Патоморфологічні особливості високодиференційованого плоскоклітинного раку легень - Диссертация

В Україні в структурі контингенту хворих, які перебували на обліку в кінці 2014 року, найбільшу питому вагу склали хворі саме на злоякісні пухлини легені (7,5% - у чоловіків і 1,4% - у жінок) та зареєстровано більше 16 тис. випадків. Такими статистичними показниками можна пояснити той факт, що в Європі, де висока питома вага людей старше 65 років (14%), захворюваність і смертність на рак легені набагато вище, ніж в Африці, де люди віком від 65 років становлять лише 3% населення [251]. Летальність від раку легені займає перше місце в структурі смертності від злоякісних пухлину у чоловіків. Необхідно зазначити, щорічно у світі від раку легені помирає 1,2 млн. чоловік (18% всіх смертей від раку та 2,2% загальної смертності) [251]. Дана проблеми має важливе значення у звязку зі збільшенням частоти захворюваності раком легені у віці 20-45 років.Дослідження проведено з дотриманням основних біоетичних положень Конвенції Ради Європи про права людини та біомедицину (від 04.04.1997 р.), Гельсінської декларації Всесвітньої медичної асоціації про етичні принципи проведення наукових медичних досліджень за участю людини (1964-2008 рр.), а також наказу МОЗ України № 690 від 23.09.2009 р. Вивчення патогістологічних особливостей плоскоклітинного раку легені з ороговінням проводилось на основі аналізу матеріалу, який був отриманий після діагностичних біопсій з морфологічно підтвердженим діагнозом та оперативних втручань (лобектомія або пульмонектомія) у Полтавському обласному онкологічному диспансері, торакальному відділенні Полтавської обласної клінічної лікарні ім. Морфологічні дослідження виконувались на біопсіному та післяопераційному матеріалі хворих на плоскоклітинний рак легені з ороговінням. Патоморфологічні дослідження проводили на препаратах 58 хворих з високодиференційованим плоскоклітинним раком легені, з яких гістологічний матеріал отриманий шляхом біопсії склав 4 випадки та основну досліджувану групу сформували 54 випадки операційного матеріалу після пульмонектомії, лобектомії та резекції сегменту. Оцінка прогнозу ВПРЛ визначалась з урахуванням метастазування, гістологічних, гістохімічних, імуногістохімічних даних відповідно до стадій захворювання: ІА стадія - 9 (16,7%) випадків, ІВ стадія - 12 (22,2%) випадків, ІІА стадія - 17 (31,5%) випадків, ІІВ стадія - 9 (16,7%) випадків, ІІІА стадія - 7 (12,9%) випадків, ІІІВ та IV стадія - жодного випадку.Високодиференційований плоскоклітинний рак легень за період з 2007 по 2015 роки спостерігався у 58 хвори, з яких у 4 випадках був гістологічно підтверджений після діагностичної бронхоскопії з використанням щипцевої біопсії, у 54 хворих діагноз підтверджений на післяопераційному матеріалі. До першої групи увійшли 39 (72,2%) випадків в яких пухлина локалізувалась поблизу головного, часткового, сегментарного бронху та визначались, як центральний рак легені. Медіастинальна (вузлувато-розгалуджена) форма росту високодиференційованого плоскоклітинного раку легені, спостерігалась у 2 (5,1%) хворих з ІІІА стадією захворювання, в кожному з яких пухлина була звязана з верхньочастковим бронхом лівої легені. Другу групу досліджень складало 15 (27,8%) випадків, в яких пухлина не була чітко звязана з сегментарними бронхами та локалізувалась на периферії переважно верхньої частки правої та лівої легень - 14 хворих (93,3% від кількості випадків другої групи) та у 1 чоловіка (6,7%) локалізувався в нижній частці правої легені. В 6 випадках (40%) пухлина не мала чітких меж за рахунок наявності запального інфільтрату навколишньої легеневої тканини, що проявлялось наявністю на поверхні розрізу жовтувато-зеленого ексудату.Високий мітотичного індексу при плоскоклітинному раку легені з ороговінням можна пояснити збільшенням кількості клітин, які вступили в фазу поділу. При даному гістогенетичному типі раку патологічні мітози частіше зустрічались в метафазу та характеризувались такими формами патології, як К-мітози, відставання хромосом та їх фрагментів, моноцентричний мітоз, порожниста метафаза, трьохгрупова метафаза та багатополюсний мітоз (табл. При проведенні досліджень мітотичного режиму не було виявлено специфічних ознак та характерних форм патологічних мітозів у ракових комплексах з різними гістохімічними типами «ракових перлин», тому проліферативна активність ПРЛ з ороговінням та його наслідки, такі як апоптоз, потребує підтвердження імуногістохімічними методами дослідження. Визначено, що основний ядерний клас клітин складає LGV ядер 2,6; додатковий ядерний клас клітин складає LGV ядер 2,8. У звязку з поступовим сплощенням та видовженням ядер клітин, що формують «ракові перлини», внаслідок їх диференціювання, не можливо провести каріометричні дослідження з визначенням LGV ядер безпосередньо в зоні «ракових перлин».Цей показник перевищує дані захворюваності по Україні та по Полтавській області, оскільки в узагальнених даних [14; 143] не враховується гістогенетичний тип пухлини, досліджуючи групу НДКРЛ або плоскоклітинного раку не визначаючи ступінь його диференціювання. Проведеними досл

За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 11 друкованих праць: 6 статей у фахових наукових виданнях, рекомендованих ВАК України (2 - без співавторів), 2 статті у закордонних виданнях, 2 тез в матеріалах науково-практичних конференцій, 1 інформаційний лист про наукову (науково-технічну) продукцію.

