Дослідження первинних механізмів мембраномодулюючої дії біорегуляторів різного походження і активної ролі ліпідного матриксу мембран в цих процесах. Аналіз особливостей взаємодії бірегуляторів з модельними ліпідними і ліпопротеїновими мембранами.
Аннотация к работе
Метою дослідження є встановлення активної ролі ліпідного матриксу в реалізації ефектів біорегуляторів, здатності регуляторних речовин природного і синтетичного походження взаємодіяти з ліпідним матриксом мембран без залучення специфічних білкових рецепторних структур, визначення кількісних параметрів інсерції біологічно активних молекул у різні типи ліпідних мембран, а також встановлення залежності між фізико-хімічними характеристиками біорегуляторів і ліпідного матриксу мембран та особливостями їх взаємодії. визначити параметри мембрано-активної дії біорегуляторів по відношенню до різних модельних мембран - концентраційну залежність інтенсивності змін параметрів мембран (поверхневого тиску і граничного стрибка потенціалу), характер взаємодії (адсорбція в зоні полярних головок або інсерція в гідрофобну зону), мінімальну ефективну концентрацію, коефіцієнт адсорбції Гіббса, питому молекулярну площу адсорбованої речовини в мембрані; Мінімальну діючу концентрацію БАР при взаємодії з мембранами (Смін) розраховували при апроксимації графіку Др = f (Дln C) - в точці перетину функції з віссю абсцис (Др=0). При цьому більшість з АБП діють переважно на клітини прокаріотів, майже не впливаючи на мембрани клітини-хазяїна, що повязують з особливостями біохімічного складу мембран (відносна ліпідна асиметрія з переважанням кислих ліпідів в зовнішньому моношарі мембран прокаріотів і у цитоплазматичному - в ПМ еукаріотичних клітин) і особливостями самих пептидів (АБП мають високий вміст позитивно заряджених амінокислотних залишків, що забезбечує ефективну електростатичну взаємодію з аніонними бактеріальними мембранами, і характеризуються високою загальною гідрофобністю, завдяки якій проникають в зону ацильних ланцюгів ліпідного бішару). При взаємодії ПМ з моношаровими мембранами, сформованими з везикул ПМ міоцитів кишечника кроля, характер процесу адсорбції змінюється - зростає Смін, необхідна для початку реєстрації змін як ГСП, так і поверхневого тиску, відсутня фаза тривалого первинного накопичення препарату в зоні полярних головок, проте двофазність процесу зберігається, хоча і менш виражена (рис.9,Б), оскільки коефіцієнт адсорбції Гіббса першої фази (ГІ=2,885·10-7 М/м2) більш як в 10 разів перевищує показник ГІ при взаємодії ПГ з азолектиновою мембраною.Регуляторні пептиди з різними структурно-функціональними властивостями (оптичні ізомери кіоторфіну, тироліберин, меланостатин, пентагастрин, Мет-і Лей-енкефаліни, їх синтетичний аналог S-77, нейротензин), похідні амінокислот (гамма-аміномасляна кислота і кардіотонік суфан), ксенобіотичні речовини (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота і N-оксид диметилпіридину) і фітопрепарати здатні взаємодіяти з ліпідним матриксом мембран без попереднього залучення специфічних білкових рецепторів. Взаємодії біорегуляторів з мембранами опосередковуються ліпідним складом і залежать як від електростатичних, так і від гідрофобних ефектів. Аніонні ліпіди сприяють концентруванню БАР на поверхні мембрани, більш ефективне проникнення регуляторних пептидів спостерігається в мембрани, що складаються з нейтральних фосфоліпідів, тоді як холестерол і білки знижують активність взаємодії біорегуляторів з мембранним матриксом. Ефективність пептид-мембранної взаємодії залежить від гідрофільно-гідрофобного балансу пептидної молекули. Різна гідрофобність енкефалінів, обумовлена єдиним С-кінцевим амінокислотним залишком, веде до різного прояву їх мембранотропної активності (Лей-енкефалін діє переважно в поверхневій зоні мембрани, тоді як молекули Мет-енкефаліну інкорпоруються в її матрикс), що може лежати в основі біологічного механізму вибору підтипу опіатного рецептора.
