Получение амплификонов длиной до нескольких тысяч пар нуклеотидов. Расплетение двойной спирали и расхождение полинуклеотидных цепей. Образование двухцепочечных комплексов "праймер-матрица". Динамика накопления продукта при полимеразной цепной реакции.
Аннотация к работе
МЕХАНИЗМЫ РЕПЛИКАЦИИ И РЕПАРАЦИИ ДНК. РЕКОМБИНАЦИЯ.Для проведения полимеразной цепной реакции в реакционной смеси должны присутствовать следующие компоненты: 1) праймеры («прямой» и «обратный») - искусственно синтезированные олигонуклеотиды, фланкирующие участок амплификации (рис. Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов - Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. В первом и частично во втором циклах образуются копии (ампликоны), не соответствующие границам амплифицируемого гена (все ампликоны в первом цикле и часть ампликонов во втором цикле получаются более протяженными в тех участках, где еще не произошло связывание второго, ограничивающего рост цепи праймера). Праймеры используют, как правило, попарно и подбирают их таким образом, чтобы они были комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область, и ориентированы 3"-концами в направлении последовательности, которую необходимо амплифицировать, т. е. навстречу друг другу. Объем исходного раствора праймеров рассчитывают и добавляют к суммарному объему реакционной смеси, приготовленному для 10 и более реакций, или разбавляют исходный раствор стерильной деионизованной водой до требуемой концентрации и смешивают оба праймера в одной пробирке (только аликвоты, а не весь объем исходных растворов праймеров!).