Структура та обсяг дисертації.

Дисертаційна робота викладена державною мовою на 162 сторінках компютерного тексту, складається з вступу, огляду літератури, матеріалу та методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, аналізу і узагальнення отриманих результатів, висновків, практичних рекомендацій, списку використаних джерел. Список літератури містить 256 бібліографічних джерел (105 - кирилицею та 151 - латиницею), обсягом 28 сторінок. Розділи дисертації ілюстровані 5 таблицями та 44 рисунками (1 схема, 6 діаграм і 37 фотографій мікропрепаратів, які займають 22 повні сторінки).

1.Епідеміологія та клініко-морфологічна характеристика плоскоклітинного раку легені з ороговінням

Рак легені тривалий час залишається актуальною проблемою сучасної онкології [50]. В більшості розвинутих країнах світу рак легені є найбільш поширеною формою пухлини у чоловіків і залишається однією з найважливіших медико-соціальних та екологічних проблем [110; 230].

За темпами росту захворюваності і смертності рак легені займає провідне місце серед злоякісних пухлин, в основному завдяки плоскоклітинному типу раку [5; 60; 150; 251].

Найвищий рівень захворюваності на рак легені відмічається у Північній Америці, Східній Європі, Росії, найнижчий - в Африці, Центральній Азії. Зниження захворюваності на рак легені спостерігається в Канаді, США, Англії, Данії, Австралії [55; 143]. Міське населення хворіє на рак легені частіше за сільське [103].

Загальновизнано, що основним етіологічним фактором виникнення раку легені залишається тютюнопаління, яке є причиною розвитку цього захворювання у 80% хворих на рак легені чоловіків та 50% жінок. Також, підтверджена роль пасивного тютюнопаління, куріння трубки та кальяну, і, за останніми свідченнями, диму від приготування їжі [32; 79; 231; 248]. Ризик розвитку раку легені поступово знижується вже через 5 років після припинення паління, і через 15 років він наближується до ризику для некурців. За умови, що людина курила менше 20 років, знижується і ризик смерті від раку легені [134; 151; 153].

Крім того, важливу етіологічну роль у виникненні раку легені мають різні екзогенні (тяжкі метали, радіація, папіломавірусна інфекція) та ендогенні (спадковість, харчування, ожиріння, хронічні захворювання дихальних шляхів) фактори [26, 30; 61; 101; 114; 140; 171]. Отже, карцинома легені повязана із впливом антропогенного забруднення, яке пояснює відносну стабільність захворюваності, а в деяких країнах - тенденцію до її зростання [27; 80; 90; 99; 207].

Дослідження захворюваності раком легені за статевою приналежністю виявило, що частіше хворіють чоловіки. Співвідношення чоловіків та жінок коливається від 5:1 до 10:1 [143; 251]. Найвища захворюваність і смертність людей з раком легені припадає на вікову групу від 40 до 69 років.

Гістологічна класифікація раку легень постійно змінюється, що залежить від удосконалення методів його дослідження, та виявлення нових аспектів діагностики, перебігу, лікування та прогнозу. Згідно міжнародної гістологічної класифікації новоутворень (2004), в залежності від гістологічної структури, імуногістохімічних властивостей, чутливості до хіміотерапії та прогнозу у відношенні виживання, розрізняли дрібноклітинний та недрібноклітинний рак легені. В численних дослідженнях останніх років проводилось вивчення РЛ відповідно до класифікації 2004 року, яка включала ПРЛ в групу НДКРЛ. Відповідно до останньої класифікації (2015 WHO Classification of Lung Tumors) плоскоклітинний рак легені був винесений в окрему групу злоякісних епітеліальних пухлин, що ґрунтується на сучасних імуногістохімічних дослідженнях плоскоклітинної диференціації.

Недрібноклітинний рак легені зустрічається в 75-80% випадків, а плоскоклітинний його варіант складає 40-50% всіх випадків бронхогенного раку [4; 241]. Жінки хворіють на плоскоклітинний рак легені рідше за чоловіків (38% і 51%) [205; 255], проте ПРЛ у них зустрічається у більш молодому віці. Пацієнтки на РЛ мають кращий прогноз у відношенні виживання, ніж чоловіки [218].

Пацієнти молодого віку, хворі на недрібноклітинний рак легені, складають 9,9%. Переважним гістологічним типом у всіх вікових групах є плоскоклітинний рак легені. Пятирічне виживання молодих хворих після радикального хірургічного лікування з приводу ПРЛ III стадії нижче по відношенню до літніх, але при I та II стадіях захворювання рівень виживання ідентичний в усіх вікових групах [9].

Пятирічне виживання пацієнтів з раком легені залишається низьким навіть в країнах з високим рівнем медичної допомоги. Цей показник складає 14-15%, а при середньому рівні охорони здоровя 5 років після лікування проживають лище 5-7% хворих на рак легені. Це відбувається внаслідок клінічно нерозпізнаних мікрометастазів [215; 231; 235].

Згідно сучасних уявлень, канцерогенез являє собою багатостадійний процес та проходить в кілька етапів [26; 83; 98]. Розвитку плоскоклітинного раку легені центральної локалізації передують гіперплазія, дисплазія і метаплазія епітеліальних клітин трахеобронхіального дерева, які за своєю суттю є передраковими станами [87] та характеризуються комплексом тканинних змін зі схильністю до малігнізації більше ніж нормальна тканина [22].