Вывод
Регуляторні пептиди з різними структурно-функціональними властивостями (оптичні ізомери кіоторфіну, тироліберин, меланостатин, пентагастрин, Мет- і Лей-енкефаліни, їх синтетичний аналог S-77, нейротензин), похідні амінокислот (гамма-аміномасляна кислота і кардіотонік суфан), ксенобіотичні речовини (2,4-дихлорфеноксиоцтова кислота і N-оксид диметилпіридину) і фітопрепарати здатні взаємодіяти з ліпідним матриксом мембран без попереднього залучення специфічних білкових рецепторів.
Взаємодії біорегуляторів з мембранами опосередковуються ліпідним складом і залежать як від електростатичних, так і від гідрофобних ефектів. Аніонні ліпіди сприяють концентруванню БАР на поверхні мембрани, більш ефективне проникнення регуляторних пептидів спостерігається в мембрани, що складаються з нейтральних фосфоліпідів, тоді як холестерол і білки знижують активність взаємодії біорегуляторів з мембранним матриксом.
Ефективність пептид-мембранної взаємодії залежить від гідрофільно-гідрофобного балансу пептидної молекули. Високі показники загальної гідрофобності при наявності полярних амінокислотних залишків (Z=0,3-0,8) сприяють активній інкорпорації пептидів в ліпідний матрикс. В той же час, такі ж або вищі показники гідрофобності при відсутності полярних залишків ведуть до істотного зниження активності пептид-мембранної взаємодії. При цьому мембранотропні властивості малих (2-13 амінокислотних залишків) регуляторних пептидів не мають прямої залежності від довжини молекули.
Мембраноактивні регуляторні пептиди, подібно антибактеріальним пептидам, характеризуються зниженним вмістом гідрофільних амінокислот, за виключенням Gly, Arg та Gln і підвищенням сумарного вмісту гідрофобних амінокислот. Спектри гідрофобних амінокислотних залишків в РП і в антибактеріальних пептидах характеризуються протилежними тенденціями за вмістом більшості залишків. В регуляторних пептидах, на відміну від антибактеріальних, збільшений вміст залишків, що перешкоджають формуванню б-спіралей. Ці відмінності можуть лежати в основі мембраноселективності і різної дії двох класів пептидів.
Різна гідрофобність енкефалінів, обумовлена єдиним С-кінцевим амінокислотним залишком, веде до різного прояву їх мембранотропної активності (Лей-енкефалін діє переважно в поверхневій зоні мембрани, тоді як молекули Мет-енкефаліну інкорпоруються в її матрикс), що може лежати в основі біологічного механізму вибору підтипу опіатного рецептора.
Пептид-ліпідна взаємодія модулюється вмістом оптичних ізомерів амінокислот в їх молекулах. Встановлена достовірна різниця в пептид-мембранних взаємодіях між різними ізомерними формами дипептиду кіоторфіну і пряма залежність між активністю їх взаємодії з фосфоліпідним матриксом в ряду L-Tyr-L-Arg > D-Tyr-L-Arg ? L-Tyr-D-Arg > D-Tyr-D-Arg і анальгетичною активністю цих форм.
Суфан (дикалієва сіль N-сукциніл-триптофану) проявляє мембранотропну активність по відношенню до ліпідних моношарових мембран. L-форма суфану є більш активною у порівнянні з D,L-формою. Провідна роль у виявленні мембранотропних властивостей суфану належить фосфоліпідам. Білки і холестерол знижують інтенсивність інкорпорації суфану, в першу чергу, D,L-форми, що співпадає з результатами клінічних досліджень.
Пептид-мембранні взаємодії різноспрямовано модулюються іонним складом і іонною силою субфази. В ряді Са2 > Mg2 > K відбувається пригнічення взаємодії Лей-енкефаліну з полярною зоною фосфоліпідних мембран і активація взаємодії Мет-енкефалінів, що може бути обумовлено різною гідрофобністю двох енкефалінів. Підвищення іонної сили субфази до фізіологічних значень активує пептид-мембранну взаємодію і інкорпорацію меланостину в матрикс фосфоліпідної мембрани.
Гідрофільна гамма-аміномасляна кислота не здатна самостійно проникати в матрикс мембрани, але інтенсивно адсорбується в зоні полярних ліпідних головок. Максимальний ефект спостерігається при дії мікромолярних концентрацій ГАМК. Роль взаємодії ГАМК із ліпідним матриксом обмежується концентруванням препарату на поверхні мембрани, що є важливою умовою ефективної подальшої ліганд-рецепторної взаємодії.
