволяет получать эукариотические полипептиды в огромных по сравнению с недавним прошлым количествах, что упрощает процедуру их очистки вплоть до индивидуального состояния
В 1980 году гормон роста - соматотропин - получили из бактерии кишечной палочки. До развития генной инженерии его выделяли из гипофизов от трупов. Соматотропин, синтезированный в специально сконструированных клетках бактерий, имеет очевидные преимущества: он доступен в больших количествах, его препараты являются биохимически чистыми и свободными от вирусных загрязнений.
В 1982 году гормон инсулин стали получать в промышленных масштабах из бактерий, содержащих ген человеческого инсулина. До этого времени инсулин выделяли из поджелудочных желез забиваемых коров и свиней, что сложно и дорого.
Интерферон - белок, синтезируемый организмом в ответ на вирусную инфекцию, изучают сейчас как возможное средство лечения рака и СПИДА. Понадобились бы тысячи литров крови человека, чтобы получить такое количество интерферона, какое дает всего один литр бактериальной культуры. Ясно, что выигрыш от массового производства этого вещества очень велик.
Таким образом, благодаря активному развитию генной инженерии значительный прогресс достигнут в практической области создания новых продуктов для медицинской промышленности и лечения болезней человека. Около 200 новых диагностических препаратов уже введены в медицинскую практику, и более 100 генноинженерных лекарственных веществ находится на стадии клинического изучения. Среди них лекарства, излечивающие артрозы, сердечно-сосудистые заболевания, некоторые опухолевые процессы и, возможно, даже СПИД. Среди нескольких сотен генноинженерных фирм 60% работают над производством лекарственных и диагностических препаратов.
Список литературы
1. Биотехнология: Учебное пособие для ВУЗОВ /Под ред. Н.С. Егорова, В.Д. Самуилова.- М.: Высшая школа, 1987 г. с. 132-139
2. Гавриков, А.В. Оптимизация биотехнологического производства субстанций рекомбинантных интерферонов человека: дис. ... канд. биол. наук - М, 2003г.
3. Романчиков, А.Б. Генноинженерный инсулин человека. Повышение эффективности хроматографического разделения при использовании принципа бифункциональности. / А.Б. Романчиков [и др.] // Биоограническая Химия. 1997. № 2. с. 23