Тривалий вплив канцерогенних факторів призводить до порушення проліферації базальних клітин та клітинного диференціювання, що викликає плоскоклітинну метаплазію [24]. В подальшому розвивається дисплазія бронхіального епітелію. Дисплазія та carcinoma in situ в інтактних бронхах хворих на рак легені виявляють в 2-3 рази частіше ніж у людей з непухлинними захворюваннями легені [65].

У 60-70% випадків плоскоклітинний рак знаходиться поблизу кореня легені у вигляді ендобронхіальних уражень, тобто характеризується ендофітним ростом. При екзофітному рості пухлини спостерігається обтурація просвіту бронхів, що спричиняє сегментарний та лобарний колапс. Карцинома цієї локалізації росте повільно та дає пізні метастази [68].

При плоскоклітинному раку легені, що характеризується переважно інвазивним ростом, спостерігається відносно швидке прогресування та раннє метастазування [70]. Тканина первинної пухлини центральної локалізації у 82% випадків підлягає некрозу центральних ділянок з утворенням порожнин, які можуть сполучатися з бронхом і дренуватися, формуючи ракові каверни різних розмірів [155].

Морфогенез периферійного раку легені вивчений в меншій мірі, ніж при центральній його локалізації. Виявлено, що периферійний рак в більшості випадків розвивається у вогнищах пневмосклерозу після перенесеного туберкульозу, пневмоній, інфаркту легені, навколо сторонніх тіл, особливо у чоловіків старше 40 років [77]. Вважається, що при наявності туберкульозних змін в легенях частота розвитку бронхогенного раку у хворих вище в порівнянні з особами, у яких відсутні такі патологічні зміни в органах дихання [82; 88; 220]. Загальновизнаним є той факт, що крім туберкульозу, хронічні запальні процеси в легенях, які завершуються розвитком рубця, стимулюють метаплазію епітелію бронхів або є облігатними передраковими захворюваннями, готуючи основу для розвитку злоякісного новоутворення [73; 88]. Роль рубця в злоякісній трансформації клітин може бути повязана з впливом канцерогенних факторів, гіпоксією, імунодепресією, порушенням міжклітинних регуляторних звязків [52; 54]. В наш час встановлено, що в процесі канцерогенезу змінюються антигенні властивості епітелію, його мітотичний режим, стан місцевого імунного гомеостазу та мікроциркуляторне русло навколо пухлинних клітин [65].

В залежності від ступеня диференціювання, згідно класифікації ВООЗ (2015), розрізняють плоскоклітинний рак з ороговінням та плоскоклітинний рак без ороговіння, що розглядаються як високодиференційований та низькодиференційований ПРЛ. Крім того, окремо виділяють базалоїдну плоскоклітинну карциному та плоскоклітинну карциному in situ [241].

До високодиференційованого плоскоклітинного раку легені відносять новоутворення, що гістологічно характеризується наявністю поліморфних клітин, які мають виражені ознаки продукції кератину. Зустрічаються клітини овальної, полігональної, стрічкоподібної, булавоподібної форм, нерідко розташовані паралельними шарами (стратифікація). Це крупні пухлинні клітини з великими гіперхромними ядрами, що містять ніжний, дифузно розташований по ядру еухроматин, серед якого зустрічаються різного розміру глибки гетерохроматину. Ядра деяких клітин мають в різних ділянках виражені ознаки альтерації структур ядерного хроматину, каріопікнозу, вогнища просвітлення та каріолізису. Цитоплазма пухлинних клітин, що містить кератин, характеризується вираженою базофілією, а в окремих ділянках стає дуже щільною, склоподібною, за тоном і насиченістю забарвлення іноді зливається з ядром, має чіткі контури, в нативних препаратах не прозора. Інтенсивність забарвлення прямо пропорційна ступеню кератинізації цитоплазми [46].

Внаслідок альтеративних та дистрофічних процесів, що протікають паралельно з накопиченням в клітині кератинових мас, є поява безядерних клітин - «рогових лусочок». Для плоскоклітинного раку з ороговінням характерно формування із кератинізованих клітин плоского епітелію ракових (рогових) «перлин». Ракові комплекси можуть містити дві-три «ракові перлини» різного розміру, форми та різної інтенсивності забарвлення, що ймовірно, залежить від ступеня накопичення кератогіаліну.

Супутня клітинна реакція - одина з характерних ознак високодиференційованих форм плоскоклітинного раку. Найбільш часто має місце нейтрофільна і змішана нейтрофільно-макрофагальна реакція, рідше зустрічаються лімфоцитарні, плазмоцитарні, гістіоцитарні, еозинофільні клітинні інфільтрати [45].

1.1 Ультраструктурні та морфологічні зміни неопластичної клітини

Диференціювання - це набуття клітиною спеціалізованих функцій в результаті прогресуючого ускладнення її структурноі організації. Біологічна суть пухлинного росту полягає в порушенні даного процесу, що характеризується морфологічним та функціональним атипізмом. Важливим показником ступеня диференціювання неопластичних клітин є їх ультраструктурна організація.