Досліджені мембранотропні властивості ксенобіотиків 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д) і N-оксид 2,6-диметилпіридину (івіну). Взаємодія івіну з фосфоліпідними мембранами характеризується швидким проникненням його в гідрофобний матрикс мембрани, тоді як 2,4-Д переважно взаємодіє з полярними групами ліпідів мембран, що пояснюється її аніонними властивостями. Двофазність процесів їх взаємодії з ліпідним матриксом реалізується в параболічній концентраційній залежності їх безрецепторного впливу на Mg2 ,Ca2 -АТФАЗНУ активність плазматичних мембран клітин печінки щура.
Встановлена висока мембранотропна активність і охарактеризовані її параметри для ряду фітопрепаратів з радіо- і гепатопротективною дією. Показана залежність змін мембранотропної активності від особливостей отримання фітопрепарату, що може бути застосовано при подальшому пошуку природних мембраностабілізаторів.
Запропоновано схему механізму реалізації ефектів пептидних і інших біорегуляторів за участю ліпідного матриксу мембрани. На першому етапі біорегулятори адсорбуються на мембрані за рахунок електростатичних звязків. Наступним етапом є інкорпорація молекули біорегулятора в гідрофобну зону ліпідного матриксу. Набуваючи єдиної конфігурації в гідрофобному оточенні, молекули біорегуляторів ефективно взаємодіють з мембранними рецепторами, утворюють іон-провідні структури, безпосередньо взаємодіють з мембранними білками (АТФАЗАМИ, G-білками і ін.), можливо є субстратами для утворення внутрімембраних і внутріклітинних месенджерів (наприклад, пептидної природи), локально змінюють фізико-хімічний стан ліпідного матриксу, що приводить до зміни активності мембранних ферментів і переходу мембрани як системи до іншого стаціонарного стану.
Физиология и биохимия пищеварения человека и животных/ В.К.Рыбальченко, Т.В. Береговая, М.Ю.Клевец, Е.А.Кондратюк, Г.В.Островская, Т.В.Рыбальченко, А.Я.Скляров; Под ред.В.К.Рыбальченко. - К.: Фитосоциоцентр, 2002. - 366 с.
Рыбальченко В.К., Островская Г.В., Рыбальченко В.К. Активная роль липидного матрикса плазматических мембран в реализации эффектов регуляторных пептидов //Тканевые регуляторные пептиды. Теоретические аспекты и перспективы практического применения/ Веснина Л.Э., Гаркович А.Л., Грицай Н.Н. и др.: Под общ.ред. И.П.Кайдашева, В.П.Мищенко, В.К. Рыбальченко. - К.: “Здоровя”, 2003. - С.309-330.
Могилевич Б.Р., Рыбальченко В.К, Островская Г.В. Теоретический подход к определению мембранотропной активности регуляторных пептидов//Биофизика.- 1995. - Т.40, №1. -С.95-97.
Островська Г.В., Яблонська С.В., Філінська О.М., Рибальченко Т.В., Бабіч Л.В. Гепатотоксичні ефекти тривалого інтрагастрального введення щурам 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти й регулятора росту рослин івіну//Вісн.Київськ.ун-ту.Пробл.регул.фізіол.ф-цій. - 2004. -Вип.9. - С.56-57.
Нова методика добору співвідношення компонентів фітозборів на основі їх мембранотропних властивостей Реєстр. № 249/19/03 /Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К., Рибальченко Т.В./Реєстр галузевих нововведень МОЗ України. -К., 2003. -Вип.18-19. -С.174-1 75.
Рибальченко В.К., Островська Г.В., Могилевич Б.Р., Демченко І.Б. Використання модельних мембран у дослідженнях ефектів біологічно активних речовин//II наук.-практ.конф.з народ. та нетрад. мед. - К., 1996. - С.55-56.
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Мельник Ю.М. Вплив іонів металів і іонної сили електроліту на мембранотропні властивості мет- і лей-енкефалінів //VII Укр.біохім. зїзд. К., 1997.- Ч.1. - С.48.
Рибальченко В.К., Островська Г.В., Могилевич Б.Р., Ковальчук Т.О., Рибальченко Т.В., Порало І.В., Цівінська С.М., Бичко А.В. Інформаційні аспекти взаємодії регуляторних пептидів з мембранами// IV Міжнар.конф. “Інформотерапія:теор.асп. і практ.застосув.” К., 1998 / Інформ.та негентр.мед. - 1998. - Вип.1. - С.28.