Плоскоклітинна диференціація клітин характеризується наявністю трьох ультраструктурних ознак: зерен кератогіаліну, тонофіламентів та десмосомальних контактів. За ультраструктурними ознаками при плоскоклітинних карциномах розрізняють високодиференційовані неопластичні клітини, які мають всі три ознаки; помірнодиференційовані - мають дві ознаки та низькодиференційовані - наявна лише одна ознака або вони відсутні [36; 70; 78; 87; 104].

Плоскоклітинний рак легені з ороговінням відносяться до високодиференційованих пухлин [241], тобто характеризується наявністю трьох ультраструктурних ознак плоскоклітинної диференціації. Основною гістологічною ознакою плоскоклітинного раку легені з ороговінням є ступінь вираженості в пухлині структурних і клітинних ознак плоскоклітинного диференціювання - наявності кератогіаліну.

Як відомо, процеси кератинізації відбуваються у декілька етапів [56; 119; 135]. На першому етапі кератинізації в цитоплазмі епітеліоцитів утворюються тонофібрили діаметром 3-5 нм, які структурно повязані з рибосомами.

На другому етапі кератинізації в цитоплазмі клітин утворюються пучки тонофіламентів діаметром 7-8 нм, утворюючи в цитоплазмі два шари. Перший шар розташований біля ядра, а другий - на периферії цитоплазми поряд з десмосомами, що забезпечує амортизаційну функцію клітини.

Третій етап кератинізації характеризується утворенням особливих ультраструктур - кератиносом діаметром 100-400 нм. Із кератиносом вивільняються кератогіалінові маси, які формують кератино-тонофіламентозні комплекси з пучками тонофібрил.

На четвертому етапі відбувається накопичення в цитоплазмі клітини кератинових мас з подальшим каріопікнозом та каріолізисом та, в результаті, утворення безядерних клітин - рогових лусочок. В деяких з них частково зберігаються пікнотичні ядра та поодинокі мітохондрії, що свідчить про незавершений процес ортокератозу.

В основі порушення процесів ороговіння лежить зміна регуляції клітинного циклу та морфологічних реакцій клітин, послаблення індукції в них апоптозу та блокування диференціювання, що виникає внаслідок генетичної мінливості та клональної селекції в ході пухлинної прогресії [69; 157, 163, 181].

До найпоширеніших патоморфологічних змін епітеліальних клітин, які виникають внаслідок порушення утворення кератогіаліну відносяться гіперкератоз, паракератоз та дискератоз.

Гіперкератоз - надмірне утворення кератину, що виникає внаслідок порушення проліферації або затримки відторгнення рогових клітин. В основі проліферативного гіперкератозу лежить інтенсивний синтез кератину при підвищеній функціональній активності клітин, а в основі ретенційного - підвищенння вмісту в кератиноцитах мукополісахаридів, що перешкоджають розєднанню рогових клітин.

Дискератоз - це порушення фізіологічного процесу ороговіння клітин в основі якого лежить порушення комплексу тонофіламенти-десмосоми з руйнуванням десмосомальних контактів та відривом від них тонофіламентів.

Паракератоз - порушення процесу ороговіння, що повязане з втратою здатності клітин синтезувати кератогіалін у звязку з невідповідністю між проліферативною активністю і диференціюванням клітин внаслідок порушенням тканинного гомеостазу.

Загальновизнано, що новоутворення виникають в результаті необмеженої проліферації клітинного клону та порушення процесів диференціювання. Довгий час плоскоклітинний рак вважався найбільш проліферуючою пухлиною, час подвоєння обєму якої в середньому складав від 30 до 79 діб [154]. Висока проліферативна активність клітин при неопластичних процесах супроводжується частими патологічними мітозами (30-46%) [6; 18; 34; 71], які виникають внаслідок нестабільності регуляторів клітинного циклу - супресорів та протоонкогенів [213].

Патологічний мітоз є одним з основних причин формування хромосомних мутацій і неправильного розподілу спадкового матеріалу між дочірніми ядрами. Нерівномірне розходження генетичного матеріалу - важливий механізм виникнення анеуплоідії і наростання генетичної гетерогенності клітинних популяцій [6; 35, 43; 152].

Патологія мітозу може носити як функціональний, так і органічний характер. Функціональні порушення поділу клітин виникають внаслідок зниження реакції клітин на вплив фізіологічних регуляторів, що гальмують або стимулюють проліферацію нормальних клітин. Гіпореактивність ракових клітин є однією з причин автономного росту пухлин [66].

Органічну основу патології мітозів, що повязані з аномаліями хромосом, мітотичного апарату і порушенням цитотомії, спробували класифікувати Х. Оберлінг і В. Бернхард у 1963 році [63]. Продовжуючи дослідження, Oksala T. і Therman E. [204] встановили, що незалежно від механізмів порушення мітозу в результаті утворюються дочірні клітини із хромосомними абераціями і нерівномірним розподілом генетичного матеріалу. Внаслідок цього формуються дочірні інтерфазні неопластичні клітини з анеуплоїдією та поліплоїдією [42; 250].

За даними Б.Є. Полоцького, при відсутності регіонарних метастазів диплоїдні пухлини менш агресивні в порівнянні з анеуплоїдними аналогами. При недрібноклітинному раку легені виявлено, що анеуплоїдні новоутворення з високим індексом ДНК мають менший час подвоєння пухлини, ніж диплоїдні [62; 48].

Отже, дослідження мітотичного режиму пухлин різної локалізації показують, що переважна більшість ракових клітин характеризується змінами кількості та структури хромосом [16; 113]. Проте, безпосередній причині хромосомних аберацій в сучасній літературі приділяється недостатньо уваги.

Існують різні класифікації патології мітозів [92; 173] та, в наш час, вони мають лише історичне значення. Найбільш повною за набором морфологічних форм патології мітозу та за доцільністю поєднання їх у групи на основі загальних цитохімічних та цитофізіологічних механізмів виникнення є класифікація, запропонована Й.О. Аловим та доповнена І.О. Казанцевою [6; 34]. Згідно цієї класифікації патологічні мітози розподілені на три групи в залежності від морфологічної основи.

Перша група патології мітозів характеризується аномаліями хромосом та включає наступні види: 1) затримка мітозу в профазі; 2) порушення спіралізації та деспіралізації хромосом; 3) ранній розподіл хроматид; 4) фрагментація і пульверизація хромосом; 5) хромосомні та хроматидні мости; 6) відставання хромосом в метакінезі та при розходженні до полюсів; 7) утворення мікроядер; 8) нерозходження хромосом; 9) набухання та злипання хромосом.

Друга група включає патологічні мітози, що виникають внаслідок пошкодження мітотичного апарату: 1) затримка мітозу в метафазі; 2) к-мітоз; 3) розсіювання хромосом в метафазі; 4) багатополюсний мітоз; 5) моноцентричний мітоз; 6) асиметричний мітоз; 7) трьохгрупова метафаза і метафаза з полярними хромосомами; 8) порожниста метафаза.

В третю групу входять патологічні мітози, повязані з аномаліями цитоплазматичної оболонки та характеризуються порушенням нормального перебігу цитотомії: 1) запізнення або відсутність цитотомії (дисоціація між ядерними та цитоплазматичними змінами); 2) передчасна цитотомія.

В залежності від наслідків, всі форми патологічних мітозів умовно розподіляють на три групи: з утворенням поліплоїдних, анеуплоїдних клітин та мітози, які викликають апоптоз [6; 15; 38; 174; 213]. Також, до утворення поліплоїдних клітин в пухлинах можуть призводити такі процеси, як ендоредуплікація, ендомітоз, реституція [34; 204]. Внаслідок патологічних мітозів утворюються поліплоїдні або анеуплоїдні неопластичні клітини, тобто зі збільшенням або зменшенням набору хромосом. Плоїдність хромосомного набору в останніх являє собою важливу прогностичну ознаку, яка обумовлює особливості клінічного перебігу пухлини, а також її чутливість до опромінення та хіміотерапії [3; 2013].

Клітинний та ядерний поліморфізм, що виникає внаслідок патології мітозу, характеризується утворенням макро- і мікроядер, багатоядерних клітин, різним ступенем забарвлення ядер (гіпер- і гіпохромія) внаслідок різної кількості в них ДНК і зміни структури хроматину [7; 209].

Порушення мітотичного режиму може бути раннім діагностичним критерієм малігнізації вже на стадії дисплазії і преінвазивної карциноми, що характеризуються осередковою атипією епітелію. Поява ацентричних фрагментів в ана- і телофазі, мости, фрагментація і розсіювання хромосом, трьохгрупові метафази, багатополюсні і моноцентричні мітози є обєктивним критерієм малігнізації епітелію. Переважання К-метафаз зі злипаннням хромосом свідчить про вплив на клітини токсичних речовин та не характерно для передракової клітинної проліферації [28; 34].

Також відомо, що деякі патологічні мітози, які виникають внаслідок ушкодження хромосом і цитоплазми, спричиняють гибель клітин і їх елімінацію із проліферативного пулу. Тому, спектр мітотичної активності може бути одним із обєктивних діагностичних критеріїв проведення хіміотерапії чи променевого лікування [10; 167].

Сучані дослідження мітотичної активності ракових клітин не дають повної відповіді про гістогенез та органогенез пухлин [75; 170]. Можливості використання показників мітотичного режиму для уточнення гістогенезу пухлин обмежуються поступовим збільшенням мітотичної активності від дисплазії до інвазивної карциноми.

Мітотичний режим злоякісних пухлин і передракових процесів характеризується затримкою поділу в метафазі, значним збільшенням числа патологічних мітозів і поступовим збільшенням мітотичної активності, що типово для процесу малігнізації [105; 108].

Якщо припустити, що різні неопластичні процеси відрізняються характерними змінами мітотичного режиму і виникненням характерних для них форм патології мітозу, то за особливостями мітотичного режиму метастазів можна буде розглядата їх гістогенез [6; 34; 102].

В останні роки стало очевидним, що виникнення і прогресія пухлини багато в чому повязані зі структурними особливостями клітинного геному і його мутаціями [12; 28]. Проте, дотепер залишається незрозумілим значення патологічних мітозів у процесі канцерогенезу. Хоча відомо, що патологічні мітози створюють основу для добору клітин, які мають здатність до автономного росту внаслідок генетичної гетерогенності клітин [19].

Таким чином, хоча уявлення про причинну залежність між канцерогенезом та патологічними мітозами не має прямих доказів, а непрямі дані тільки підбадьорюючі, все ж ця гіпотеза може мати місце і заслуговує подальших пошуків та розробок.

Згідно нечисельних літературних даних, високодиференційований плоскоклітинний рак легені характеризується низьким мітотичним індексом в межах 9% та переважанням патологічних мітозів у вигляді набухання та злипання хромосом в профазі, затримкою в метафазі із розсіюванням хромосом та ендомітозом з утворенням багатоядерних клітин [76]. Проте, не визначено звязку між патологічними мітозами, експресією молекулярно-біологічних маркерів регуляції клітинного циклу та апоптозу з морфогенезом плоскоклітинного раку легені з ороговінням.