Островська Г.В., Порало І.В., Ковальчук Т.О., Ніженковська І.В., Рибальченко В.К. Первинні механізми взаємодії кардіотонічного препарату суфану з мембранами // V Міжнар.конф. “Інформотерапія: теор.асп. і практ.застосув.” К., 1999 / Інформ.та негентр. мед. - 1999. - Вип.1. - С.74-75.
Рибальченко В.К., Островська Г.В., Рибальченко Т.В. Роль липидов в рецепции химических информационных сигналов // V Міжнар.конф.“Інформотерапія: теор. асп. і практ.застосув.” К., 1999 / Інформ.та негентр.мед. - 1999. - Вип.1. - С.78-79
Порало И.В., Островская Г.В., Рыбальченко В.К. Мембранотропные эффекты негликозидного кардиотонического препарата суфан// Всерос.науч.конф. с муждунар. участием, посв.150-летия со дня рожд. И.П. Павлова. - С.-Пб., 1999. - С.245.
Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К., Поканевич В.В. Вивчення механізму дії засобів рослинного походження щодо корекції функціонального стану гепатобіліарної та гастродуоденальної системи//V зїзд фармац.України. - Харків, 1999. - С.113.
Гарник Т.П., Островська Г.В., Рибальченко В.К., Поканевич В.В. Гепатопротекторна дія препаратів ехінацеї пурпурової (Echinacea purpurea) у відновно-реабілітаційній терапії хворих різних вікових груп //ІІІ Нац.Конгр. геронтологів і геріатрів Укр.- К., 2000. - С.31.
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Боровикова Г.С., Пономаренко С.П., Рибальченко Т.В. Взаємодія регулятора росту рослин Івіну з модельними фосфоліпідними мембранами// І зїзд токсикологів України. -К., 2001. - С.62.
Островська Г.В., Решетнік Є.М, Долгова О.М., Рибальченко Т.В Фізіологічна і мембранотропна активність природних енкефалінів і пептиду љ-77 - їх синтетичного аналогу// ІІІ зїзд Укр.біофіз.т-ва. - Львів, 2002. - С.80.
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Яблонська С.В., Філінська О.M. Дослідження механізмів сумісної дії гербіциду 2,4-Д і регулятора росту рослин івіну //ІІІ зїзд Укр.біофіз.т-ва. - Львів, 2002. - С.118.
Островская Г.В., Бычко А.В., Карпезо Н.О., Мацюх О.С., Рыбальченко В.К., Сютикова О.В. Взаимодействие ивина с липидными мембранами и базисные механизмы реализации биологической активности препарата// ІХ Міжнар.конф. “Інформотерапія: теор.асп.і практ.застосув.” К., 2003 / Інф.та негентр. мед. - 2003. - Вип.1. - С.81-82.
Яблонська С., Островська Г., Рибальченко Т., Філінська О. Порівняльний аналіз впливу гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти на дві форми Mg2 , Ca2 -АТФАЗНОЇ активності плазматичної мембрани гепатоцитів щурів// Міжнар. Наук-практ.конф. студ., асп. та молод. вчених “Шевченківська весна”, присв.190-річчю з дня народж.Т.Шевченка та 170-річчю заснування Київського ун-ту. - Київ, 2004. Вип.ІІ. . - С. 39-40.
Яблонська С., Островська Г., Рибальченко Т., Зеленюк В., Філінська О. Вплив неорганічних іонів на взаємодію енкефалінів з ліпідними мембранами// Міжнар. Наук-практ.конф. студ., асп. та молод. вчених “Шевченківська весна”, присв.190-річчю з дня народж.Т.Шевченка та 170-річчю ЗАСНУВАННЯКИЇВСЬКОГО ун-ту. - Київ, 2004. Вип.ІІ.- С. 42-43.
Островська Г.В., Рибальченко В.К., Рибальченко Т.В. Особливості взаємодії пентагастрину з ліпідним матриксом мембран // Міжнар.наук.конференція “Клітинні і субклітинні механізми функціонування травної системи”, приуроч. до 80-ліття з дня народж. проф. І.В.Шостаковської. - Львів, 2004. - С.57-58.
Яблонська С.В., Островська Г.В., Рибальченко Т.В., Зеленюк В.О., Філінська О.М., Рибальченко В.К. Порівняння ефектів гербіциду 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти та регулятора росту рослин івіну на дві форми Mg2 , Ca2 -АТФАЗНОЇ активності плазматичних мембран гепатоцитів щурів//ІІ зїзд токсикологів Укр. - К., 2004. - С.72-73.