З моменту першого мікроскопічного опису ракової пухлини, зміни розмірів ядра ракової клітини розглядались, як характерна риса пухлинного росту [2; 89; 112]. Широкого поширення каріометричний метод (вивчення розмірів ядра) набув після відкриття W. Jacobi [158] закону ритмічного росту ядер. Порівнюючи розміри ядер у клітинах різних нормальних органів, він прийшов до висновку, що співвідношення їх обємів укладається в схему 1:2:4:8. Найбільш чисельний клас розмірів ядер він назвав головним ядерним класом, а клас ядер клітин характерний для певного органа - типовим класом.

Нове значення каріометричні дослідження набули після висунутої M.Benningoff теорії функціонального зморщування або набухання ядер у 1,5 рази при посиленні або зниження їх функціональної діяльності [97; 116].

Таким чином, відповідно до встановлених законів каріометрії, в організмі людини є мінімальний ядерний клас, співвідношення якого з іншими каріометричними показниками укладається в пропорцію 1:1,5:2:3:4:6:8 і т.д.

Значного поширення каріометричний метод дослідження набув в онкоморфології. Чисельними дослідженнями виявлено, що кратне збільшення або зменшення обємів ядер зумовлені, відповідно, поліплоїдією або анеуплоїдією неопластичних клітин [3; 6; 34]. Разом з тим, інші дослідження демонструють відсутність ритмічних змін в каріометричних показниках [15; 97].

Сучасні цитогенетичні дослідження свідчать, що в результаті епігенетичних процесів пригнічується або підвищується транскрипція різних генів внаслідок чого, очевидно, відбувається функціональне набухання або зморщування ядер неопластичних клітин [33; 42].

Таким чином, для пухлинного росту характерне збільшення або зменшеншення розмірів ядер неопластичних клітин, що може бути повязане зі збільшенням кількості ДНК або функціональним станом клітин. Каріометричні показники є неспецифічними та повинні оцінюватися з урахуванням усіх властивостей клітини в залежності від фази її циклу.

1.2 Імуногістохімічні дослідження при плоскоклітинному раку легені з ороговінням

Неопластична трансформація - це процесс, що включає безконтрольну клітинну проліферацію, порушення регуляції апоптозу, диференціювання та неефективного функціонування протипухлинного імунітету, внаслідок нагромадження хромосомних аберацій та інших генетичних змін [26; 41; 77].

Отже, дослідження описаних молекулярних властивостей неопластичної клітини за допомогою імуногістохімічного методу дослідження має важливе інформативне значення для обґрунтування морфогенезу та прогнозування перебігу онкозахворювань [53; 72; 198; 199].

Одним з морфологічних показників, що найчастіше визначається в пухлинах, є ступінь диференціювання. Спосіб, що дозволяє уточнити цей аспект - вивчення спектру синтезованих раковою клітиною білків, зокрема цитокератинів, які є складовою цитоскелету [23; 72; 86].

Цитоскелет клітинних елементів складається із проміжних філаментів, мікротрубочок, а також із мікрофіламентів. Цитокератини - білки проміжних філаментів цитоскелету епітеліальних клітин. Клітини різних видів епітелію мають різні молекулярні форми цитокератину. Останні відносно стабільні фібрилярні структури, які реорганізуються під час мітотичного поділу клітини та самовідновлюються після нього [20].

В наш час виявлено 20 типів цитокератинів з молекулярною вагою 40-67 КД - СК1-СК20. Спектр цитокератинів в епітеліальних клітинах залежить від типу диференціювання та положення клітини в епітеліальному пласті. Низькомолекулярні кератини зустрічаються в одношаровому епітелії, високомолекулярні - в багатошаровому плоскому [8; 72]. Ідентифікація кожного типу цитокератину ґрунтується на використанні специфічного моноклонального антитіла та можливе використання комбінованих антитіл - панцитокератин АЕ1/АЕ3 [136].

Враховуючи високу специфічність та чутливість цитокератинів, їх використовують для діагностики, вивчення особливостей морфогенезу та лікувального патоморфозу карцином. Виражена експресія маркерів CK8 і CK19 характерна для плоскоклітиного раку більшості локалізацій, на відміну CK20-імунореактивність при даному гістологічному типі пухлин не спостерігається, що може бути диференціально-діагностичним критерієм [238].

Так, для епітелію легені, як і для пухлин даної локалізації, найбільш характерна експресія високомолекулярних цитокератинів, рідше - низькомолекулярних [117; 130; 136]. Спектр експресії цитокератинів при плоскоклітинних раках залежить від ступеня їх диференціювання. Для низькодиференційованого плоскоклітинного раку легені найбільш специфічним є експресія цитокератину СК5, СК14 і комбіноване забарвлення AE1/AE3. Щонайменше 20% пухлин мають CK7-позитивний імунофенотип, причому спостерігається локальне цитоплазматичне забарвлення клітин. На відміну високодиференційований ПРЛ характеризується вираженим дифузним забарвленням клітин з експресією СК1, CK10 та СК13 [121; 132; 162; 175; 223].

При формуванні тканини важливу роль відіграє міжклітинна адгезія, що забезпечується специфічними трансмембранними молекулами - кадгеринами. Розрізняють декілька типів кадгеринів, найважливішими з яких є епітеліальний (Е-кадгерин), нервовий (N-кадгерин), плацентарний (Р-кадгерин) та ін. [129].

Міцність адгезивних звязків епітеліальних клітин забезпечує Е-кадгерин - представник родини класичних кадгеринів, кальційзалежна адгезивна молекула. Довгі екстрацелюлярні ділянки молекули Е-кадгерину формують на поверхні клітин паралельні димери, які утворюють стійкі звязки за типом блискавки при контакті з Е-кадгеринами сусідніх клітин. Цитоплазматичний домен Е-кадгерину взаємодіє з цитоплазматичними білками: ?-катеніном і ?-катеніном. Ці молекули, взаємодіючи з ?-катеніном, утворюють кадгерин-катеніновий комплекс з актиновим цитоскелетом [201; 206]. Молекули Е-кадгерину, беручи участь в адгезії, визначають архітектоніку та диференціювання кератиноцитів епітелію [8; 72; 106; 224].

Отже, міжклітинні адгезивні звязки відіграють важливу роль у формуванні тканин і є важливим біомаркером, що характеризує розвиток пухлини [120]. Кадгерини - одні з головних медіаторів адгезії клітин. Втрата цих молекул в пухлинній тканині збільшує їх злоякісний потенціал, сприяючи інвазивному росту та метастазуванню [25; 84; 145; 172; 239].

Невисока експресія Е-кадгерину і катехінів в епітеліальних новоутвореннях асоційована з низькою диференціацією пухлини, локальною інвазією, метастазуванням в регіональні лімфовузли та меншою тривалістю життя [129; 229].

Так, для плоскоклітинного раку легені, в залежності від ступеня диференціювання, характерна різного ступеня експресія Е-кадгерину [165; 180]. При низькодиференційованому ПРЛ майже у 72,5% випадків відзначається низький рівень міжклітинної адгезії, що має несприятливий прогноз щодо метастазування та виживання. Також відзначається прямий кореляційний звязок між зниженням експресії ?-катеніну і ступеня диференціювання плоскоклітинної карциноми легені [122; 133; 183; 189; 253; 256]. Згідно сучасних даних, репресія транскрипції Е-кадгерину в ракових клітинах легені може бути двоякою: пряма дія транскрипційного фактору Twist1, що пригнічує експресію гена Е-кадгерину та непрямий вплив на Wnt7a, який є позитивним регулятором адгезії. Таким чином, втрата Wnt7a може бути однією з ланок патогенезу раку легені за рахунок впливу на E-кадгерин. Ці молекулярні механізми сприяють міграції ракових клітин, інвазії та метастазуванню [141; 202].

На відміну, при плоскоклітинному раку легені з ороговінням у 60 % випадків відзначається виражена експресія Е-кадгерину проти 25,9% при низькодиференційованій карциномі [179].

Е-кадгерин та звязані з ним катеніни, ймовірно, беруть участь у регуляції активності протеїнів клітинного циклу, внаслідок чого онкогенна дія мутацій Е-кадгерину впливає на регуляцію клітинного циклу, апоптозу і контроль генетичної стабільності тканин [58; 192; 208].

В основі розвитку ракових пухлин лежить безконтрольна проліферація клітин, яка призводить до збільшення кількості анапластичних елементів. В останні роки широко використовують імуногістохімічні маркери проліферації, найпоширенішими з яких в практичній та науковій діяльності є Кі-67 та cyclin D [31].

Універсальним маркером для оцінки клітинного циклу є білок Кі-67, що виявляється відповідними моноклональними антитілами та представляє собою короткоживучий протеїн, який руйнується впродовж 1,5-2 годин. Кі-67 не встигає накопичуватись і не залишається в клітинах в стані спокою, тому антитіла до нього виявляються в проліферуючих клітинах, які знаходяться в різних фазах мітотичного циклу [100; 226].

Кі-67 представлений двома різними формами з молекулярною масою 320 КД і 359 КД. Кодуючий їх ген локалізується в 10 хромосомі і складається з 15 екзонів. Білок Кі-67 в основному звязаний з хромосомами, виявляється в ділянці теломер, центромер, в ядерцях. В точці G0 клітинного циклу та на початку G1 білок не виявляється. Поява Кі-67 відбувається в кінці фази G1, його рівень поступово зростає впродовж S-фази та досягає максимуму до мітозу [8; 93].

В наш час залишаються питання щодо функції білка Ki-67 в ході клітинного циклу. Проте встановлено, що антиген Ki-67, повязаний з транскрипцією РРНК та пригнічення гену MKI Ki-67 призводять до зупинки синтезу РРНК [123; 219].

Незважаючи на широке використання антигену Ki-67 для діагностики різних патологічних процесів, існують певні труднощі в інтерпретації результатів ІГХ забарвлення з його використанням, в тому числі і при пухлинах легені. Це може бути повязано з використанням різних антитіл до Кі-67 та внутрішньопухлинною гетерогенністю забарвлення клітин, що спостерігається і при ПРЛ. Крім того, рівень гіперекспресії у злоякісних новоутвореннях легенів, за даними різних авторів, є не однозначним показником та може коливатися в межах 18-57,2 % [149; 242], що пояснюється різним підходом до визначення ступеня ІГХ забарвлення. Деякі автори гіперекспресію Ki-67 вважають при забарвленні більше 10% позитивних клітин, інші відзначають гіперекспресію за наявності 20% забарвлених клітин або 35% і вище [149; 184; 242; 249].

Встановлено, що експресія маркеру Ki-67 залежить від гістогенезу пухлини, корелює зі ступенем її диференціювання [94; 107] та є важливим маркером проліферативної активності пухлини, що має важливе прогностичне значення. Ризик рецидиву прямо повязаний з високою експресією фактору проліферації [156; 166].

Згідно літературних даних, у хворих на НДКРЛ спостерігається гірша виживаємість при наявності гіперекспресії Ki-67 [184; 185]. Також відзначається, що у хворих з низьким рівнем експресії Ki-67 більша тривалість життя, ніж у хворих з вираженою експресією маркеру.

Деякими авторами відмічено, що при ПРЛ індекс маркеру Ki-67 є значно вищим у ракових комплексах з вираженою дифузною експресією маркеру CK14 порівняно з комплексами, в яких показники цитокератину фокусні або негативні. Виявлено однакову експресію CK14 в гніздах первинної карциноми та в метастазах в лімфатичні вузли. Ці результати показують, що поряд з Ki-67, CK14 є параметром проліферативної активності та метастатичного потенціалу плоскоклітинного раку легені [243] .

Проліферація клітин та проходження основних ланок клітинного циклу контролюється складною системою сигнальних шляхів, що потребує активації внутрішньоклітинних ферментів - циклін-залежних кіназ (Cdk), для активності яких необхідна присутність активаторної субодиниці - цикліну. Точна регуляція клітинного циклу під час розвитку є критичною для правильної клітинної диференціації [85; 211].

Перехід клітини із точки G0 в G2 характеризується утворенням комплексів cyclin D (D1-D3). Cyclin D1 відповідає за перехід з G1 в S період клітинного циклу. За рахунок ампліфікації гену, розташованого в хромосомі 11q13, спостерігається гіперекспресія cyclin D1, що лежить в основі швидкої проліферації пухлинних клітин через порушення механізмів роботи Cdk в клітинному циклі. Гіперекспресія cyclin D1 виявляється імуногістохімічними методами в більшості ядер пухлинних клітин. Подібні процеси спостерігаються при карциномах легені [109; 144; 194; 217; 225].

Показники експресії cyclin D1 є важливим прогностичним маркером проліферативної активності пухлинної клітини, що значно вище при cyclin D1-позитивних пухлинах ніж у cyclin D1-негативних неоплазіях. Прогностичні показники пятирічного виживання хворих на рак легені з вираженою експресією цикліну D1 краще, у порівнянні з пацієнтими з cyclin D1-негативними пухлинами (89% і 64% відповідно), Отже, гіперекспресія cyclin D1, як правило, це сприятливий прогностичний фактор. Ці дані свідчать про причетність cyclin D1 до розвитку та прогресування недрібноклітинного раку легені, його проліферативну активність і клінічний прогноз у пацієнтів [194; 217]. При ультраструктурно диференційованому плоскоклітинному раку легені не виявлено співвідношення між вираженою експресією cyclin D1 і ступенем диференціювання. Отже, певні молекулярні зміни повязані з деякими субклітинними особливостями [118].

Крім того, згідно сучасних даних, виявлено, що поліморфізм CCND1 (гену cyclin D1) підвищує сприйнятливість до розвитку раку легені у молодих чоловіків певних груп населення та може бути повязаний з тютюнопалінням. Поліморфізм гену CCND1 є предиктором розвитку метастазування, знижуючи прогноз виживання. Проте, ці дані не підтверджені достатньою кількістю досліджень та потребують детального вивчення [127; 125; 216].

Таким чином, літературні джерела показують, що гіперекспресія cyclin D1 не наслідок, а ключовий елемент у процесі злоякісної трансформації в легенях. Усвідомлення цього може відкрити нові можливості діагностики, лікування та профілактики раку легенів [144].

На сучасному етапі існують певні труднощі в оцінці проліферативного потенціалу пухлини, який включає в себе не тільки кількість проліферуючих клітин, але і швидкість проходження клітиною фаз мітозу. Крім того, не має єдиної методики інтерпретації експресії молекулярно-біологічних маркерів клітинного циклу [37].

Важливий інгібітор Cdk у фазах G1 та G2 клітинного циклу представлений геном р53. Основна транскрипційна мішень р53 в системі контролю клітинного циклу - білок р21Wafl. Підвищення експресії р21Wafl/Cipl у відповідь на гіперекспресію р53 і пошкодження ДНК викликає зупинку клітинного циклу в пізній G1 фазі. Р21Wafl/Cipl пригнічує здатність фосфорилювання білків, активність яких необхідна для переходу клітин в S фазу [8; 31].

Однією з головних функцій р53 є зупинка клітинного циклу після пошкодження геному в точці G1/S, що дозволяє клітині відновити цілісність пошкодженої ДНК. Р53 індукує репарацію ДНК до її реплікації та поділу клітини, активуючи регуляторні гени р14, mdm2. Якщо відновити цілісність пошкодженої ДНК не вдається, то р53 запускає в клітині механізм апоптозу [51]. Втрата функції р53 знижує стабільність генів та характеризується порушенням процесів апоптозу, що може призвести до появи додаткових мутацій і, як наслідок, до неопластичної трансформації клітин. Це відбувається в результаті мутації гена р53, тобто утворення його мутантного аналога - mt p53 [8].

Мутація гену р53 часто спостерігається в пухлинах легені, що може бути